司曉喜，董岳峰，楊 怡，張雪花，趙 楊，劉志華，李振杰，許志剛*

(1.云南煙草化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南 昆明 650231；2. 昆明理工大學(xué) 理學(xué)院，云南 昆明 650500)

0 引言

糖精鈉是一種常用于食品工業(yè)的人造甜味劑，具有悠久的使用歷史，但它也是最具爭議的合成甜味劑之一。它可使人食欲減退、低齡人群長期食用導(dǎo)致營養(yǎng)不良、短期大量使用還可能引發(fā)中毒等[1-2]。在我國食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)中(GB 2760-2014)，對(duì)食品中糖精鈉的使用量進(jìn)行了限制，食品中糖精鈉的添加量的范圍在0.15～5.0 g/kg之間[3]。未按照國家標(biāo)準(zhǔn)使用，或?yàn)E用，亦或者食品制造商隱瞞消費(fèi)者擅自以糖精鈉作為替代品添加到食物中，都有極大可能對(duì)人體健康造成損害，尤其是正處于生長發(fā)育期的青少年。

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.28-2016[4]中詳細(xì)介紹了包括糖精鈉在內(nèi)的3種食品添加劑的測(cè)定方法，有液相色譜法和氣相色譜法。另外，還有文獻(xiàn)報(bào)道了其他類型的檢測(cè)方法，如薄層色譜法[5]、離子選擇電極測(cè)定法[6]、滴定法[7]、HPLC-MS聯(lián)用[8]、分光光度法[9]等方法。其中最普遍、使用最廣泛的方法是高效液相色譜法，該方法具有簡單快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)[10-13]。本文采用高效液相色譜法對(duì)糖精鈉進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)色譜分離條件進(jìn)行了優(yōu)化，所建立的分析方法能有效測(cè)定飲料中糖精鈉的含量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國戴安公司)，配備DAD檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器；YMC-Pack CN色譜柱(250 mm×4.6 mmI.D.，S-5 μm，12 μm，YMC公司)；Innoval Neo XD C18色譜柱(250 mm×4.6 mmI.D.，5 μm，天津博納艾杰爾公司)；HILIC色譜柱(150 mm×4.6 mmI.D.，5 μm，天津博納艾杰爾公司)；PS-10A超聲波清洗機(jī)(深圳市潔康洗凈電器有限公司)。

乙酸銨(98%，西隴化工股份有限公司)；乙腈(色譜純，薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司)；糖精鈉(98%，阿拉丁試劑上海公司)；實(shí)驗(yàn)用水均為娃哈哈純凈水；飲料樣品購于昆明當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理方法

準(zhǔn)確移取實(shí)際樣品100 μL于比色管中(汽水樣品需經(jīng)過超聲脫氣)，用純水稀釋定容至10 mL，超聲混合均勻10 min后，用5 mL注射器吸取一定量溶液，經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾后裝入液相小瓶，通過高效液相色譜儀進(jìn)樣測(cè)定。每組樣品平行測(cè)定3份。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取0.05 g的糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)品，置于50 mL比色管中，以純水為溶劑，配置成濃度為1 000 mg/L的母液。采用逐級(jí)稀釋法配制成濃度為0.01 mg/L，0.05 mg/L，0.1 mg/L，0.5 mg/L，1.0 mg/L，2.0 mg/L，5.0 mg/L，10 mg/L和20 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過高效液相色譜儀進(jìn)行定量分析。

1.2.3 色譜分析方法

采用Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀檢測(cè)糖精鈉，流動(dòng)相為乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液，檢測(cè)波長為230 nm，進(jìn)樣量為20 μL，對(duì)色譜柱的類型、流動(dòng)相的配比，流速和柱溫等色譜條件進(jìn)行優(yōu)化。在最佳色譜條件下測(cè)定實(shí)際樣品中糖精鈉的含量，并進(jìn)一步進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)濃度分別為0.5 mg/L、5.0 mg/L、15 mg/L，計(jì)算其加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

C18柱、HILIC柱和CN柱均對(duì)糖精鈉有一定的分離能力，分別采用3種類型的色譜柱對(duì)糖精鈉進(jìn)行分離測(cè)定。結(jié)果如圖1所示，糖精鈉在C18柱上的色譜峰型出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象，而在HILIC柱和CN柱上可以得到較好的色譜峰型，但糖精鈉在HILIC柱上出峰時(shí)間過早，與溶劑峰非常接近。而在CN柱上可以得到一個(gè)較合適的保留時(shí)間和較好的色譜峰型。因此，采用CN柱進(jìn)行色譜分析。

圖1 不同色譜柱對(duì)糖精鈉的分離效果的色譜圖

2.1.2 流動(dòng)相配比的優(yōu)化

糖精鈉極性較強(qiáng)，在CN柱上保留效果較強(qiáng)，且保留時(shí)間合適。當(dāng)流動(dòng)相中乙腈和0.02 mol/L乙酸銨溶液的比例由20∶80(V∶V)向5∶95(V∶V)逐漸變化時(shí)，結(jié)果如圖2所示，出峰時(shí)間不斷增大，整體峰展寬也逐漸增大，但目標(biāo)峰峰面積變化不大。在流動(dòng)相比例為15∶85(V∶V)時(shí)，色譜峰型最好，出峰時(shí)間適中，目標(biāo)峰與溶劑雜峰有較好的分離。因此，選擇流動(dòng)相中乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液的比例為15∶85(V∶V)。

圖2 流動(dòng)相配比對(duì)糖精鈉分離影響的色譜圖

2.1.3 流速的優(yōu)化

在CN色譜柱下，以比例為15∶85(V∶V)的乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液為最佳流動(dòng)相，探究流速對(duì)糖精鈉分離的影響。結(jié)果如表1和圖3所示，當(dāng)流速由0.4 mL/min向0.9 mL/min變化時(shí)，出峰時(shí)間不斷提前，峰面積不斷減小，峰展寬也不斷減小，但柱壓隨流速的增大而逐漸增大。在流速為0.6 mL/min時(shí)，峰面積較大，出峰時(shí)間適中，峰展寬較小，且柱壓適中。因此，選擇0.6 mL/min為最佳流速。

表1 流速對(duì)糖精鈉分離的影響

圖3 流速對(duì)糖精鈉分離影響的色譜圖

2.1.4 柱溫的優(yōu)化

在以上最優(yōu)條件下，進(jìn)一步進(jìn)行柱溫的優(yōu)化?？紤]到CN柱的使用環(huán)境，以20 ℃為最低溫度，柱溫由20 ℃向35 ℃變化。結(jié)果如圖4所示，在不同溫度下出峰時(shí)間變化不大，峰面積變化也不大，但峰展寬隨溫度升高先減小后增大，柱壓隨柱溫的升高而逐漸減小。當(dāng)柱溫為25 ℃時(shí)，色譜峰型較好，峰展寬較小。因此，選擇25 ℃為最佳色譜柱溫。

圖4 柱溫對(duì)糖精鈉分離影響的色譜圖

2.2 線性方程、檢出限、定量限

采用逐級(jí)稀釋法配制了一系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。通過高效液相色譜儀進(jìn)行定量分析。以糖精鈉的濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積(mAU)為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為Y=0.80X+0.33，r=0.999 79，糖精鈉在0.01～20 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。檢出限(S/N=3)為0.003 3 mg/L，定量限(S/N=10)為0.010 mg/L。

2.3 實(shí)際樣品分析及加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

對(duì)從市面上隨機(jī)購買的4種飲料進(jìn)行分析檢測(cè)，先按照1.2.1的實(shí)際樣品前處理方法進(jìn)行樣品處理，再通過高效液相色譜進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果如表2所示，在4種飲料中均檢出了糖精鈉，檢出濃度在1.68～20.25 mg/L之間。

表2 實(shí)際樣品中糖精鈉的含量及加標(biāo)回收率(n=3)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證方法的適用性，在上述樣品分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。在飲料樣品中添加一定量的糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品的加標(biāo)濃度分別為0.5 mg/L、5 mg/L、15 mg/L，平行測(cè)定3組。實(shí)際樣品分析色譜圖如圖5所示，目標(biāo)峰與雜質(zhì)干擾峰有較好的分離，且分析時(shí)間短、效率高?？鄢镜字岛蟮募訕?biāo)回收率在70.37%～124.10%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.19%～9.39%之間。

圖5 實(shí)際樣品色譜圖

3 結(jié)論

糖精鈉是一種人造甜味劑，對(duì)人體無營養(yǎng)價(jià)值。當(dāng)食用較多時(shí)，會(huì)影響腸胃消化酶的正常分泌，降低小腸的吸收能力，使人食欲減退。許多國家都限制了糖精鈉在食品加工中的使用量。但在生產(chǎn)經(jīng)營活動(dòng)中，少數(shù)企業(yè)為了片面追求產(chǎn)品的甜度、色澤或延長產(chǎn)品保質(zhì)期，擅自違法過量使用糖精鈉等食品添加劑，對(duì)人體健康構(gòu)成了潛在的威脅。本文采用高效液相色譜法測(cè)定不同飲料中的糖精鈉，測(cè)得飲料中糖精鈉的濃度在1.68～20.25 mg/L之間，所測(cè)飲料中糖精鈉的含量均符合國家食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)。