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正交優(yōu)化柴胡地上部分總黃酮提取工藝及抑菌活性研究

2022-11-18 12:16郝彩琴陳海燕冷曉紅
中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥 2022年28期
關(guān)鍵詞:容量瓶柴胡黃酮

郝彩琴 李 軍 陳海燕 冷曉紅

寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院生命科技學(xué)院,寧夏銀川 750002

柴胡為大宗中藥材,收載于2020 版《中華人民共和國(guó)藥典》中的柴胡為傘形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根[1]。柴胡的入藥部位是根,主要含柴胡皂苷類、黃酮類、植物甾醇,以及少量揮發(fā)油、多糖等有效成分,主要的藥理活性為抗炎抗菌、抗病毒、解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、增強(qiáng)免疫力、保肝利膽及抗腫瘤等[2]。柴胡地上部分也含有黃酮類、少量皂苷類、木脂素類、香豆素類等成分[3-4],有研究表明,柴胡地上部分的主要成分是黃酮類化合物,且含量高于地下部分[5-7]。黃酮類化合物是中藥的有效成分之一,其具有抑菌、抗氧化、抗衰老、提高免疫力、抗腫瘤、降糖等多種生物活性[8-11]。柴胡藥材在寧夏六盤山地區(qū)已基本形成規(guī)?;N植,柴胡地上部分是中藥材柴胡的非藥用部位,占柴胡整個(gè)植物干重的70%~85%,目前大部分被當(dāng)成廢料而丟棄從而造成極其嚴(yán)重的資源浪費(fèi)[12]。因此,本研究采用4 因素3 水平的正交實(shí)驗(yàn)對(duì)寧夏栽培柴胡地上部分總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化并對(duì)其抑菌活性進(jìn)行研究,為充分利用資源、擴(kuò)大藥用部位提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

TYS-400A 型粉碎機(jī)(浙江省永康市紅太陽機(jī)電有限公司);RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠),SIB-Ⅲ型循環(huán)式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);TU-1810 型紫外可見分光光度計(jì)(北京普析公司);EL204 型萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器);DHG-9123A 型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司);SHY-2A 型水浴恒溫振蕩器(常州國(guó)宇制造);YJ-875 型超凈工作臺(tái)(蘇州安泰);YXQLS-50S 型立式壓力蒸汽滅菌器 (上海博訊實(shí)業(yè)公司);96 孔培養(yǎng)板(康寧3599 型)。

1.2 試藥

對(duì)照品蘆丁來自中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):100080-201409;無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁均為分析純,無水乙醇購(gòu)自西安化學(xué)試劑廠,批號(hào):20181028;氫氧化鈉購(gòu)自煙臺(tái)市雙雙化工有限公司,批號(hào):20181218;亞硝酸鈉購(gòu)自上海廣諾化學(xué)儀器有限公司,批號(hào):20140616;硝酸鋁購(gòu)自上海廣諾化學(xué)儀器有限公司,批號(hào):20141111;食用乙醇;蛋白胨和牛肉膏均購(gòu)自北京奧博星公司;柴胡地上部分(2016年9月采自寧夏隆德縣柴胡種植基地,經(jīng)高級(jí)農(nóng)藝師張守宗老師鑒定為北柴胡地上部分,符合2020 版中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)[1]),低溫晾干,粉碎過2 號(hào)藥典篩。

1.3 菌株

大腸埃希菌(ATCC25922),鼠傷寒沙門氏菌(ATCC14028),表皮葡萄球菌(ATCC12228),福氏志賀菌(CMC C51572)均為寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)中心饋贈(zèng),合軸馬拉色菌(CBS9593)、球形馬拉色菌(CBS9597)、糠秕馬拉色菌(CBS1878)、鈍形馬拉色菌(CBS7876)均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮的含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照溶液的制備 精密稱取對(duì)照品蘆丁10.5 mg,以30%乙醇溶解,并轉(zhuǎn)移至50 ml 的容量瓶中定容至刻度,得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度為0.210 mg/ml,放4℃冰箱備用。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 對(duì)文獻(xiàn)[13-14]中的方法略有改動(dòng),精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0、0.4、0.8、1.4、2.0 和2.6 ml 分別置于10 ml 容量瓶,用移液槍加入5%的NaNO2溶液0.4 ml,靜置6 min,再加入10%的Al(NO3)3溶液0.4 ml,靜置6 min,然后再加入4%的NaOH溶液4 ml,用30%的乙醇定容至刻度,靜置10 min,以試劑空白為參比,用1 cm 比色皿測(cè)定510 nm 波長(zhǎng)處的吸光度,并以蘆丁濃度(C,mg/ml)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo),制作如圖1的標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為:A=11.69×C+0.000 7,R2=1。在0~0.054 6 mg/ml 的范圍內(nèi)蘆丁乙醇溶液線性關(guān)系良好。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 總黃酮的提取

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,選定55%乙醇為溶劑[15],靜態(tài)回流方法進(jìn)行提取,以料液比(A)、浸泡時(shí)間(B)、提取次數(shù)(C)、提取時(shí)間(D)為4 個(gè)考察因素,每個(gè)因素分3 個(gè)水平,以總黃酮含量為考察指標(biāo),利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定柴胡地上部分總黃酮的最佳提取工藝。因素、水平見表1。

表1 柴胡地上部分黃酮提取工藝條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

準(zhǔn)確稱取柴胡地上部分粗粉1.00 g,根據(jù)表1正交設(shè)計(jì)工藝條件進(jìn)行提取,減壓抽濾,濾液減壓低溫濃縮成干浸膏,然后用30%乙醇溶解轉(zhuǎn)移至50 ml 容量瓶中并定容至刻度,搖勻,每個(gè)條件平行做3 次。

2.3 總黃酮提取率測(cè)定

精密吸取按表1正交工藝設(shè)計(jì)條件提取的提取液適量,至10 ml 容量瓶中,按照“2.1.2”方法操作,依次加入顯色劑,最后用30%乙醇定容,搖勻,測(cè)定吸光度,將每個(gè)條件3 次提取液測(cè)得的吸光度計(jì)算平均吸光度值,再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式計(jì)算樣品溶液中總黃酮濃度C,然后代入以下公式計(jì)算總黃酮的提取率(%):總黃酮提取率(%)=(C×N×V×10-3/M)×100。C:黃酮的質(zhì)量濃度(mg/ml);N:稀釋倍數(shù);M:提取用柴胡地上部分的質(zhì)量(g),V:粗提液的定容體積(ml)。

2.4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由表2可以看出正交試驗(yàn)中,影響柴胡地上部分總黃酮提取率的主要因素是提取次數(shù)(C),其次是料液比(A),最后是提取時(shí)間(D)和浸泡時(shí)間(B),對(duì)于A 因素,由于k2>k3>k1,所以A 因素取第二水平,同理,B 因素取第一水平,C 因素取第三水平,D 因素取第一水平。表3方差分析表明,料液比、浸泡時(shí)間、提取次數(shù)、提取時(shí)間各水平間均無明顯差異。因此,通過本試驗(yàn)可以得出,用55%濃度乙醇作為提取溶劑選用靜態(tài)回流提取法提取寧夏栽培柴胡地上部分總黃酮的最佳提取工藝為A2B1C3D1,即藥材用量和溶劑用量之比為1∶10,浸泡適宜時(shí)間為60 min,提取3 次,每次提取72 min,該工藝條件下總黃酮的提取率最好。

表2 柴胡地上部分總黃酮提取工藝條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)方差分析表

2.4.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證 精密稱取柴胡地上部分粗粉1.00 g,共3 份,根據(jù)最佳工藝提取條件平行操作,各提取液低溫減壓濃縮成干浸膏,30%乙醇溶解、轉(zhuǎn)移并定容至50 ml 容量瓶中,取適量于10 ml 容量瓶中,按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定3 份柴胡地上部分總黃酮提取率,結(jié)果表明,驗(yàn)證試驗(yàn)的3 次平行操作中,總黃酮平均提取率為2.702%,且RSD 為1.227%,表明該工藝所選結(jié)果是合理、可行的。

2.5 抑菌活性測(cè)定及結(jié)果

2.5.1 抑菌活性測(cè)定 本研究通過測(cè)定最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)考察柴胡地上部分提取物的抑菌活性,具體過程利用96 孔板參考文獻(xiàn)[16-17]方法并略有改動(dòng),向96 孔板1~9 號(hào)孔,每孔加入空白營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基90 μl,再向每排的第一孔中加入質(zhì)量濃度為500 mg/ml 的柴胡地上部分提取物,然后對(duì)樣品液依次進(jìn)行2 倍稀釋后向每孔中加入菌落濃度為1.0×106CFU/L 的不同受試菌懸液20 μl,此時(shí)每孔樣品液最終質(zhì)量濃度依次為: 250、125、62.5、31.25、15.63、7.815、3.908、1.954、0.977 mg/ml,并在10 號(hào)孔加入180 μl 培養(yǎng)基和20 μl 菌懸液作陰性對(duì)照,11 號(hào)孔加入200 μl 培養(yǎng)基作空白對(duì)照,12 號(hào)孔加入100 μl 培養(yǎng)基和100 μl 藥液作空白對(duì)照,然后置37℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)16 h 后取出觀察。如小孔內(nèi)澄清即為完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng),而澄清小孔中所對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度即待測(cè)樣品對(duì)該菌的最低抑菌濃度。氨芐青霉素鈉(細(xì)菌的陽性對(duì)照)和特比萘酚(真菌的陽性對(duì)照)陽性對(duì)照的做法同樣品,但初始濃度為0.050 mg/ml。每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

2.5.2 抑菌活性測(cè)定結(jié)果 利用微量稀釋96 孔板,測(cè)定柴胡地上部分提取物對(duì)4 個(gè)細(xì)菌和4 個(gè)真菌的最小抑菌濃度,柴胡地上部分提取物對(duì)供試的4 種細(xì)菌和4 種真菌都有一定的抑菌活性,但與陽性對(duì)照相比較總體的抑菌活性較低(表4)。

表4 柴胡地上部分提取物的最小抑菌濃度

3 討論

本實(shí)驗(yàn)過程中正交條件的乙醇濃度、提取方法等都是通過單因素實(shí)驗(yàn)而確定,具體見參考文獻(xiàn)[15],為了使提取工藝更接近工業(yè)化生產(chǎn),本研究在選擇料液比時(shí)最高比例設(shè)為1∶10,提取次數(shù)最多選擇提取3次。單宇等[18]對(duì)北柴胡莖葉總黃酮最佳提取工藝的研究表明,75%乙醇10 倍量60℃提取2 h,確定提取級(jí)數(shù)為2 次,總黃酮提取率達(dá)2.871%;馬文兵等[19]對(duì)北柴胡莖葉總黃酮的最佳提取工藝為,用70%的乙醇在80℃下,按料液比1∶30,回流提取2 h,其總黃酮提取率為3.40%。本研究最佳提取工藝是,用55%的乙醇作溶劑,按料液比1∶10,浸泡時(shí)間60 min,加熱回流提取3 次,每次提取72 min,提取率是2.70%,與馬文兵等[19]、單宇等[18]的研究結(jié)果接近,但文獻(xiàn)用70%、75%乙醇作溶劑進(jìn)行提取,使提取液色素含量較多,影響總黃酮含量的紫外測(cè)定,而本實(shí)驗(yàn)在研究過程中采用55%乙醇濃度作為提取溶劑,所得提取液色素較少,同時(shí)可以節(jié)約溶劑乙醇的用量,更有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

在本研究最佳工藝提取下,柴胡地上部分總黃酮的抑菌活性研究表明,柴胡地上部分總黃酮具有一定的抑菌作用,這與王紅燕等[20]研究顯示柴胡地上部分不同醇提物抑菌活性的初步研究結(jié)果基本一致,與陽性對(duì)照結(jié)果相比,柴胡地上部分總黃酮對(duì)四種供試的馬拉色菌抑制作用更強(qiáng)。本研究?jī)H對(duì)其粗提物的抑菌活性進(jìn)行了測(cè)定,對(duì)于純化后總黃酮的抑菌活性及抑菌機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。另外,本研究在提取之前對(duì)藥材進(jìn)行預(yù)浸泡,使溶劑更好地?cái)U(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)容,更有利于有效成分的提取和溶出,同時(shí),可以節(jié)約提取時(shí)間。

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