陳秋竹，黃春青，曹桂紅，何劼毅

(貴州省食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 貴陽(yáng) 550004)

0 引言

依托泊苷注射液為無(wú)色至淡黃色澄明液體，主要成份為依托泊苷。依托泊昔注射液由北京制藥工業(yè)研究所于20世紀(jì)70年代后期研究成功，依托泊苷(Etoposide,ETP)是植物成分鬼臼毒素的糖代謝衍生物[1]，是一種廣泛應(yīng)用的拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑類化療藥物[2]，主要用于治療小細(xì)胞肺癌[3]、惡性淋巴瘤[4]、惡性生殖細(xì)胞瘤[5]、白血病[6-7]，對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤[8]、橫紋肌肉瘤[9]、卵巢癌[10]、非小細(xì)胞肺癌[11]、胃癌[12]和食管癌[13]等也有一定療效。依托泊苷注射液現(xiàn)收載于中國(guó)藥典2020年版二部[14]，美國(guó)藥典及歐洲藥典均對(duì)原料藥有收載[15-16]。貴州省食品藥品檢驗(yàn)所承擔(dān)了2013年依托泊苷注射液的評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)工作，在檢驗(yàn)及探索性研究中發(fā)現(xiàn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)存在問題，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)含量測(cè)定采用的色譜條件會(huì)使依托泊苷主峰和注射劑輔料苯甲醇的降解產(chǎn)物苯甲醛重合，導(dǎo)致依托泊苷含量增加，給樣品的質(zhì)量評(píng)價(jià)帶來(lái)偏差。

本文采用的梯度洗脫方法能把測(cè)定依托泊苷、苯甲醇、苯甲醛峰較好地分開，能準(zhǔn)確測(cè)定各自含量，真實(shí)反映依托泊苷的實(shí)際含量，對(duì)依托泊苷注射液的含量測(cè)定、輔料用量及藥品質(zhì)量提供較好地參考依據(jù)。

1 儀器與試劑

Thermo U3000 高效液相色譜儀；Waters X-Bridge C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；Mettler TOLEDO XS205型精密電子天平。依托泊苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100388-200401，含量以97.4%計(jì))、苯甲醇對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)190019-201301，含量以99.8%計(jì))、苯甲醛對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111650-200802 ，含量以99.7%計(jì))。依托泊苷注射液共17批，來(lái)自2家生產(chǎn)企業(yè)，均為國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)樣品(標(biāo)示量為2 mL∶40 mg)。乙腈(色譜純，生產(chǎn)廠家：美國(guó)天地有限公司)、無(wú)水甲酸(分析純，生產(chǎn)廠家：天津市福晨化學(xué)試劑廠)、三乙胺(色譜純，生產(chǎn)廠家：西亞化學(xué)科技(山東)有限公司)，水為Milli-Q純水機(jī)制備。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜條件：采用 C184.6 mm×250 mm色譜柱，以無(wú)水甲酸-三乙胺-水(1∶1∶998，V∶V∶V)為流動(dòng)相A，無(wú)水甲酸-三乙胺-乙腈(1∶1∶998，V∶V∶V)為流動(dòng)相B，梯度洗脫(0～15 min，80%A；15～30 min，80%→56%A；30～40 min，56%A；40～42 min，56%→40%A；42～45 min，40%A；45～47 min，40%→80%A；47～50 min，80%A)，流速控制為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)λ=254 nm，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣體積為20 μL。

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：依托泊苷、苯甲醇、苯甲醛的理論板數(shù)均應(yīng)不低于3 000，分離度均應(yīng)大于1.5(見圖1)。

圖1 液相色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液

精密稱取依托泊苷、苯甲醇、苯甲醛對(duì)照品各適量，用混合溶劑(流動(dòng)相A-流動(dòng)相B(80∶20))溶解并稀釋制成每1 mL中各含濃度為0.204 15 mg、0.244 79 mg、0.004 59 mg的溶液，分別作為依托泊苷、苯甲醇、苯甲醛的對(duì)照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液

精密量取本品1 mL，置100 mL量瓶中，用混合溶劑稀釋制成每1 mL中含0.2 mg的溶液，即得。

3 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1 線性方程

3.1.1 依托泊苷線性關(guān)系

精密稱取依托泊苷對(duì)照品10.48 mg，置50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相A-流動(dòng)相B(80∶20)的混合溶劑稀釋至刻度，搖勻，精密吸取5 mL分別置100 mL、50 mL、25 mL、10 mL容量瓶中，加混合溶劑至刻度，搖勻，作為線性1、線性2、線性3、線性4溶液，母液作為線性5溶液；再精密稱取依托泊苷對(duì)照品21.39 mg，置10 mL容量瓶中，用混合溶劑稀釋至刻度，搖勻，精密吸取2 mL置5 mL、容量瓶中，加混合溶劑至刻度，搖勻，作為線性6溶液。分別精密吸取上述6種溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見表1、圖2)。

3.1.2 苯甲醇線性關(guān)系

精密稱取苯甲醇對(duì)照品10.22 mg，置25 mL容量瓶中，用流動(dòng)相A-流動(dòng)相B(80∶20)的混合溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為母液。精密量取母液1 mL分別置25 mL、10 mL、5 mL容量瓶中，加混合溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為線性1、線性2、線性3溶液，再精密量取母液3 mL置10 mL和5 mL容量瓶中，加混合溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為線性4和線性5溶液，母液作為線性6溶液。分別精密吸取上述6種溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見表1、圖2)。

3.1.3 苯甲醛線性關(guān)系

精密吸取苯甲醛對(duì)照品溶液(0.114 85 mg/mL)1 mL分別至10 mL、25 mL、100 mL量瓶中，用流動(dòng)相A-流動(dòng)相B(80∶20)的混合溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為線性4、線性5、線性6溶液，再精密吸取線性4溶液5 mL分別置50 mL、25 mL、10 mL量瓶中,用流動(dòng)相A-流動(dòng)相B(80∶20)的混合溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為線性1、線性2、線性3溶液。分別精密吸取上述6種溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見表1、圖2)。

表1 3個(gè)成分的回歸方程及線性范圍

圖2 依托泊苷(A)、苯甲醇(B)和苯甲醛(C)標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 檢出下限和定量下限

將“3.1.1”項(xiàng)下的3種對(duì)照品的線性儲(chǔ)備溶液稀釋至不同濃度，進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比3∶1為檢測(cè)限(LOD)、10∶1為定量限(LOQ)，測(cè)定結(jié)果見表1。

3.3 精密度試驗(yàn)

取“3.1.1”項(xiàng)下的依托泊苷、苯甲醇、苯甲醛對(duì)照品溶液各連續(xù)進(jìn)樣6次，依托泊苷、苯甲醇及苯甲醛峰面積平均值分別為28.41、4.76、7.40，RSD值分別為0.4%、0.6%和0.9%，表明方法精密度良好(見表2)。

表2 精密度測(cè)定結(jié)果表

3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取同一批號(hào)的依托泊苷注射液6份各1 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)得依托泊苷、苯甲醇及苯甲醛的含量平均值分別為20.03 mg/mL、27.85 mg/mL、0.033 1 mg/mL，RSD分別為0.3%、0.2%、1.7%，表明方法重復(fù)性良好(見表3)。

表3 重復(fù)性測(cè)定結(jié)果表

3.5 穩(wěn)定性試液

取“3.4”項(xiàng)下同一供試品溶液，分別于0 h、6 h、12 h、18 h測(cè)得峰面積，結(jié)果依托泊苷、苯甲醇、苯甲醛峰面積的RSD分別為0.3%、0.3%、0.6%，表明供試品溶液12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好(見表4)。

表4 穩(wěn)定性結(jié)果表

3.6 回收率試驗(yàn)

精密吸取依托泊苷注射液樣品1 mL，共18份，精密加入依托泊苷、苯甲醇、苯甲醛質(zhì)量濃度分別為1.425 9 mg/mL、1.996 5 mg/mL、0.002 55 mg/mL的對(duì)照品溶液各15 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法平行制得依托泊苷、苯甲醇、苯甲醛的回收率試驗(yàn)溶液各6份，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果依托泊苷、苯甲醇、苯甲醛的平均回收率分別為99.9%、100.7%、98.8%，RSD為0.7%、1.1%、3.4%(見表5)。

表5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3.7 樣品測(cè)定

取17批依托泊苷注射液樣品，分別按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見表6。

表6 依托泊苷注射液中3個(gè)成分的含量測(cè)定結(jié)果

4 討論與分析

依托泊苷注射液現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國(guó)藥典》2020年版二部，采用苯基柱，以乙腈-醋酸鹽緩沖液(pH 4.0)(30∶70)為流動(dòng)相等度洗脫，該方法使苯甲醛峰與依托泊苷峰無(wú)法分開，出現(xiàn)包裹現(xiàn)象，導(dǎo)致依托泊苷含量偏高，其苯甲醛是制劑輔料苯甲醇氧化后的產(chǎn)物[17]，現(xiàn)行含量測(cè)定方法使得添加了苯甲醇輔料的某些廠家生產(chǎn)的依托泊苷注射液含量測(cè)定值比其真實(shí)值偏高。故本文參考《中國(guó)藥典》和《美國(guó)藥典》中依托泊苷注射液有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下的色譜條件[14-15]，綜合文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)依托泊苷有關(guān)物質(zhì)的研究[18-20]，我們對(duì)依托泊苷注射液含量測(cè)定的色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，改進(jìn)了色譜柱和流動(dòng)相，采用梯度洗脫方法，能將依托泊苷和輔料苯甲醇及其氧化產(chǎn)物苯甲醛分開并定量，使得該品種的含量測(cè)定結(jié)果更準(zhǔn)確和科學(xué)。

色譜圖中發(fā)現(xiàn)苯甲醇對(duì)照品含有苯甲醛峰，故本文在測(cè)定加標(biāo)回收率時(shí)需分開測(cè)定苯甲醇和苯甲醛的回收率。因依托泊苷注射液標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，該波長(zhǎng)同時(shí)也是苯甲醛的最大吸收波長(zhǎng)，故苯甲醛的響應(yīng)大。若用藥典標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定含量，使得苯甲醛增加的峰面積被當(dāng)做依托泊苷峰面積，使得微量的苯甲醛導(dǎo)致較大的依托泊苷含量增加。故我們制定的能將依托泊苷和苯甲醛分開的方法是必要且有意義的。

本實(shí)驗(yàn)建立了采用HPLC-DAD同時(shí)測(cè)定依托泊苷注射液中3個(gè)成分含量的方法，該方法準(zhǔn)確、可靠、便捷，能準(zhǔn)確測(cè)定制劑中依托泊苷的含量，剔除輔料及雜質(zhì)的干擾，為客觀評(píng)價(jià)依托泊苷注射液質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)，具有一定的應(yīng)用價(jià)值和實(shí)用意義。