李 飛，吳傳新，何佳輝，張 杰，劉慧玲，孫 航*

1. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病毒性肝炎研究所，重慶 400010

2. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科，重慶 400010

3. 成都市雙流區(qū)婦幼保健院新生兒科，成都 610200

膿毒癥是指宿主對感染產(chǎn)生失控反應(yīng)并出現(xiàn)危及生命的器官功能障礙的臨床綜合征，是ICU 常見的死亡原因，每年患病人數(shù)高達(dá)1 900 萬［1］。膿毒癥可導(dǎo)致各種類型的器官損傷，特別是肝、腦和心臟損傷，而膿毒癥后肝功能障礙是多器官功能障礙和膿毒癥致死的獨立危險因素［2］。有證據(jù)表明，肝功能損傷作為膿毒癥的并發(fā)癥，可直接導(dǎo)致膿毒癥患者病情進展甚至死亡［3］。然而針對膿毒癥后肝功能損傷目前仍沒有較好的治療策略。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）在兒茶素中占比最高（50%～80%），有抗氧化、抗突變和抗感染等特性［4］。研究發(fā)現(xiàn)，EGCG 能有效抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的血清高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）的釋放和表達(dá)，提高敗血癥模型大鼠的存活率；還可通過抑制外源性HMGB1 在巨噬細(xì)胞表面的黏附降低HMGB1 及其標(biāo)志物IL-6 的聚集，阻斷HMGB1 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［5-6］。

HMGB1 是一種高度保守且廣泛表達(dá)的非組蛋白染色質(zhì)結(jié)合蛋白，可與特定染色質(zhì)DNA 結(jié)合并參與DNA 重組、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞分裂和分化，是近年發(fā)現(xiàn)的一種重要的膿毒癥炎癥因子。已有研究證明多種細(xì)胞死亡方式如細(xì)胞焦亡等參與了宿主的免疫調(diào)節(jié)［7］。細(xì)胞焦亡主要由核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體介導(dǎo)，該炎癥小體在固有免疫細(xì)胞識別抗原后被激活［8］，以炎癥小體激活和炎癥級聯(lián)為特征，被認(rèn)為是減少器官和組織損傷的主要防御機制，然而細(xì)胞焦亡過度活化會導(dǎo)致炎癥失控、細(xì)胞死亡和多器官損傷。研究表明在膿毒癥中，細(xì)胞HMGB1 增加可促進細(xì)胞焦亡和凋亡，介導(dǎo)器官損傷［9］。EGCG 參與膿毒癥后急性肝損傷的細(xì)胞途徑及膿毒癥后急性肝損傷的發(fā)病機制目前尚不明了。本研究旨在探究EGCG 對膿毒癥后急性肝損傷是否具有保護作用，以及EGCG 的保護作用是否與減弱HMGB1/Toll 樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）/NF- B/NLRP3 途徑降低肝細(xì)胞焦亡有關(guān)。

1 材料和方法

1.1 動物、細(xì)胞與試劑 8～10 周齡雄性C57BL/6J小鼠88 只購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司［實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（湘）2019-0004］，飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級動物房［實驗動物使用許可證號為SYXK（渝）2018-0003］，自由飲食、飲水，實驗前先在SPF 級動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)小鼠1 周，實驗全過程遵守《實驗動物管理條例》。

人正常肝細(xì)胞系L02 細(xì)胞由重慶醫(yī)科大學(xué)病毒性肝炎研究所提供。

EGCG（純度≥98%，貨號IE0150）購自北京索萊寶科技有限公司，脂多糖（純度≤100%，貨號L4391）購自美國Sigma-Aldrich 公司，HMGB1（純度＞95%，貨號C357）購自蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司，Opti-MEMTMⅠ減血清培養(yǎng)基購自美國ThermoFisher Scientific 公司，F(xiàn)BS 購自澳大利亞Life 公司，青霉素-鏈霉素復(fù)合溶液購自武漢賽維爾生物科技有限公司，DMEM 購自重慶醫(yī)科大學(xué)病毒性肝炎研究所，caspase 1 一抗購自中國臺灣Arigo 公司，NF-κB p65 一抗購自美國Cell Signaling Technology 公司，消皮素D（gasdermin D，GSDMD）、caspase 11、IL-18、IL-1 、HMGB1和TLR4 一抗均購自英國Abcam 公司，NLRP3、 肌動蛋白、組蛋白H3 一抗和山羊抗兔二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司，免疫組織化學(xué)染色酶標(biāo)二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，BCA 蛋白定量試劑盒、RIPA 裂解液和4%多聚甲醛溶液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，細(xì)胞核蛋白質(zhì)提取試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，TNF- 和IL-6 ELISA 檢測試劑盒均購自北京四正柏生物科技有限公司，HMGB1 ELISA 檢測試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 動物模型的建立與分組 小鼠隨機分為盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)（cecal ligation and puncture，CLP）組、CLP+EGCG 低劑量（4 mg/kg）組、CLP+EGCG高劑量（8 mg/kg）組和假手術(shù)組。CLP 手術(shù)過程：小鼠禁食、不禁水12 h 后，在無菌條件下予腹腔注射異氟烷（2%～3%）麻醉。備皮、碘伏消毒，沿腹白線中段剪開一長約0.8 cm 的縱行切口，分離皮膚和肌層，探查腹腔并分離盲腸（注意盲腸主要位于小鼠左下腹，避免傷及盲腸及血管）。使用鑷子輕輕擠壓腸內(nèi)容物使盲腸遠(yuǎn)端充盈，使用3-0 手術(shù)絲線結(jié)扎盲腸遠(yuǎn)端，然后使用21 G 針頭在結(jié)扎處遠(yuǎn)端避開血管穿刺盲腸1 次，造成腸瘺，小心擠出約1 mm 的糞便，最后將盲腸回納，關(guān)腹。以假手術(shù)組作為對照，假手術(shù)組小鼠不予盲腸遠(yuǎn)端結(jié)扎與穿刺，其他手術(shù)操作與CLP 相同。CLP 組與假手術(shù)組小鼠術(shù)后予37 ℃無菌生理鹽水（5 mL/100 g）皮下注射1 次，CLP+EGCG 低劑量組和CLP+EGCG 高劑量組小鼠術(shù)后分別予37 ℃含80 和160 mg/L EGCG 的生理鹽水（5 mL/100 g）皮下注射1 次，隨后使小鼠俯臥于保溫墊上復(fù)蘇。待蘇醒后放回SPF 級動物房［室溫（22±2）℃，相對濕度40%～70%，12 h 晝夜交替］繼續(xù)飼養(yǎng)，飲食、飲水同術(shù)前。觀察并記錄小鼠術(shù)后24 h 一般情況，然后經(jīng)腹腔注射異氟烷（2%～3%）麻醉后經(jīng)心臟采血并處死小鼠，收集全血、分離肝組織進行實驗。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 L02 細(xì)胞用含有10% FBS和1%抗生素（青霉素和鏈霉素）的DMEM，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞用0.25%胰酶消化后重懸，調(diào)整細(xì)胞密度并以2.0×106個/孔接種于6 孔板，待細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)基為Opti-MEMTMⅠ減血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后分為4 組：脂多糖組（用400 ng/mL 脂多糖刺激細(xì)胞24 h）、脂多糖+HMGB1 組（用400 ng/mL脂多糖刺激細(xì)胞10 h后，再加入100 ng/mL HMGB1刺 激14 h）、脂 多 糖+EGCG 組（用100 μg/mL EGCG 預(yù)處理細(xì)胞2 h，然后用400 ng/mL 脂多糖刺激24 h）、對照組（加入無菌PBS 后培養(yǎng)24 h），每組設(shè)8 個復(fù)孔。

1.4 小鼠血常規(guī)與肝功能檢測 術(shù)后24 h 使用EDTA 抗凝管收集小鼠全血，常溫下1 h 內(nèi)送往重慶醫(yī)科大學(xué)寵物醫(yī)院進行血常規(guī)檢測。使用一次性凝結(jié)真空管收集小鼠血液后，先室溫靜置30 min，再 經(jīng)4 ℃ 1 000×g離 心10 min 收 集 血 清，送往重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，采用全自動生化分析儀檢測小鼠血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT） 和 天 冬 氨 酸 轉(zhuǎn) 氨 酶（aspartate aminotransferase，AST）水平。

1.5 ELISA 檢測小鼠血清與L02 細(xì)胞上清液中炎癥因子HMGB1、IL-6 和TNF-α 水平 術(shù)后24 h，使用一次性凝結(jié)真空管收集小鼠全血，室溫下靜置30 min 后，4 ℃ 1 000×g離心10 min 收集血清。收集各組L02 細(xì)胞培養(yǎng)上清液。嚴(yán)格按照ELISA檢測試劑盒說明書進行操作，檢測小鼠血清與細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HMGB1、IL-6 和TNF- 水平。

1.6 H-E 染色觀察小鼠肝組織學(xué)變化 術(shù)后24 h，分離小鼠肝組織，使用PBS 洗去血液，用濾紙擦干多余水分，剪下一塊肝組織放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，然后經(jīng)脫水、石蠟包埋處理后制作石蠟切片。肝組織石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化處理后進行H-E 染色，于顯微鏡下觀察肝組織學(xué)變化。其余肝組織放入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測小鼠肝組織與L02 細(xì)胞中HMGB1、TLR4、NF-κB p65、NLRP3 和焦亡相關(guān)蛋白（GSDMD、caspase 1、caspase 11、IL-1β、IL-18）的表達(dá) 每10 mg 肝組織加入約100 μL RIPA 裂解液進行勻漿，然后置于冰上充分裂解并收集總蛋白質(zhì)。各組細(xì)胞棄培養(yǎng)基后用PBS 洗滌，加入RIPA裂解液收集細(xì)胞總蛋白質(zhì)。根據(jù)細(xì)胞核蛋白質(zhì)提取試劑盒說明書提取細(xì)胞核蛋白質(zhì)，使用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。取適量蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，使用5%牛血清白蛋白溶液封閉；分別加入HMGB1 一抗（稀釋 比 例 為1 ∶10 000）及TLR4、NF- B p65、NLRP3、GSDMD、caspase 1、caspase 11、IL-18、IL-1 一抗（稀釋比例均為1 ∶1 000）4 ℃ 孵育過夜，用TBST 洗去膜表面未結(jié)合的抗體；加入山羊抗兔二抗（稀釋比例為1 ∶10 000）室溫孵育2 h，用TBST 洗膜；均勻滴加ECL 顯影劑，采用化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（美國Bio-Rad 公司）顯影。

1.8 免疫組織化學(xué)染色檢測小鼠肝組織中HMGB1與GSDMD 表達(dá)與定位 小鼠肝組織石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化，采用微波修復(fù)法進行抗原修復(fù)并冷卻至室溫后，使用PBS 洗片。擦干組織周圍多余液體，滴加適量的內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育15 min，用PBS 洗片；滴加適量山羊血清工作液室溫封閉10 min，傾去血清，勿洗；滴加適量HMGB1、GSDMD 一抗（稀釋比例均為1 ∶50）4 ℃ 孵育過夜，用PBS 洗片；滴加適量的生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG 聚合物室溫孵育15 min，用PBS洗片；滴加適量HRP 標(biāo)記鏈霉卵白素工作液室溫孵育15 min 后洗片；滴加適量DAB 顯色液（現(xiàn)配）室溫顯色3 min，用自來水沖洗；最后滴加適量蘇木精染色液室溫染色約30 s。經(jīng)沖洗、返藍(lán)、脫水、透明處理后，使用中性樹脂封片，于顯微鏡下觀察HMGB1 與GSDMD 的表達(dá)和定位情況。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 48 只小鼠（每組12 只）用于分析4 組小鼠術(shù)后生存率，然后根據(jù)各組小鼠生存情況擴充實驗小鼠數(shù)量，并為保證各項實驗樣本量充足及檢驗指標(biāo)分析結(jié)果的均一性，最終確定各組統(tǒng)計樣本量n＝6，因此CLP 組小鼠40 只、CLP+EGCG 低劑量組20 只、CLP+EGCG 高劑量組16 只、假手術(shù)組12 只。應(yīng)用GraphPad Prism 8.2.1 軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Bonferroni 校正的t檢驗。檢驗水準(zhǔn)（α）為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠術(shù)后一般情況 術(shù)后24 h，CLP 組小鼠死亡8 只，CLP+EGCG 低劑量組死亡5 只，CLP+EGCG 高劑量組死亡3 只，假手術(shù)組小鼠全部存活。CLP 組小鼠術(shù)后精神萎靡，喜聚集，背部毛發(fā)臟亂，眼瞼部出現(xiàn)白色膿性分泌物，大便溏?。凰劳鲂∈蟾共颗蚵?，解剖后可見腹腔充滿黃色滲出液，腸道粘連，盲腸遠(yuǎn)端呈白色壞死。CLP+EGCG 低劑量組與CLP+EGCG 高劑量組存活小鼠毛發(fā)臟亂，精神尚可，大便附著于肛周。假手術(shù)組小鼠術(shù)后蘇醒即基本恢復(fù)正常狀態(tài)。

2.2 各組小鼠術(shù)后血常規(guī)與肝功能 術(shù)后24 h 血常規(guī)和肝功能檢測結(jié)果顯示，CLP 組白細(xì)胞計數(shù)、淋巴細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞計數(shù)、單核細(xì)胞計數(shù)均低于假手術(shù)組（P均＜0.05），血清ALT、AST水平均高于假手術(shù)組（P均＜0.01），提示膿毒癥后急性肝損傷模型小鼠構(gòu)建成功。CLP+EGCG 低劑量組、CLP+EGCG 高劑量組小鼠白細(xì)胞計數(shù)、淋巴細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞計數(shù)、單核細(xì)胞計數(shù)等血常規(guī)指標(biāo)與CLP 組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05），但血清ALT、AST 水平均低于CLP 組（P均＜0.01），且CLP+EGCG 高劑量組血清ALT、AST 水平低于CLP+EGCG 低劑量組（P均＜0.05），表明EGCG 能減輕小鼠膿毒癥后急性肝損傷。見表1。

表1 各組小鼠術(shù)后24 h 血常規(guī)與肝功能指標(biāo)Tab 1 Routine blood test and liver function of mice 24 h after operation in each group n＝6, ±s

表1 各組小鼠術(shù)后24 h 血常規(guī)與肝功能指標(biāo)Tab 1 Routine blood test and liver function of mice 24 h after operation in each group n＝6, ±s

The intervention concentrations of low- and high-dose EGCG were 4 and 8 mg/kg, respectively. CLP: Cecal ligation and puncture; EGCG: Epigallocatechin gallate; WBC: White blood cell; ALT: Alanine aminotransferase; AST: Aspartate aminotransferase.*P＜0.05, **P＜0.01 vs sham group; △△P＜0.01 vs CLP group; ▲P＜0.05, ▲▲P＜0.01 vs CLP+EGCG low-dose group.

Group Routine blood test/(L-1, ×109) Liver function/(U·L-1)WBC Neutrophil Lymphocyte Monocyte ALT AST Sham 9.48±1.20 1.27±0.47 7.46±1.01 0.52±0.25 35.83±3.34 107.83±10.79 CLP 0.93±0.56** 0.07±0.06* 0.77±0.44** 0.08±0.08* 350.33±15.85** 474.67±32.42**CLP+EGCG low-dose 1.53±0.67** 0.41±0.48 0.99±0.32** 0.11±0.08 150.50±15.61**△△ 271.67±18.59**△△CLP+EGCG high-dose 2.97±0.57** 0.74±0.24 1.94±0.68** 0.28±0.12 94.17±15.61**△△▲ 181.50±18.22**△△▲▲F value 202.671 15.744 188.637 16.339 504.193 327.823 P value ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 各組小鼠血清炎癥因子HMGB1、TNF-α 和IL-6 表達(dá) 術(shù)后24 h ELISA 檢測結(jié)果顯示，CLP 組、CLP+EGCG 低劑量組及CLP+EGCG 高劑量組小鼠血清中HMGB1 表達(dá)量分別為（889.77±60.25）、（686.82±74.53）、（479.30±50.43）pg/mL，TNF- 表達(dá)量分別為（647.75±55.68）、（377.80±42.25）、（166.74±19.88）pg/mL，IL-6 表 達(dá) 量 分 別 為（1 706.37±95.81）、（1 175.61±116.12）、（791.55±85.01）pg/mL，均高于假手術(shù)組［HMGB1、TNF- 、IL-6 表 達(dá) 量 分 別 為（46.26±4.34）pg/mL、（45.90±0.38）pg/mL、（13.12±1.66）pg/mL］，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01）。CLP+EGCG低劑量組和CLP+EGCG 高劑量組血清HMGB1、TNF- 和IL-6的表達(dá)量均低于CLP組（P均＜0.05），且CLP+EGCG 高劑量組血清中HMGB1、TNF- 和IL-6 的表達(dá)量均較CLP+EGCG 低劑量組更低（P均＜0.05）。以上結(jié)果提示EGCG 對膿毒癥后急性肝損傷模型小鼠有一定的抗炎作用。

2.4 各組小鼠肝組織學(xué)變化 術(shù)后24 h肝組織H-E染色（圖1）顯示，假手術(shù)組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常，中央靜脈結(jié)構(gòu)完整，肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，無異常表現(xiàn)；CLP 組小鼠肝組織病理切片可見肝細(xì)胞腫脹，呈現(xiàn)多發(fā)灶狀壞死，部分區(qū)域可見中央靜脈周圍多個局灶壞死融合成片，考慮膿毒癥引起的炎性壞死；CLP+EGCG 低劑量組及CLP+EGCG 高劑量組小鼠肝組織損傷較CLP 組明顯減輕。

2.5 各組小鼠術(shù)后肝組織中HMGB1、TLR4、NF-κB p65、NLRP3 及焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況 蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果（圖2、表2）顯示，術(shù)后24 h，CLP 組、CLP+EGCG 低劑量組及CLP+EGCG 高劑量組小鼠肝組織細(xì)胞核中NF- B p65 的表達(dá)量及肝組織中HMGB1、TLR4、NLRP3、GSDMD、caspase 1、caspase 11、IL-1 和IL-18 的表達(dá)量均高于假手術(shù)組（P均＜0.01）；CLP+EGCG 低劑量組和CLP+EGCG 高劑量組上述蛋白質(zhì)的表達(dá)量均低于CLP 組（P均＜0.05），且CLP+EGCG 高劑量組中上述蛋白質(zhì)的表達(dá)量均較CLP+EGCG 低劑量組更低（P均＜0.05）。以上結(jié)果提示EGCG對膿毒癥后急性肝損傷的保護作用可能與通過減弱HMGB1/TLR4/NF- B/NLRP3途徑降低肝細(xì)胞焦亡有關(guān)。

表2 各組小鼠肝組織中HMGB1、TLR4、NF-κB p65、NLRP3 及焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況Tab 2 Expression of HMGB1, TLR4, NF-κB p65, NLRP3 and pyroptosis-related proteins of mouse liver tissues in each group n＝6, ±s

表2 各組小鼠肝組織中HMGB1、TLR4、NF-κB p65、NLRP3 及焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況Tab 2 Expression of HMGB1, TLR4, NF-κB p65, NLRP3 and pyroptosis-related proteins of mouse liver tissues in each group n＝6, ±s

The intervention concentrations of low- and high-dose EGCG were 4 and 8 mg/kg, respectively. HMGB1: High mobility group protein B1; TLR4: Toll-like receptor 4; NF- B p65: Nuclear factor B p65; NLRP3: Nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3; CLP: Cecal ligation and puncture; EGCG: Epigallocatechin gallate; GSDMD: Gasdermin D; caspase: Cysteine aspartic acid specific protease; IL: Interleukin. **P＜0.01 vs sham group; △P＜0.05, △△P＜0.01 vs CLP group; ▲P＜0.05, ▲▲P＜0.01 vs CLP+EGCG low-dose group.

Group HMGB1 TLR4 NF- B p65 NLRP3 GSDMD Sham 0.036±0.006 0.023±0.006 0.024±0.005 0.099±0.014 0.128±0.006 CLP 1.406±0.090** 1.082±0.054** 0.843±0.070** 0.616±0.015** 0.474±0.022**CLP+EGCG low-dose 1.043±0.040**△△ 0.736±0.029**△△ 0.612±0.030**△ 0.463±0.030**△△ 0.302±0.035**△CLP+EGCG high-dose 0.772±0.072**△△▲0.488±0.034**△△▲▲0.394±0.021**△△▲▲0.335±0.022**△△▲▲ 0.170±0.006**△△▲▲F value 453.477 0.003 385.028 526.913 269.599 P value ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 Group caspase 1 caspase 11 IL-1 IL-18 Sham 0.142±0.015 0.016±0.002 0.101±0.020 0.061±0.007 CLP 0.738±0.032** 0.289±0.007** 1.078±0.089** 0.247±0.016**CLP+EGCG low-dose 0.368±0.023**△△ 0.126±0.005**△△ 0.803±0.020**△△ 0.161±0.008**△△CLP+EGCG high-dose 0.308±0.015**△△▲ 0.091±0.005**△△▲▲ 0.582±0.053**△△▲ 0.104±0.006**△△▲▲F value 625.611 2 439.197 299.078 311.505 P value ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.6 各組小鼠肝組織中HMGB1、GSDMD 表達(dá)與定位情況 術(shù)后24 h 免疫組織化學(xué)染色檢測結(jié)果（圖3）顯示，GSDMD 主要表達(dá)于肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，而HMGB1在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均有表達(dá)；CLP組、CLP+EGCG 低劑量組及CLP+EGCG 高劑量組小鼠肝組織中GSDMD的表達(dá)量分別為（18.21±1.71）%、（11.14±1.27）%、（6.81±1.31）%，HMGB1 的表達(dá)量分別為（25.54±1.02）%、（16.69±1.13）%、（13.62±0.76）%，均 高 于 假 手 術(shù) 組［（0.14±0.02）%、（0.16±0.07）%，P均＜0.05］，且CLP+EGCG 高劑量組肝組織中GSDMD 和HMGB1 的表達(dá)量均較CLP+EGCG 低劑量組更低（P均＜0.05）。

2.7 L02 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子HMGB1、TNF- 、IL-6 的表達(dá)情況 ELISA 檢測結(jié)果顯示，脂多糖組、脂多糖+HMGB1 組及脂多糖+EGCG組L02 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HMGB1 的表達(dá)量分別為（874.44±96.84）、（1 858.15±67.94）、（540.63±121.78）pg/mL，TNF- 的表達(dá)量分別為（233.30±24.95）、（327.24±27.84）、（170.93±15.75）pg/mL，IL-6 的表達(dá)量分別為（285.76±29.97）、（413.03±21.37）、（170.68±21.87）pg/mL，均高于對照組［HMGB1、TNF- 、IL-6 表達(dá)量分別為（21.92±1.64）pg/mL、（8.96±1.41）pg/mL、（39.12±4.82）pg/mL，P均＜0.01］；脂多糖+HMGB1 組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中上述炎癥因子的表達(dá)水平均高于脂多糖組（P均＜0.05），而脂多糖+EGCG 組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中上述炎癥因子的表達(dá)水平較脂多糖組和脂多糖+HMGB1 組下降（P均＜0.05）。以上結(jié)果提示EGCG 有抗炎作用。

2.8 L02 細(xì) 胞 中HMGB1、TLR4、NF-κB p65、NLRP3及焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況 蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果（圖4、表3）顯示，脂多糖組、脂多糖+HMGB1 組 及 脂 多 糖+EGCG 組L02 細(xì) 胞 核 中NF- B p65 的表達(dá)量及細(xì)胞中HMGB1、TLR4、NLRP3、GSDMD、caspase 1、caspase 11、IL-1 、IL-18 的表達(dá)量均較對照組增加（P均＜0.05），脂多糖+HMGB1 組上述蛋白質(zhì)的表達(dá)量較脂多糖組增加（P均＜0.05），而脂多糖+EGCG 組上述蛋白質(zhì)的表達(dá)量較脂多糖組、脂多糖+HMGB1 組下降（P均＜0.05），提示EGCG 可能通過增強HMGB1/TLR4/NF- B/NLRP3 途徑促進肝細(xì)胞焦亡。

表3 各組L02 細(xì)胞中HMGB1、TLR4、NF-κB p65、NLRP3 及焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況Tab 3 Expression of HMGB1, TLR4, NF-κB p65, NLRP3 and pyroptosis-related proteins in L02 cells of each group n＝8, ±s

表3 各組L02 細(xì)胞中HMGB1、TLR4、NF-κB p65、NLRP3 及焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況Tab 3 Expression of HMGB1, TLR4, NF-κB p65, NLRP3 and pyroptosis-related proteins in L02 cells of each group n＝8, ±s

HMGB1: High mobility group protein B1; TLR4: Toll-like receptor 4; NF- B p65: Nuclear factor B p65; NLRP3:Nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3; LPS: Lipopolysaccharide; EGCG: Epigallocatechin gallate;GSDMD: Gasdermin D; caspase: Cysteine aspartic acid specific protease; IL: Interleukin. *P＜0.05, **P＜0.01 vs control group;△P＜0.05, △△P＜0.01 vs LPS group; ▲P＜0.05, ▲▲P＜0.01 vs LPS+HMGB1 group.

Group HMGB1 TLR4 NF- B p65 NLRP3 GSDMD Control 0.052±0.002 0.020±0.001 0.020±0.001 0.016±0.001 0.249±0.026 LPS 0.176±0.007** 0.076±0.003** 0.060±0.001** 0.041±0.004** 0.779±0.022**LPS+HMGB1 0.780±0.020**△△ 0.090±0.002**△△ 0.089±0.002**△△ 0.153±0.009**△△ 1.160±0.042**△△LPS+EGCG 0.138±0.004**△▲▲ 0.044±0.003**△△▲ 0.045±0.001**△△▲▲ 0.024±0.002*△▲▲ 0.514±0.019**△△▲▲F value 3 919.634 1 249.816 2 722.691 1 052.767 1 283.410 P value ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 Group caspase 1 caspase 11 IL-1 IL-18 Control 0.010±0.001 0.051±0.002 0.158±0.011 0.010±0.000 LPS 0.041±0.002** 0.267±0.008** 0.456±0.015** 0.041±0.002**LPS+HMGB1 0.139±0.002**△△ 0.329±0.012**△ 0.605±0.017**△△ 0.139±0.002**△△LPS+EGCG 0.012±0.001*△△▲▲ 0.171±0.007**△△▲▲ 0.334±0.018**△△▲▲ 0.013±0.000**△△▲▲F value 16 251.184 1 569.982 1 061.636 16 152.831 P value ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討 論

膿毒癥可引起多器官功能障礙，肝臟作為一個重要的免疫器官，容易在膿毒癥中發(fā)生損傷。膿毒癥后急性肝損傷與膿毒癥患者的嚴(yán)重程度和預(yù)后密切相關(guān)［3］。CLP 模型被認(rèn)為是膿毒癥研究的首選模型，其通過模擬人類闌尾穿孔使腸內(nèi)容物漏入腹腔形成混合菌群感染，導(dǎo)致革蘭陰性菌相關(guān)的多菌性膿毒癥，該模型具有壞死組織炎癥來源明確、重復(fù)性好、與人類膿毒癥的進展過程相似等特點［9-11］。由于缺乏通用于人類患者的生理監(jiān)測機制，膿毒癥暫無評定標(biāo)準(zhǔn)，常通過實驗組的死亡率來評估膿毒癥的嚴(yán)重程度并調(diào)整需要的動物數(shù)量。有證據(jù)表明血清IL-6 可能是C57/BL6 及BALB/c 小鼠膿毒癥嚴(yán)重程度和死亡的預(yù)測指標(biāo)［10］。本研究術(shù)后24 h CLP 組小鼠的死亡率及血常規(guī)、AST、ALT、IL-6水平的檢測結(jié)果證實膿毒癥后急性肝損傷模型構(gòu)建成功。

EGCG 具有強大的生物活性及抗氧化和抗炎效果，可顯著抑制促炎因子TNF- 、IL-1 、IL-6 的表達(dá)，本實驗對細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HMGB1、TNF- 及IL-6的檢測結(jié)果也證實EGCG 的抗炎作用顯著。研究表明EGCG 對藥物性肝損傷和脂多糖誘導(dǎo)的急性肝損傷均有較好的保護作用［12-13］，然而有關(guān)EGCG 對膿毒癥后急性肝損傷是否有保護作用及可能機制的研究較少。本研究中組織病理學(xué)及血清HMGB1、TNF- 、IL-6、ALT、AST 檢測結(jié)果表明，EGCG 可減輕膿毒癥所致的急性肝損傷，對膿毒癥后急性肝損傷有保護作用。

研究證實細(xì)胞焦亡與膿毒癥后急性肝損傷密切相關(guān)，抑制肝細(xì)胞焦亡可影響CLP 誘導(dǎo)的膿毒癥后急性肝損傷的嚴(yán)重程度［14］。細(xì)胞焦亡是由多種病理因素觸發(fā)并由caspase 家族蛋白介導(dǎo)的炎癥性細(xì)胞死亡，其特點是細(xì)胞膜快速破裂及細(xì)胞內(nèi)促炎物質(zhì)釋放［15-16］。GSDMD 是細(xì)胞焦亡過程中的主要執(zhí)行蛋白，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，是caspase 1/4/5/11的底物［17-18］。病原體入侵宿主時，NLRP3 炎癥小體可直接募集caspase 1 前體，激活的caspase 1 特異性裂解GSDMD，而活化的GSDMD 可與細(xì)胞膜特異性結(jié)合發(fā)揮“打孔”作用，導(dǎo)致IL-1 、IL-18等炎癥因子釋放。caspase 11 可直接識別細(xì)菌脂多糖并與之結(jié)合，而結(jié)合了脂多糖的caspase 11 可發(fā)生水解并直接裂解GSDMD，引發(fā)細(xì)胞焦亡［7,19］。本實驗結(jié)果顯示，CLP 組小鼠肝組織中焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量升高，而在EGCG 干預(yù)后焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量降低，提示細(xì)胞焦亡與膿毒癥后急性肝損傷的發(fā)生密切相關(guān)。

HMGB1 在細(xì)胞核中參與核轉(zhuǎn)錄、重組、DNA復(fù)制和修復(fù)，而在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞外可導(dǎo)致廣泛的炎癥反應(yīng)和多器官功能障礙；HMGB1 還可與TLR4結(jié)合，激活核轉(zhuǎn)錄因子NF- B，進一步增強炎癥反應(yīng)［20］。NF- B 是免疫反應(yīng)和細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化的重要調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，它控制著細(xì)胞因子的產(chǎn)生和細(xì)胞的存活，還在固有免疫反應(yīng)的啟動和隨后促炎介質(zhì)的產(chǎn)生中發(fā)揮著核心作用，而促炎介質(zhì)的產(chǎn)生與釋放會加重器官損傷［8］。研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥常伴有NF- B的激活上調(diào)，抑制NF- B激活可減輕膿毒癥實驗動物的炎癥反應(yīng)，提高其存活率［21］。NF- B 是激活NLRP3 炎癥小體和焦亡的關(guān)鍵因子，調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體的激活可影響小鼠的細(xì)胞焦亡水平，例如在非小細(xì)胞肺癌中，重樓皂苷Ⅵ（polyphyllin Ⅵ）通過活性氧/NF- B/NLRP3/GSDMD信號通路誘導(dǎo)caspase 1 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡［22］。輔酶Q10 聯(lián)合七葉皂苷可通過HMGB1/TLR4/NF- B p65/NLRP3信號通路抑制NLRP3 炎癥小體的激活和細(xì)胞焦亡，預(yù)防膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷［23］。本實驗結(jié)果顯示，使用不同質(zhì)量濃度的EGCG 調(diào)低HMGB1 水平后，小鼠肝組織中TLR4、NF- B p65、NLRP3 及焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平均較CLP 組降低，表明EGCG對膿毒癥后急性肝損傷的保護作用可能與通過減弱HMGB1/TLR4/NF- B/NLRP3途徑降低肝細(xì)胞焦亡有關(guān)。為了進一步證明這一結(jié)論，本實驗進行了體外實驗，利用脂多糖誘導(dǎo)L02 細(xì)胞建立膿毒癥后急性肝損傷細(xì)胞模型，實驗結(jié)果顯示增加HMGB1 水平后細(xì)胞中TLR4、NF- B p65、NLRP3 及焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量均增加。

綜上所述，EGCG 對膿毒癥后急性肝損傷有保護作用，其作用機制可能與通過減弱HMGB1/TLR4/NF- B/NLRP3途徑減輕肝細(xì)胞焦亡有關(guān)。這一結(jié)論或許可為將來探索膿毒癥后急性肝損傷的治療方法提供新的方向。