劉繼軒，蘭翔，趙曉靜，許振國(guó)，賈倩，孫志軍，何昆侖

心力衰竭（心衰）是由各種病因引起的特征為心排血量減低和室壁張力增高的臨床綜合征，對(duì)循環(huán)的影響為動(dòng)脈系統(tǒng)血流減少而靜脈系統(tǒng)血流淤積。盡管隨著人們對(duì)心衰機(jī)制認(rèn)識(shí)的加深，對(duì)心衰的臨床管理逐步優(yōu)化，但心衰仍是導(dǎo)致死亡的主要原因之一，且其病因研究尚不充分[1,2]。因此迫切需要對(duì)心衰的發(fā)生、發(fā)展的新認(rèn)識(shí)去改變這一現(xiàn)狀。腸道菌群和心衰的相關(guān)性是目前研究熱點(diǎn)之一[3-7]。然而，既往對(duì)腸道菌群和心衰相關(guān)性的研究多將失代償?shù)幕驀?yán)重心衰患者作為實(shí)驗(yàn)組，而對(duì)照組為完全健康的患者，在對(duì)心衰患者發(fā)生發(fā)展的觀察中，缺失了心衰B期（HFB）及存在心臟結(jié)構(gòu)功能異常，但并未出現(xiàn)心衰癥狀的患者。我們?cè)诒狙芯恐屑尤際FB的患者進(jìn)行觀察，并與嚴(yán)重心衰患者及相對(duì)健康的患者比較，探索腸道菌群結(jié)構(gòu)及功能的變化出現(xiàn)在心衰發(fā)展的具體階段，嘗試解釋腸道菌群和心衰發(fā)生發(fā)展的因果關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選取2018年3月至2018年6月于中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院心血管內(nèi)科連續(xù)住院的心力衰竭C期或D期的患者25例[平均年齡（60.31±11.62）歲，男性15例]，根據(jù)年齡、性別及冠心病病因進(jìn)行1:1匹配同期住院的心衰B期及心衰A期（HFA）的患者各25例。心衰分期標(biāo)準(zhǔn)參考最新修訂的美國(guó)心臟病協(xié)會(huì)慢心衰管理指南。其他納入標(biāo)準(zhǔn)包括：①年齡≥18歲；②漢族；③低鹽低脂飲食；④入院3 d內(nèi)自主排大便。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：①急性冠脈綜合征；②近1月口服抗生素和/或益生菌；③惡液質(zhì)；④懷孕；⑤拒絕簽署參與本觀察性研究知情同意書(shū)。

1.2 方法根據(jù)患者的心衰分期進(jìn)行分組，心衰C期或D期組（HFCD），即存在心臟結(jié)構(gòu)及功能異常且有心衰癥狀或體征； HFB組，即存在心臟結(jié)構(gòu)及功能異常但無(wú)心衰臨床表現(xiàn)； HFA組，即有高血壓、冠心病等發(fā)生心衰的危險(xiǎn)因素，但沒(méi)有結(jié)構(gòu)性心臟病和心衰的癥狀。比較各組間臨床指標(biāo)及菌群組成的差異。研究方案設(shè)計(jì)通過(guò)中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，所有研究對(duì)象均簽署研究知情同意書(shū)。

通過(guò)電子病歷系統(tǒng)形式收集研究對(duì)象人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征，既往病史，個(gè)人史及一般檢查化驗(yàn)結(jié)果。收集患者入院后第一自主排便便標(biāo)本，后對(duì)便標(biāo)本進(jìn)行DNA提取后擴(kuò)增V3~V4區(qū)域16sRNA基因。按照Cutadapt（V1.9.1，http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/）對(duì)16sRNA基因進(jìn)行質(zhì)量控制，參考Silva Database（https://www.arb-silva.de/）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)相似性大于97%的序列進(jìn)行OTUs分配，用Uparse（V7.0.1001，http://drive5.com/uparse/）及MUSCLE software（Version 3.8.31，http://www.drive5.com/muscle/）軟件進(jìn)行序列分析。參考京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）途徑，對(duì)細(xì)菌代謝功能進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3 觀察指標(biāo)包括：①人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征[年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)（BMI）]，合并癥（高血壓、糖尿病、高脂血癥及冠心?。?，個(gè)人行為（吸煙、飲酒），用藥情況及心功能相關(guān)指標(biāo)[射血分?jǐn)?shù)，N末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）水平]組成的臨床指標(biāo)；②使用Quantitative Insights in Microbial Ecology（QIIME v.1.8.0）對(duì)16S rRNA基因序列進(jìn)行分析和處理，并對(duì)每個(gè)樣品序列進(jìn)行質(zhì)量控制、序列進(jìn)行糾錯(cuò)、嵌合體去除。進(jìn)而，所有剩余序列以97%的序列相似性聚類到OTU中，選擇每個(gè)OTU最豐富的序列作為代表序列并生成OTU表以進(jìn)行后續(xù)分析。采用Observedspecies，Chao1，Shannon，Simpson，幾種不同的α多樣性指數(shù)，以表征樣品中物種分布的多樣性和均勻度，并直觀展示測(cè)序深度和數(shù)據(jù)量情況；主要采用的是加權(quán)和非加權(quán)的算法計(jì)算β多樣性，評(píng)價(jià)組間多樣性差異；菌群分類差異及菌群代謝功能預(yù)測(cè)的菌群組成指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析分類變量使用百分比（%）表示，連續(xù)變量為正態(tài)分布時(shí)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示，非正態(tài)分布時(shí)采用中間值（第25和第75百分位）表示。采用單因素方差分析比較正態(tài)分布和方差齊性的連續(xù)數(shù)據(jù)，否則采用Mann-Whitney檢驗(yàn)。分類數(shù)據(jù)經(jīng)χ2分析比較。采用Wilcox檢驗(yàn)通過(guò)分類操作單元（OTU）、Chao1，Shannon，Simpson 和 PD_whole_tree這5個(gè)指數(shù)比較α多樣性差異。采用QIIME軟件（Version 1.9.1）分析比較組間β多樣性差異。使用Kruskal Wallis檢驗(yàn)在門、屬和種三個(gè)級(jí)別上的菌群種分類差異。所有數(shù)據(jù)均采用R軟件（Version 2.15.3）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)評(píng)估均假設(shè)在5%顯著性水平下進(jìn)行雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者臨床特征比較每個(gè)心衰分期分別納入25例患者，按照年齡、性別及冠心病病因進(jìn)行1:1匹配，因此各組間年齡、性別及冠心病病因組成無(wú)差異。在除冠心病外的其他心臟病危險(xiǎn)因素比例方面，包括吸煙、高血壓、2型糖尿病及高血脂各組間均無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05），表1。各組間一般臨床情況，包括BMI（P=0.834），靜息血壓（收縮壓P=0.484，舒張壓P=0.456）、心率水平（P=0.196），及表示腎功能的血清肌酐水平（P=0.175）方面均無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在有關(guān)心衰嚴(yán)重程度的指標(biāo)紐約心臟病協(xié)會(huì)（NYHA）分級(jí)方面及反應(yīng)心衰嚴(yán)重程度的指標(biāo)，NT-proBNP各組間差異顯著，HFCD組顯著高于HFA及HFB組（P＜0.001）。在用藥方面，各組間使用阿司匹林、氯吡格雷、他汀、硝酸酯、血管緊張素受體阻滯劑（ARB）、β受體阻滯劑及華法林的用藥比例均無(wú)顯著差異。在心衰程度更嚴(yán)重的HFCD組中，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）和利尿劑的使用比例更高（P＜0.001）而鈣離子阻斷劑（CCB）類藥物使用比例更低（P=0.002），表1。

表1 不同心衰階段分組的臨床特征的組間比較

2.2 患者腸道菌群的α及β多樣性從表示α多樣性的指標(biāo)中，我們發(fā)現(xiàn)HFA組與HFCD組在Chao1（P=0.005），OUT（P=0.018）及PD_whole_tree（P=0.011）這三個(gè)指數(shù)上存在顯著差異，提示HFA組的α多樣性優(yōu)于HFCD組（圖1）。此外雖然HFA組與HFB組，及HFB組和HFCD組雖然在組間未觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異，但在Chao1，OUT及PD_whole_tree這三個(gè)指數(shù)上可觀察到從HFA組到HFB組，及HFB組到HFCD組一致的α多樣性下降趨勢(shì)。

圖1 多指標(biāo)箱式圖顯示各組間α多樣性的差異

關(guān)于β多樣性，PCoA-Unweighted Unifrac分析顯示，在據(jù)所有臨床因素進(jìn)行調(diào)整之后，我們根據(jù)心衰分期進(jìn)行的分組的患者之間β多樣性存在顯著差異（R2=0.073，P＜0.001），并且我們的心衰分期分組是對(duì)基質(zhì)分布的影響最為顯著的因素，圖2。

圖2 PCoA-Unweighted Unifrac分析顯示各組間β多樣性的差異

2.3 菌群分類和功能預(yù)測(cè)差異分析我們?cè)趯偎缴蠈?duì)各組間腸道菌群相對(duì)豐度的差異分析發(fā)現(xiàn)，HFB組噬膽菌屬（Bilophia）的相對(duì)豐度顯著高于HFA組（P=0.011）。同時(shí)，HFB組的解琥珀酸菌屬（Succiniclasticum）（P=0.011）和多爾氏菌屬（Dorea）的相對(duì)豐度水平顯著降低。與HFCD組相比，HFA組的瘤胃球菌屬（Ruminococcus）相對(duì)豐度顯著增加，而噬膽菌屬、韋榮氏球菌屬、Flavonifractor和考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）豐度顯著減少。HFB組與HFCD組之間在各菌群屬水平上無(wú)顯著性差異，圖3。

圖3 各組間菌群在屬水平相對(duì)豐度的差異

此外，我們參考京都基因和基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEEG）途徑對(duì)各組菌群功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示各組間在多種代謝功能方面存在顯著差異，且在在HFA組和HFB組間即可觀察到5種代謝功能的差異，圖4。

圖4 森林圖顯示HFA組和HFB組在基于KEEG途徑對(duì)組間菌群預(yù)測(cè)代謝功能的差異

3 討論

腸道菌群對(duì)人體的影響及其與各種疾病間的相關(guān)性近些年成為臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。機(jī)制研究顯示腸道中脂多糖釋放增加，引發(fā)炎癥信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，對(duì)心血管疾病的進(jìn)展產(chǎn)生不利影響；腸道微生物也可能增強(qiáng)能量和脂肪收集的能力，增加心臟的風(fēng)險(xiǎn)和負(fù)擔(dān)[8]。在基礎(chǔ)理論支持上，諸多研究者開(kāi)始關(guān)注腸道菌群和心血管疾病之間的關(guān)系，這些心血管疾病包括高血壓[9-11]、腦卒中[12]、冠心病[13]等。

既往研究心衰患者中觀察到了腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化，但既往研究多為橫斷面研究，腸道菌群結(jié)構(gòu)變化和心衰發(fā)生發(fā)展的因果關(guān)系尚不明確[3-7,14-17]。一方面因心衰造成的腸道動(dòng)脈系統(tǒng)的缺血和靜脈系統(tǒng)淤血，引起腸道粘膜功能和通透性改變，腸道的氧氣和能量供應(yīng)不足，最終導(dǎo)致腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變[18]。另一方面，腸道菌群抗原脂多糖和腸道菌群代謝產(chǎn)物三甲胺從腸道中往循環(huán)系統(tǒng)遷移，造成了全身的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)了心衰的發(fā)生發(fā)展[19]。

值得注意的是，心衰一種慢性進(jìn)展性的疾病，美國(guó)心臟協(xié)會(huì)指南對(duì)心衰的分期著重強(qiáng)調(diào)了心衰分期的不可逆性[20]。然而，既往對(duì)腸道菌群和心衰相關(guān)性的研究總是將失代償?shù)幕蛘邍?yán)重的心衰患者作為實(shí)驗(yàn)組，而對(duì)照組為完全健康的患者，在對(duì)心衰患者發(fā)生發(fā)展的觀察中，缺失了HFB及存在心臟結(jié)構(gòu)功能異常，但并未出現(xiàn)心衰癥狀的患者。從邏輯關(guān)系上講，如果腸道菌群是心衰竭發(fā)生發(fā)展的病因的話，不僅應(yīng)在HFA與HFCD的患者中發(fā)現(xiàn)腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異，還應(yīng)在心衰的初始從A期到B期的發(fā)展中觀察到差異。我們的研究結(jié)果從一定程度上支持了腸道菌群的變化病因說(shuō)。觀察到了從HFA和HFB的患者即開(kāi)始出現(xiàn)腸道菌群α、β多樣性的差異，考慮腸道菌群的代謝及功能分類在屬水平及區(qū)域趨于一致，因此僅把屬水平的差異分析結(jié)果放入本文。在特定菌群和菌群預(yù)測(cè)功能上同樣開(kāi)始出現(xiàn)差異。此外在差異菌屬中噬膽菌屬通過(guò)參與三甲胺代謝影響心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[21]，與之前關(guān)于三甲胺預(yù)測(cè)心血管疾病結(jié)局的研究相呼應(yīng)[22]，提示這一菌屬的變化可能預(yù)示心衰進(jìn)展。

總的來(lái)講，本研究發(fā)現(xiàn)了心衰的分期和腸道菌群組成相關(guān)性，在一定程度支持腸道菌群的變化為心衰進(jìn)展的原因。然而本研究依然為單中心橫斷面研究，證據(jù)等級(jí)有限。目前已經(jīng)有注冊(cè)的前瞻性臨床研究去評(píng)估針對(duì)腸道微生物群的藥物對(duì)射血分?jǐn)?shù)降低的心衰穩(wěn)定患者左心室功能、生活質(zhì)量和功能能力以及對(duì)炎癥標(biāo)志物的影響[23]，但該試驗(yàn)尚未完成，期待更多的前瞻性研究來(lái)驗(yàn)證腸道菌群和心衰的因果關(guān)系。