袁建暉 范燕燕 胡小青

江西省婦幼保健院腫瘤科，江西南昌 330000

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤，在婦科中較為常見(jiàn)，占婦科惡性腫瘤的7%左右，是發(fā)病率較高的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一[1]。近年來(lái)，隨著女性生存壓力的增加，以及生活、工作等方式的變化，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生率逐年上升，且呈現(xiàn)出一定的年輕化趨勢(shì)，極大威脅到女性的健康和安全[2]。甘草是我國(guó)常見(jiàn)的食藥同源性中藥，在中醫(yī)學(xué)中已被廣泛應(yīng)用，具有補(bǔ)中益氣、清熱解毒、去痰止咳等功效，是治療疾病的良藥[3]。甘草的主要成分為甘草次酸，該成分是一種齊墩果烷型五環(huán)三萜化合物，已被研究證實(shí)有保護(hù)心臟再灌注、抑制炎癥反應(yīng)、抗病毒等功效，在肝癌、胃癌、食管癌等惡性腫瘤中，可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，具有良好的抗癌效果[4]。但是從目前臨床研究來(lái)看，甘草次酸在婦科惡性腫瘤，尤其是生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中應(yīng)用的報(bào)道并不多見(jiàn)，因此其作用及機(jī)制還有待深入探究，對(duì)子宮內(nèi)膜癌的防治有十分重要的指導(dǎo)意義。為此，本研究就甘草的主要成分甘草次酸對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲遷移的影響及機(jī)制展開(kāi)探究，旨在為臨床提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

人子宮內(nèi)膜癌Ishiawa 細(xì)胞，由上海生命科學(xué)院細(xì)胞中心提供。胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基等，購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司。MTT 試劑，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司。流式細(xì)胞儀，購(gòu)自美國(guó)Ambion 公司。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自日本TaKaRa 公司。Transwell 小室，購(gòu)自美國(guó)Corning 公司。

1.2 方法

1.2.1 分組處理 分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組甘草次酸的濃度設(shè)置為：20、40、80、160、320 μmol/L，對(duì)照組為加二甲亞楓（dimethyl sulfoxide，DMSO）終濃度不高于2%的培養(yǎng)基。

1.2.2 藥物配制及細(xì)胞培養(yǎng) 子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞為江西省婦幼保健院實(shí)驗(yàn)室保存的細(xì)胞株。甘草次酸用DMSO 稀釋成50 mmol/L，-20℃分裝保存，使用前解凍，并稀釋為不同的濃度。使用10%胎牛血清的RIMI1640 培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，取處于對(duì)數(shù)位生長(zhǎng)期且臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)定活性在95%以上的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 于96 孔板中接種子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞，于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，各組分別加入不同濃度甘草次酸干預(yù)24、48、72 h 后去液（20、40、80、160、320 μmol/L），空白孔是不含細(xì)胞的RIMI1640 培養(yǎng)液，每孔加入20 μl MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)。4 h 后去液，加入150 μl DMSO，平板離心機(jī)10 min。酶標(biāo)儀上570 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)其OD 值，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 于6 孔板中接種細(xì)胞，不同濃度甘草次酸（80、160、320 μmol/L）干預(yù)24 h 后用胰酶消化細(xì)胞，PBS 洗滌2 次，收集細(xì)胞，加入Binding Buffer 500 μl 懸浮細(xì)胞。然后加入10 μl Annexin V，4℃避光反應(yīng)5 min；之后上流式分析儀檢測(cè)，1、2、3 h 內(nèi)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.5 Transwell 小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲力和遷移的變化用50 mg/L Matrigel 膠1∶8 稀釋包被Transwell 小室膜的上室面，4℃過(guò)夜，使膠面在上室分布均勻，加入血清液，37℃孵育30 min，培養(yǎng)細(xì)胞，調(diào)整濃度為2×105/ml，接種細(xì)胞，將200 μl 細(xì)胞懸液加入上室，下室加入500 μl 含10%小牛血清的培養(yǎng)液，每組設(shè)3 個(gè)平行孔，培養(yǎng)細(xì)胞12～72 h，取出小室，用PBS 洗2～3 遍后酒精固定30 min，將小室風(fēng)干，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞的侵襲力。去除Matrigel 膠，重復(fù)上述步驟，即可計(jì)算細(xì)胞的遷移力。

1.2.6 蛋白印跡法檢測(cè)經(jīng)過(guò)甘草次酸處理過(guò)的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中Caspase-9 的表達(dá)情況 提取經(jīng)過(guò)甘草次酸處理過(guò)1、2、3 h 的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishiawa 蛋白，用移液槍量取1 ml 索來(lái)寶RIPA 緩沖液+10 μl PMSF，反復(fù)抽吸并置于冰上靜置制得所需蛋白。BCA法測(cè)蛋白濃度：配制BCA 工作液，以562 nm 吸光度為標(biāo)準(zhǔn)值，最后計(jì)算蛋白濃度。選擇配制10% 5ml 的分離膠及2 ml 積層膠。制好的“三明治”夾以“黑對(duì)黑、白對(duì)白”電轉(zhuǎn)膜條件為：80 mA 恒流電流105 min冰水水浴中進(jìn)行。封閉、抗體的孵育、eECL 顯影及結(jié)果統(tǒng)計(jì)：一抗的孵育：配制一抗封閉液，4℃冰箱中保存過(guò)夜。將過(guò)夜孵育的一抗放置于水平搖床上，室溫下1 h。二抗的孵育：室溫下水平搖床上孵育1 h。按康為世紀(jì)發(fā)光試劑盒說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)配制發(fā)光液，放置Bio-Rad 于成像儀上，顯示出影像清楚的條帶后拍照，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間行單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，行Pearson 相關(guān)性分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甘草次酸對(duì)Ishiawa 細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

甘草次酸不同濃度組Ishiawa 細(xì)胞72 h 增殖抑制率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），甘草次酸濃度升高時(shí)，Ishiawa 細(xì)胞72 h 增殖抑制率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同濃度兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。

圖1 甘草次酸對(duì)Ishiawa 細(xì)胞增殖的抑制作用

甘草次酸不同濃度組Ishiawa 細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），甘草次酸濃度升高時(shí)，Ishiawa 細(xì)胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同濃度兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

甘草次酸不同濃度組Ishiawa 細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量少于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），甘草次酸濃度升高時(shí)，Ishiawa 細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同濃度兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 甘草次酸對(duì)癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

2.2 甘草次酸對(duì)Ishiawa 細(xì)胞中Caspase-9 表達(dá)的影響

甘草次酸處理后的Ishiawa 細(xì)胞中Caspase-9 表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且甘草次酸處理濃度升高時(shí)，Caspase-9 表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表2 甘草次酸對(duì)Ishiawa 細(xì)胞中Caspase-9 表達(dá)的影響

2.3 Caspase-9 表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡、增殖、侵襲率的相關(guān)性

Pearson 相關(guān)性分析顯示，Caspase-9 表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)，與細(xì)胞增殖率和侵襲率呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

表3 Caspase-9 表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡、增殖、侵襲率的相關(guān)性

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是臨床最為常見(jiàn)的婦科生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，具有非常高的發(fā)生率，隨著惡變程度的加深，會(huì)極大地威脅患者的健康乃至安全，早已引起全社會(huì)的廣泛關(guān)注[5-7]。目前，對(duì)于子宮內(nèi)膜癌的研究，多集中在臨床治療方面，但是有關(guān)其具體分生物學(xué)分子研究并不太多。

在一項(xiàng)關(guān)于肉瘤HOS 和HT1080 細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)，甘草次酸可以通過(guò)阻滯G0/G1細(xì)胞周期而抑制細(xì)胞增殖作用[8]。在肝癌細(xì)胞中，甘草次酸通過(guò)誘導(dǎo)凋亡發(fā)揮作用，通過(guò)激活胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號(hào)通路，增加乳酸脫氫酶的釋放、增加凋亡蛋白Bax 的表達(dá)、促進(jìn)Caspase-3 蛋白的剪切、激活微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅱ（light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）的表達(dá)和自噬小體的形成，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡[9-12]。甘草次酸可以抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[13-14]，有研究通過(guò)下調(diào)侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）MMP-2、MMP-9 和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的產(chǎn)生，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[15]。本研究結(jié)果顯示，甘草次酸會(huì)對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishiawa 細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移侵襲產(chǎn)生影響，且隨著處理濃度的不斷增加，產(chǎn)生的作用和效果更加明顯。Caspase-9 是被證實(shí)的凋亡因子，在許多信號(hào)通路上均有表達(dá)，通過(guò)對(duì)凋亡因子表達(dá)的分析，可以初步探討甘草次酸在癌癥細(xì)胞中的作用機(jī)制[16-17]。同時(shí)甘草次酸針對(duì)在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的研究尚未開(kāi)展，本研究旨在明確甘草的主要成分甘草次酸在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的作用，為子宮內(nèi)膜癌的中藥特色治療提供理論基礎(chǔ)。王銘等[18]研究發(fā)現(xiàn)，衣霉素可抑制活化的HSC 增殖，促進(jìn)其凋亡，并上調(diào)Caspase-9 蛋白的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，甘草次酸處理后的Ishiawa 細(xì)胞中Caspase-9 表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且甘草次酸處理濃度升高時(shí)，Caspase-9 表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且Caspase-9 表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)，與細(xì)胞增殖率和侵襲率呈正相關(guān)（P＜0.05），提示甘草次酸可以調(diào)控Caspase-9 蛋白的表達(dá)，而子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移侵襲作用可能與之有關(guān)。

綜上所述，甘草次酸對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲遷移會(huì)產(chǎn)生影響，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控Caspase-9 的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。