翁潔瓊，原夢(mèng)飛，姚婷婷，張晶芳，沈曉旭

心力衰竭（心衰）是臨床常見的危重癥，是各種心血管疾病發(fā)展的終末階段[1]，其中舒張性心力衰竭，即射血分?jǐn)?shù)保留的心力衰竭（HFpEF）占心衰的50%，舒張性心力衰竭的特點(diǎn)是具有心衰相應(yīng)的臨床表現(xiàn)，如疲勞和運(yùn)動(dòng)不耐受，但射血分?jǐn)?shù)正?；蚪咏＃ǎ?0%）[2,3]。HFpEF住院后5年死亡率約50%~75%[4]，目前缺乏有效治療降低HFpEF患者的住院率和死亡率，HFpEF所涉及病理生理機(jī)制復(fù)雜，目前尚不明確，新型療法仍在探索中[5-7]，精確的靶向藥物或許可提供更佳的治療方式，靶向HFpEF藥物的相關(guān)研究是心血管研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)之一，故本文基于蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)篩選舒張性心力衰竭的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因，為后續(xù)研究提供參考方向。

1 資料與方法

1.1 篩選靶點(diǎn)基因以“Heart failure with preserved ejection fraction”為關(guān)鍵詞，在 GeneCard數(shù)據(jù)庫(kù)（人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)）（https://www.genecards.org）中篩選出舒張性心力衰竭的相關(guān)靶點(diǎn)基因。

1.2 篩選關(guān)鍵通路KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫(kù)是最常用的生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)之一，其中KEGG通路數(shù)據(jù)庫(kù)是其核心，運(yùn)用R語(yǔ)言（https://www. r-project.org/)相關(guān)數(shù)據(jù)包，基于所篩選的舒張性心力衰竭靶點(diǎn)基因，通過(guò)KEGG富集分析得到舒張性心力衰竭P-adjust value＜0.01的關(guān)鍵信號(hào)通路。

1.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)篩選富集在關(guān)鍵信號(hào)通路的非冗余基因，從中再次篩選非冗余高頻次（出現(xiàn)頻率≥5）基因，將非冗余基因和高頻次非冗余基因分別上傳到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https://stringdb.org），限定物種為“Homo sapiens”，獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)基因之間的蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)及相關(guān)數(shù)據(jù)文件。

1.4 核心靶點(diǎn)基因篩選通過(guò)Cytoscape計(jì)算非冗余基因及高頻次非冗余基因網(wǎng)絡(luò)圖中的“度”，分別篩選出兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖中度值前5%的關(guān)鍵核心基因。

1.5 基因本體（GO）富集分析GO（Gene Ontology）是一個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類系統(tǒng)，主要包括分子功能（Molecular Function）、細(xì)胞組成（Cellular Component）、生物過(guò)程（Biological Process）。運(yùn)用R語(yǔ)言相關(guān)數(shù)據(jù)包，限定物種為“Homo sapiens”，對(duì)舒張性心力衰竭關(guān)鍵核心基因進(jìn)行GO功能富集分析，分析核心基因涉及的生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能。

2 結(jié)果

2.1 篩選關(guān)鍵通路以“Heart failure with preserved ejection fraction”為關(guān)鍵詞，從Genecard數(shù)據(jù)庫(kù)中共檢索得到526個(gè)HFpEF的靶點(diǎn)基因。運(yùn)用R語(yǔ)言相關(guān)數(shù)據(jù)包，對(duì)526個(gè)HFpEF的相關(guān)靶點(diǎn)基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，篩選出P-adjust value值＜0.01的通路共160條，根據(jù)P-adjust value值選取最具有統(tǒng)計(jì)意義的前20條信號(hào)通路（圖1，表1），主要有PI3K-Akt signaling pathway（PI3K-Akt信號(hào)通路），JAK-STAT signaling pathway（JAK-STAT信號(hào)通路），Hematopoietic cell lineage（造血細(xì)胞譜系），EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance（EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥），cAMP signaling pathway（cAMP信號(hào)通路），AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications（糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路）等，圖2和圖3分別展示了舒張性心力衰竭的靶點(diǎn)基因在PI3K-Akt信號(hào)通路和JAK-STAT信號(hào)通路的具體分布情況，均涉及JAK2，PI3K，AKT等基因。

表1 富集顯著的前20條（P-adjust value）舒張性心力衰竭的信號(hào)通路

圖1 富集顯著的前20條舒張性心力衰竭的信號(hào)通路

圖2 PI3K-Akt 信號(hào)通路圖

圖3 JAK-STAT信號(hào)通路

2.2 篩選高頻基因160條關(guān)鍵信號(hào)通路分布425個(gè)舒張性心力衰竭的基因，取P-adjust value值最小的前20條通路，前20條信號(hào)通路匯集208個(gè)非冗余基因，出現(xiàn)頻數(shù)≥5的基因有38個(gè)（表2）。

表2 20條關(guān)鍵信號(hào)通路的高頻基因 （頻率≥5）

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)提取所篩選的20條關(guān)鍵信號(hào)通路中匯集的208個(gè)非冗余基因，將其上傳到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為“Homo sapiens”，繪制前20條信號(hào)通路中非冗余基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖4），并下載“TSV”格式文件，同樣地，將38個(gè)高頻基因再次上傳STRING網(wǎng)站，限定物種為“Homo sapiens”，繪制高頻基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖5）。

圖4 舒張性心力衰竭的非冗余基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖5 舒張性心力衰竭的非冗余高頻基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.4 篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)基因?qū)⑸弦徊缴傻摹癟SV”文件導(dǎo)入Cytoscape，通過(guò)拓?fù)溆?jì)算得到每個(gè)節(jié)點(diǎn)的“度”（即每個(gè)節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)之間的連線的數(shù)量，節(jié)點(diǎn)的聯(lián)系越多，越居于數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)的核心），進(jìn)一步篩選208個(gè)非冗余基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，“度”排名前5%的靶點(diǎn)基因有：INS（ID：3630）、AKT1（ID：207）、IL-6（ID：3569）、VEGFA（ID：7422）、TNF（ID：7124）、EGFR（ID：1956）、SRC（ID：6714）、IL-10（ID：3586）、FN1（ID：2335）、MYC（ID：4609）、NOTCH1（ID：4851），將以上基因上傳metascape網(wǎng)站[8]，利用其中的MOCODE功能繪制以上基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖6）。同樣的方法，獲取38個(gè)高頻非冗余基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，度數(shù)排前5%的基因分別為VEGFA（ID：7422）、EGFR（ID：1956）、MYC（ID：4609），這三個(gè)基因同時(shí)也是非冗余基因及高頻基因的交集基因。

圖6 舒張性心力衰竭metascape的MOCODE核心基因網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO富集分析對(duì)排名前5%的基因功能進(jìn)行GO富集分析，GO數(shù)據(jù)庫(kù)分為3個(gè)獨(dú)立的本體，分別為生物過(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能[9]。節(jié)點(diǎn)的“度”排名前5%的靶點(diǎn)基因主要涉及生物過(guò)程 positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter（RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控），negative regulation of apoptotic process（凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控），positive regulation of cell proliferation（細(xì)胞增殖的正調(diào)控），細(xì)胞組分有extracellular space（細(xì)胞外間質(zhì)），extracellular region（胞外區(qū)），cell surface（細(xì)胞表面）；分子功能：protein binding（蛋白質(zhì)結(jié)合），identical protein binding（相同蛋白結(jié)合），cytokine activity（細(xì)胞因子活性），根據(jù)涉及的基因數(shù)，列出排名前5的生物過(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能（表3）。

表3 舒張性心力衰竭核心基因的主要生物過(guò)程、細(xì)胞組分及分子功能富集分析

3 討論

本研究從Genecard數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到526個(gè)舒張性心力衰竭相關(guān)的基因，利用 R軟件對(duì)檢索到的526個(gè)HFpEF基因進(jìn)行的KEGG信號(hào)通路富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)425個(gè)基因富集在160條通路上。富集最為顯著的通路為PI3K-Akt信號(hào)通路，JAKSTAT信號(hào)通路等。PI3K-Akt信號(hào)通路與生長(zhǎng)、增殖密切相關(guān)，是許多生命活動(dòng)中的關(guān)鍵信號(hào)分子，在促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制細(xì)胞凋亡、維持細(xì)胞生存等機(jī)制中具有重要作用，同時(shí)是重要的內(nèi)源性心肌肥大調(diào)節(jié)通路之一[10]。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)藥物治療及缺血預(yù)適應(yīng)可通過(guò)激活此信號(hào)途徑，改善心臟收縮舒張功能，并能抑制細(xì)胞凋亡[11]，PI3K-Akt信號(hào)通路在心力衰竭的調(diào)節(jié)具體表現(xiàn)為受到一定閾值的壓力負(fù)荷或因子刺激后，可激活心肌細(xì)胞，如果心肌細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)，將導(dǎo)致心肌肥大[12]，心肌肥大是維持正常心功能的一種有益的代償反應(yīng)，但長(zhǎng)期的心肌肥大是心力衰竭和猝死的重要原因。JAK-STAT通路在心臟疾病發(fā)病機(jī)制中的作用倍受關(guān)注，涉及心肌肥大、心力衰竭、缺血預(yù)處理誘導(dǎo)的心肌保護(hù)、以及缺血再灌注引起的心功能障礙[13-15]。JAK-STAT信號(hào)通路協(xié)同其他關(guān)鍵信號(hào)通路，如PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK等信號(hào)通路，共同參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、成熟、分化以及凋亡等。最近的研究顯示過(guò)度長(zhǎng)時(shí)間的腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活參與了肥大心肌轉(zhuǎn)向衰竭的發(fā)生機(jī)制，其過(guò)程也與JAKSTAT通路有關(guān)，因此，進(jìn)一步研究JAK-STAT通路在心力衰竭疾病過(guò)程中的具體機(jī)制，對(duì)闡明心肌肥大的機(jī)制和心力衰竭的防治具有重要意義。

富集最顯著的20條通路上共分布208個(gè)舒張性心力衰竭的非冗余基因，在20條通路中出現(xiàn)頻率≥5的基因共有38個(gè)，可能與HFpEF的發(fā)病且有密切聯(lián)系，因?yàn)樗鼈儏⑴c了多條通路的信號(hào)傳導(dǎo)。為了研究基因之間的相互作用，將208個(gè)非冗余基因與高頻次非冗余的38個(gè)基因分別輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中某一基因與周圍基因的關(guān)系數(shù)量通過(guò)“度”來(lái)表示，節(jié)點(diǎn)度越大，表明與該基因相互作用的基因越多，與疾病的關(guān)聯(lián)程度越大。進(jìn)一步篩選208個(gè)非冗余基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，對(duì)“度”數(shù)排名前5%的核心靶點(diǎn)基因AKT1、IL-6、VEGFA、TNF、EGFR、SRC、IL-10、FN1、MYC、NOTCH1，INS進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果表明，核心靶點(diǎn)基因主要涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控，凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控，細(xì)胞增殖的正調(diào)控等生物過(guò)程，相關(guān)的細(xì)胞成分有細(xì)胞外空隙，細(xì)胞外區(qū)域，細(xì)胞表面等，主要分子功能為蛋白結(jié)合，相同蛋白結(jié)合，細(xì)胞因子活性。

將兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行對(duì)比，共同的核心基因有AKT1、IL-6、VEGFA等。其中，VEGFA，即血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，既是高頻次基因，同時(shí)是兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的高“度”數(shù)基因，研究發(fā)現(xiàn)VEGFA水平的表達(dá)增加與血管生成過(guò)程相關(guān)，可作為血運(yùn)重建指標(biāo)[16]。炎癥和血管生成在慢性心力衰竭的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能是相互關(guān)聯(lián)的[17]，據(jù)報(bào)道，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的炎癥和新生血管可能由VEGFA介導(dǎo)[18]。IL-6屬于高頻非冗余基因，IL-6是由巨噬細(xì)胞分泌的第二類血管減壓的前炎癥細(xì)胞因子，其分泌受循環(huán)血量和血流動(dòng)力學(xué)改變的影響。有研究發(fā)現(xiàn)IL-6能可逆性抑制乳頭肌的收縮功能，促進(jìn)組織纖維化，參與早期心室肥厚的形成[19-21]。AKT位于PI3K-Akt信號(hào)通路，本研究發(fā)現(xiàn)Akt是舒張性心力衰竭的高頻次非冗余基因，多個(gè)研究表明激活的 Akt 可以通過(guò)磷酸化作用激活或抑制其下游靶 蛋 白，從而調(diào)節(jié)多種生長(zhǎng)因子，經(jīng)多種途徑干預(yù)細(xì)胞存亡，涉及心肌細(xì)胞增殖及纖維化等[22,23]。

綜上，本研究從通路、基因功能和蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)等多個(gè)層次來(lái)挖掘與 HFpEF相關(guān)的靶基因，本文局限性在于關(guān)鍵的基因及信號(hào)通路尚缺乏驗(yàn)證，還需結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。