鐘選芳 周 瀟 張麗科

1.廣東省惠州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東惠州 516000；2.廣東省惠州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東惠州 516000

炎癥性腸病 （inflammatory bowel disease，IBD）是一組病因不明的主要累及胃腸道的慢性炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩?。–rohn's disease，CD），近年來發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，但診斷和鑒別診斷較難，需結(jié)合臨床、內(nèi)鏡、影像、病理等綜合分析[1]。文獻(xiàn)報(bào)道血清學(xué)標(biāo)志物可幫助診斷和鑒別診斷IBD[2-3]。近年來國內(nèi)外對(duì)抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體 （anti-neutrophil cytoplasmic antibody，ANCA）相關(guān)抗體與IBD 的關(guān)系報(bào)道不同中心的研究結(jié)論不甚一致，各抗體在IBD 中的臨床意義尚不明確，與臨床表型的關(guān)系報(bào)道尚有爭(zhēng)議[4-7]。本研究探討單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)血清核周型ANCA（perinuclear-ANCA，p-ANCA）、胞漿型ANCA（cytoplasmic-ANCA，c-ANCA）、蛋白酶3-ANCA（proteinase 3-ANCA，PR3-ANCA）、髓過氧化物酶-ANCA（myeloperoxidase-ANCA，MPO-ANCA）4種ANCA 相關(guān)抗體在IBD 診斷、鑒別診斷的臨床意義，探討抗體水平與IBD 疾病表型和臨床特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年5月至2021年2月在惠州市第一人民醫(yī)院收治的123 例IBD 患者作為研究對(duì)象，按照疾病類型分為UC 組（78 例）與CD 組（45 例），選取同期收治的非IBD 腸道疾病患者56 例作為疾病對(duì)照組（其中腸結(jié)核8 例，腸白塞病2 例，腸易激綜合征7例，嗜酸性胃腸炎1 例，缺血性腸病13 例，非特異性腸炎19 例，孤立性直腸潰瘍2 例，過敏性紫癜4 例），選取同期在健康體檢中心體檢的30 名健康體檢者作為正常對(duì)照組。UC 組中，男46 例，女32 例；年齡18～58歲，平均（46.1±13.7）歲；CD 組中，男31 例，女14 例；年齡16～49 歲，平均（33.9±13.4）歲；疾病對(duì)照組中，男32例，女24 例；年齡14～62 歲，平均（45.9±15.7）歲。正常對(duì)照組中，男19 名，女11 名；年齡18～64 歲，平均（42.1±13.9）歲。四組研究對(duì)象的一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：①UC 組和CD 組患者均符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見（2012，廣州）》的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；②UC 組與CD 組患者均為初次診斷，并且在未進(jìn)行治療之前納入本研究，本研究中的4 種抗體檢測(cè)均在患者治療之前進(jìn)行；③患者精神狀態(tài)良好，能夠配合研究中的各項(xiàng)檢查的進(jìn)行。排除標(biāo)準(zhǔn)：①未定型結(jié)腸炎；②伴有自身免疫系統(tǒng)疾病、遺傳性疾病的患者；③確診各種惡性腫瘤包括實(shí)體瘤與血液系統(tǒng)腫瘤的患者；④患者正在進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，免疫抑制治療；⑤患者伴有嚴(yán)重的血液系統(tǒng)疾病，凝血功能障礙等；⑥伴有精神疾病，無法配合研究進(jìn)行的患者。所有患者均簽署知情同意書；本研究嚴(yán)格遵守倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)要求，并通過惠州市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（批號(hào)2019044）。

1.2 抗體檢測(cè)

所有研究對(duì)象均采用間接免疫熒光法（IIF 法）檢測(cè)血清p-ANCA、c-ANCA 的表達(dá)水平，采用酶聯(lián)免疫法（ELISA 法）檢測(cè)血清PR3-ANCA、MPO-ANCA 的表達(dá)水平。試劑由美國宙斯（Zeus）公司提供，操作步驟如下。①加樣：分別取稀釋過的陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、校正品和血清樣品100 μl 加入到對(duì)應(yīng)的反應(yīng)孔中，取100 μl 樣本稀釋液加入到對(duì)應(yīng)孔中作為試劑空白對(duì)照；②溫育：溫度為室溫（20～25℃），時(shí)間（25±5）min；③洗板5 次；④加入酶聯(lián)物：每孔中加入酶聯(lián)物100 μl；⑤溫育：溫度為室溫（20～25℃），時(shí)間（25±5）min；⑥洗板5 次；⑦加入顯色液（TMB）：每孔中加入TMB 100 μl；⑧溫育：溫度為室溫（20～25℃），時(shí)間10～15 min；⑨加入終止液：每孔加入終止液50 μl 以終止反應(yīng)；⑩讀數(shù)：在加入終止液30 min 內(nèi)，將微孔板置于450 nm波長(zhǎng)下讀取每個(gè)孔的光密度值，以空白試劑作對(duì)照。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

①四組患者的血清p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPO-ANCA 的檢測(cè)陽性率以及4 種抗體聯(lián)合檢測(cè)（即任一抗體陽性即為陽性）的檢測(cè)陽性率；②p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPO-ANCA 單獨(dú)使用以及4 種抗體聯(lián)合使用的診斷敏感度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測(cè)值，陰性預(yù)測(cè)值。敏感度=真陽性/（真陽性＋假陰性）×100%；特異度=真陰性/（假陽性＋真陰性）×100%；準(zhǔn)確度=（真陽性＋真陰性）/總例數(shù)×100%；陽性預(yù)測(cè)值=真陽性/（真陽性＋假陽性）×100%，陰性預(yù)測(cè)值=真陰性/（真陰性＋假陰性）×100%；③4 種血清學(xué)抗體對(duì)UC 和CD 鑒別診斷的效能；④不同臨床特征的UC 患者的p-ANCA 表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間整體比較采用χ2檢驗(yàn)，兩兩比較采用Bonferroni 方法校正，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=原α 水平/比較次數(shù)，即0.05/6=0.008。

2 結(jié)果

2.1 各組患者血清p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPO-ANCA 的表達(dá)情況

四土組患者的p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPO-ANCA 及4 種抗體聯(lián)合檢測(cè)的陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。UC 組患者的p-ANCA 高于CD 組、疾病對(duì)照組、正常對(duì)照組，c-ANCA、PR3-ANCA、聯(lián)合檢測(cè)高于疾病對(duì)照組、正常對(duì)照組，MPOANCA 高于疾病對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.008）。CD 組的c-ANCA 及聯(lián)合檢測(cè)高于疾病對(duì)照組、正常對(duì)照組，MPO-ANCA 高于疾病對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.008）。其余各指標(biāo)組間兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.008）（表1）。

表1 各組患者p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPO-ANCA 的表達(dá)情況[n（%）]

2.2 血清學(xué)抗體診斷IBD 的效能

4 種抗體聯(lián)合檢測(cè)診斷IBD 的敏感度和準(zhǔn)確度最高，分別為66.7%、75.1%；PR3-ANCA 和MPOANCA 的特異度最高，均為95.3%。4 種抗體及聯(lián)合檢測(cè)的敏感度和準(zhǔn)確度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而特異度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。P-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPO-ANCA 的陽性預(yù)測(cè)值分別為91.2%、89.9%、87.9%、88.9%、88.2%；陰性預(yù)測(cè)值分別為53.3%、60.0%、46.6%、47.4%、64.7%。

4 種抗體單獨(dú)檢測(cè)診斷IBD 的特異度均較高（90.1%～95.3%）。提示用于鑒別診斷價(jià)值較高，但敏感度均不高，單獨(dú)檢測(cè)中c-ANCA 的敏感度最高，但也僅為57.7%，獨(dú)立作為篩查指標(biāo)的價(jià)值可能有限。4種抗體聯(lián)合檢測(cè)的敏感度比單獨(dú)檢測(cè)高，但特異度有所下降，提示聯(lián)合檢測(cè)抗體比單獨(dú)檢測(cè)可能更有利于IBD 的篩查和診斷（表2）。

表2 4 種抗體及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)IBD 的診斷效能[%（n/N）]

2.3 血清學(xué)抗體對(duì)UC 和CD 鑒別診斷的效能

表1結(jié)果顯示，其他抗體對(duì)CD 診斷意義不大，效能較低，且數(shù)據(jù)量較大，故僅列出診斷價(jià)值較高的4 項(xiàng)，見表3。PR3-ANCA 診斷UC 的特異度最高，但敏感度僅為26.9%，p-ANCA 診斷UC 的效能較好，四項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)能提高診斷UC 的敏感度，但特異度有所下降，c-ANCA 診斷CD 的敏感度和特異度均不高，鑒別診斷效能較低。

表3 4 種抗體在UC 與CD 鑒別診斷中的效能[%（n/N）]

2.4 p-ANCA 與UC 患者臨床特征的關(guān)系

選擇診斷效能最好的p-ANCA 進(jìn)行分析，比較不同臨床特征UC 患者的p-ANCA 檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果顯示，p-ANCA 在中重度UC 患者中陽性率高于輕度UC 患者，病變部位在廣泛結(jié)腸的患者占比高于其他部位，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表4）。

表4 不同臨床特征的UC 患者的p-ANCA 表達(dá)情況[n（%）]

3 討論

IBD 的病因以及發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，但是通過大量研究表明IBD 的發(fā)病與免疫功能失衡有關(guān)。免疫抗體多數(shù)可以作為血清學(xué)檢測(cè)指標(biāo)對(duì)疾病診斷起到輔助作用，并且血清學(xué)標(biāo)志物無創(chuàng)，技術(shù)要求并不高，檢測(cè)簡(jiǎn)單方便，可以量化，因此在疾病的檢查診斷以及嚴(yán)重程度分層中都獲得了廣泛應(yīng)用[9]。IBD 無明確的診斷金標(biāo)準(zhǔn)，并且疾病的早期診斷，疾病的嚴(yán)重程度分級(jí)，疾病治療效果的評(píng)估，預(yù)后評(píng)估，復(fù)發(fā)評(píng)估等都缺乏具有良好臨床診斷價(jià)值的量化指標(biāo)，具有良好敏感度以及特異度的血清學(xué)標(biāo)志物可以滿足IBD的診斷以及評(píng)估需求[10]。目前IBD 的血清學(xué)標(biāo)志物眾多，其中自身抗體抗ANCA 研究最為廣泛，但是各種不同分型的ANCA 抗體在IBD 患者中的具體表達(dá)情況，以及診斷效能在眾多研究中結(jié)論不一[11]。本研究目的是探討單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)ANCA 相關(guān)4 種血清學(xué)自身抗體p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPO-ANCA 在IBD 診斷、鑒別診斷的臨床意義，探討抗體水平與IBD 臨床特征的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，UC 組患者的p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、4 種抗體聯(lián)合檢測(cè)的表達(dá)陽性率高于疾病對(duì)照組以及正常對(duì)照組，CD組患者的p-ANCA、c-ANCA、4 種抗體聯(lián)合檢測(cè)的表達(dá)陽性率高于疾病對(duì)照組以及正常對(duì)照組，UC 組和CD 組患者的MPO-ANCA 的陽性率均高于疾病對(duì)照組（P＜0.008），而疾病對(duì)照組與正常對(duì)照組的p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPO-ANCA 的表達(dá)情況均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.008）。與其他腸道疾病患者以及健康正?；颊呦啾?，IBD 患者具有明顯的p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPO-ANCA 表達(dá)改變，提示IBD 患者可能存在ANCA 相關(guān)的自身免疫抗體表達(dá)異常，與何淳等[12]的報(bào)道結(jié)果相似。

本研究中p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPOANCA 4 種抗體單獨(dú)檢測(cè)診斷IBD 的特異度均較高（90.1%～95.3%），但敏感度均不高，提示用于鑒別診斷價(jià)值較高，但獨(dú)立作為篩查指標(biāo)的價(jià)值可能有限，4種抗體聯(lián)合檢測(cè)的敏感度比單獨(dú)檢測(cè)高，但特異度有所下降，提示聯(lián)合檢測(cè)抗體比單獨(dú)檢測(cè)可能更有利于IBD 的篩查和診斷，與van Schaik 等[13]的研究報(bào)道一致，其研究提示聯(lián)合血清標(biāo)志物診斷IBD 的預(yù)測(cè)值比單一血清標(biāo)志物高。國內(nèi)傅蘇娜等[14]的研究也提示聯(lián)合多種血清學(xué)標(biāo)志物有助于IBD 的診斷。Smids 等[15]報(bào)道血清學(xué)標(biāo)志物可以鑒別診斷UC 和CD，Arias-Loste 等[16]報(bào)道PR3-ANCA 在血清學(xué)標(biāo)志物中更普遍，滴度在UC 患者比CD 患者更高，ROC 曲線范圍為0.81，敏感度和特異度分別為52.1%和97.3%，提示PR3-ANCA 可能是一個(gè)有助于鑒別診斷IBD 的血清學(xué)標(biāo)志物。本研究中PR3-ANCA 診斷UC 的特異度最高，達(dá)82.2%，提示PR3-ANCA 可能有助于鑒別診斷UC 和CD。本研究中UC 患者的p-ANCA 與CD 患者的表達(dá)具有明顯差異，并且在UC 與CD 的鑒別診斷中具有較好的敏感度與特異度，具有較好的鑒別診斷效能，可以用于UC 與CD 的鑒別診斷，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。文獻(xiàn)報(bào)道UC 患者中p-ANCA 的敏感度和特異度分別是44%和86%，陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為78%和58%，提示p-ANCA 對(duì)于鑒別UC 和CD是一個(gè)有利的參數(shù)[17]。國內(nèi)一項(xiàng)meta 分析顯示ANCA診斷UC 的敏感度和特異度分別約51%和92%，最佳敏感度和特異度位置為0.727[18]。

關(guān)于血清學(xué)抗體與IBD 臨床特征的關(guān)系報(bào)道也很多，本研究分析了不同臨床特征的UC 患者中p-ANCA 的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，p-ANCA 在中重度UC 患者中陽性率高于輕度UC 患者，病變部位在廣泛結(jié)腸的患者占比高于其他部位，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明在不同嚴(yán)重程度，不同病變部位的UC 患者中p-ANCA 表達(dá)具有明顯差異，提示p-ANCA 的表達(dá)與UC 的嚴(yán)重程度、病變部位可能相關(guān)，p-ANCA 的表達(dá)可能有助于評(píng)估UC 病情，與Wang 等[10]的報(bào)道一致，他們比較了41 例UC 患者、71 例CD 患者、71 例其他胃腸道疾病患者和31 例正常健康對(duì)照者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p-ANCA 在中重度活動(dòng)性UC 陽性率比輕度活動(dòng)性UC 高。但我國袁柏思等[19]研究結(jié)果表明p-ANCA 與UC 患者的診斷年齡、病變位置、治療方式均無關(guān)，總之，ANCA 相關(guān)抗體在IBD 的臨床意義值得進(jìn)一步探討。本研究樣本量較少，觀察指標(biāo)較少，并且未根據(jù)疾病嚴(yán)重程度分級(jí)進(jìn)行分組，因此本研究結(jié)論也有一定的局限性，未來可以加大樣本量，根據(jù)疾病分層對(duì)血清學(xué)標(biāo)志物進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

綜上所述，p-ANCA、c-ANCA、PR3-ANCA、MPOANCA 在IBD 中的表達(dá)與非IBD 患者具有明顯差異，4 種抗體聯(lián)合檢測(cè)對(duì)IBD 診斷效能更好，p-ANCA 對(duì)UC 的病情評(píng)估可能具有一定的輔助價(jià)值，值得在臨床推廣使用。