楊天云 王長謙

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┌l(fā)病率高，溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)和冠狀動脈旁路移植術(shù)已明顯改善了心肌梗死的死亡率，但這些方法仍無法逆轉(zhuǎn)已經(jīng)壞死的心肌，不能從根本上改善心臟功能。

細(xì)胞療法是基于將自體或同種異體干細(xì)胞輸送到受傷心臟中的新型治療方法。目前，多種干細(xì)胞類型包括胚胎干細(xì)胞（ESC）、造血干細(xì)胞（HSC）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）和間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）已用于心肌梗死的細(xì)胞療法[1]。在不同類型的干細(xì)胞和祖細(xì)胞中，對MSC 的研究最為深入。MSC 為中胚層來源的多能干細(xì)胞，可以衍生自多種組織，包括骨髓、脂肪、肌肉和滑膜組織[2]。

MSC 治療改善心功能的主要機制包括：（1）移植的MSC 可以分泌大量細(xì)胞因子及旁分泌因子對抗炎性反應(yīng)，在受損可逆的心肌細(xì)胞中激活細(xì)胞保護通路[3-4]，阻止纖維化及左心室重構(gòu)[1]，刺激留存的心臟干細(xì)胞（CSC）增殖、分化[5-6]。（2）移植的MSC 可以分化為內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞，促進(jìn)血管生成。（3）移植的MSC 可能分化為心肌細(xì)胞[1]。

1 MSC治療的作用

1.1 MSC的抗炎作用

MSC 可以通過旁分泌機制抑制炎性反應(yīng)。研究表明，外泌體可由骨髓MSC 生成，在缺血性損傷后刺激血管新生，抑制炎性反應(yīng)并改善心臟功能[7]。在急性心肌梗死后，心臟中主要存在2 種巨噬細(xì)胞亞型。M1 型巨噬細(xì)胞具有促炎作用并能釋放白細(xì)胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α 和γ 干擾素（IFN-γ）；M2 型巨噬細(xì)胞具有抗炎作用，促進(jìn)血管生成及疤痕組織形成。MSC 可增強巨噬細(xì)胞向M2 型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，從而抑制心肌梗死后的促炎狀態(tài)[8]。

1.2 MSC的抗纖維化作用

發(fā)生心肌梗死后，梗死區(qū)心肌細(xì)胞死亡，并被成纖維細(xì)胞替代，心室重構(gòu)可引起心力衰竭，導(dǎo)致心血管死亡。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）重構(gòu)在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的遷移、分化和再生中起著重要作用，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）可維持ECM 穩(wěn)態(tài)。干細(xì)胞可通過調(diào)節(jié)MMP 和MMP 抑制劑，抑制成纖維細(xì)胞活化，減少膠原蛋白和其他ECM 的沉積，從而減少左室重構(gòu)，改善心肌梗死后心臟功能[9]。研究證明，體外培養(yǎng)的MSC 發(fā)揮抗纖維化功能依賴于肝實質(zhì)細(xì)胞因子（HGF）的作用[10]。

1.3 MSC的促血管生成作用

血管生成對于梗死心肌的功能恢復(fù)有著重要意義。MSC 可以通過以下4 種方式促進(jìn)血管生成：（1）釋放生長因子和細(xì)胞因子；（2）分化為內(nèi)皮細(xì)胞；（3）分化為血管平滑肌細(xì)胞；（4）作為血管周細(xì)胞發(fā)揮作用。

移植到梗死周圍區(qū)的MSC 可以釋放大量旁分泌因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1），這些細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié)血管生成[9]。MSC 還可以傳遞囊泡和微囊泡至梗死區(qū)域，這些囊泡內(nèi)含VEGF、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血管生成素，在血管形成相關(guān)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用[11-12]。MSC 移植可在缺血情況下顯著增加存活心肌的毛細(xì)血管床密度。

1.4 MSC刺激內(nèi)源性CSC增殖分化

MSC 移植后是否能分化為心肌細(xì)胞并具有相應(yīng)功能具有頗多爭議，而MSC 刺激內(nèi)源性CSC 的增殖分化則更受認(rèn)可。Hatzistergos 等[5]在豬的心肌缺血模型中將異體骨髓源性MSC 經(jīng)心內(nèi)膜注射到梗死區(qū)域，結(jié)果顯示心臟內(nèi)源性c-Kit＋干細(xì)胞增加了20 倍，有絲分裂的CSC 增加了4 倍。

2 MSC治療存在的問題

2.1 MSC移植、存活及分化

與MSC 的細(xì)胞效應(yīng)相比，植入MSC 的存活和分化率相對較低。研究發(fā)現(xiàn)，單純移植骨髓MSC，細(xì)胞死亡率可高達(dá)（52.4 ± 4.8）%[13]。這可能是由于心肌梗死后MSC 的移植區(qū)處于缺氧缺血、高氧化應(yīng)激水平、高炎性反應(yīng)水平的微環(huán)境中。除了較高的移植細(xì)胞死亡率，MSC 移植的可操作性也較差。在結(jié)扎左前降支（LAD）動脈后，給予小鼠人胎盤來源的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（AMC），小鼠心臟未顯示出植入干細(xì)胞的免疫組織學(xué)證據(jù)[14]。在豬急性心肌梗死模型中，將自體骨髓來源的MSC移植到缺血心肌中，注射后第三周可檢測到移植部位MSC，但第十周則未能檢測到[15]，這提示移植MSC 難以長時間存活。植入的MSC 分化為心肌細(xì)胞的可能性低。在狗慢性缺血性心肌病模型的心肌內(nèi)注射MSC，移植的細(xì)胞可表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的標(biāo)志物，但未能發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞分化的證據(jù)[16]。

2.2 MSC移植安全性

基于MSC 的心血管疾病治療方法，已被臨床前研究[5]及部分臨床研究[17]證明了其短期的安全性。從年輕且健康的供體獲得同種異體MSC，可以很大程度上排除衰老及異常微環(huán)境的影響，且具有與自體細(xì)胞相似的安全性[17]。然而，目前尚未對長期安全性進(jìn)行深入研究。

3 MSC相關(guān)組織工程

常規(guī)方法制備MSC 及心肌內(nèi)注射存在多種缺陷。首先，使用胰蛋白酶使MSC 從膠原蛋白表面脫落會引起ECM 的部分降解及細(xì)胞間聯(lián)系的損失，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡；其次，將MSC 懸浮液進(jìn)行心肌內(nèi)注射的操作本身就會造成MSC 損傷，導(dǎo)致遞送效率低下；最后，將MSC 注射在心肌梗死周圍區(qū)這種離散的給藥方式不可避免地引起MSC 分布不均[18]。因此，近年來很多研究者希望借助組織工程的手段避免這些缺陷。

3.1 MSC球體

MSC 球體是多個MSC 不借助其他物質(zhì)結(jié)合的一種形式。Lee 等將人臍帶血來源的MSC 組成的球體，在大鼠左前降支結(jié)扎3 d 后注射入大鼠心肌，結(jié)果顯示該MSC 球體能夠顯著改善大鼠心肌收縮力并防止左室擴張。另一種由MSC 裝配的3D 微組織已在體外展現(xiàn)了強大的存活能力以及ECM 的形成能力，這可能會成為心臟治療的遞送工具[20]。

3.2 仿生支架及基質(zhì)

仿生支架及基質(zhì)是另一類保存、遞送、釋放MSC 的平臺，目前的研究多將支架或基質(zhì)植入梗死區(qū)域的心肌表面。在對鼠急性心肌梗死模型的研究中，已有多種裝載MSC 的生物支架或類似基質(zhì)被植入心臟中并有不同程度的獲益，如裝載MSC 的聚電解質(zhì)復(fù)合物支架可改善左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、促進(jìn)血管新生，減緩疤痕形成及左心室擴張[21]。裝載MSC 的可生物降解納米纖維心臟貼片移植到梗死區(qū)域心外膜上，可使MSC 向梗死區(qū)域遷移并起到改善左室擴張、減少纖維化、促血管生成等作用[22]。在小鼠心肌梗死模型中使用血漿包被的裝載MSC 的聚ε-己內(nèi)酯（PCL）移植物可以穩(wěn)定心臟功能，減輕心臟擴張，在心肌梗死后4 周，植入心臟貼片組的LVEF 只降低了6%，而假手術(shù)組和無貼片植入組分別降低了13%和20%[23]。

3.3 脫細(xì)胞化和再細(xì)胞化

脫細(xì)胞化是通過使用洗滌劑，從組織或器官中去除細(xì)胞，并保留ECM 組成、結(jié)構(gòu)和生物活性的過程，將該過程與干細(xì)胞再細(xì)胞化相結(jié)合，可以作為心臟再生醫(yī)學(xué)的重要生物工程工具[24]。已有研究嘗試了人類心肌ECM 片的脫細(xì)胞化，后續(xù)可進(jìn)行特定細(xì)胞的種植[25]。大多數(shù)心臟領(lǐng)域脫細(xì)胞/再細(xì)胞化的研究集中于心臟瓣膜方面，心肌梗死治療相關(guān)的應(yīng)用有待更多探索。

4 MSC療法衍生的脫細(xì)胞生物活性蛋白制劑

4.1 脫細(xì)胞脂肪活性物質(zhì)主要成分

MSC 旁分泌作用是其治療潛力的關(guān)鍵部分之一，Yu 等[26]發(fā)現(xiàn)人體脂肪中除含有脂肪MSC，還含有大量生長因子，該團隊研究了相關(guān)提取方法，并將這些生長因子定義為脫細(xì)胞脂肪活性物質(zhì)（CEFFE）。酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測證實CEFFE 中富含胰島素樣生長因子-1（IGF-1）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）、VEGF、肝細(xì)胞生長因子（HGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）、表皮生長因子（EGF）、粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）等多種與組織再生修復(fù)相關(guān)的活性因子。雖然TGF-β 可誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞介導(dǎo)的纖維化和心肌重構(gòu)過程，但是這個過程可被bFGF 抑制[27]。在大鼠心肌梗死模型中，向心肌梗死區(qū)及梗死周圍區(qū)遞送bFGF 能起到減輕心肌纖維化的作用[28]。運動訓(xùn)練減輕心肌梗死后心功能減退的機制研究顯示，運動訓(xùn)練能增加成熟的BDNF，BDNF-酪氨酸激酶受體B（TrkB）信號通路可能是潛在的治療靶標(biāo)[29]。

4.2 CEFFE制備方法

從吸脂手術(shù)獲得脂肪抽吸物，用鹽水沖洗脂肪抽吸物以去除紅細(xì)胞，然后以1 200 g 離心3 min。第一次離心后，將上層油性液和下層液丟棄，收集中層脂肪并進(jìn)行機械乳化。將乳化的脂肪在－80 ℃下冷凍，并在37 ℃下解凍，以進(jìn)一步破壞脂肪組織。將脂肪再次以1 200 g 離心5 min，第二次離心后，產(chǎn)物分為4 層，將上層的油液、第二層的脂肪和第四層的雜物丟棄，小心地吸出第三層，滅菌并去除細(xì)胞碎片，制得最終提取物。將脂肪提取物儲存在－20 ℃，以便將來使用[26]。

4.3 CEFFE的應(yīng)用

通過結(jié)扎股動脈及分支制備裸鼠單側(cè)后肢缺血模型，在小鼠缺血的后肢肌肉內(nèi)注射CEFFE 可增加缺血組織的血流量和毛細(xì)血管密度[26]。在將脂肪顆粒移植至裸鼠，CEFFE 能降低移植裸鼠的細(xì)胞凋亡率并促進(jìn)細(xì)胞增殖[30]。

4.4 CEFFE的缺陷及展望

CEFFE 是基于人脂肪提取物所獲得的生物活性物質(zhì)，盡管可以采集年輕、健康的捐贈者的脂肪，但捐助者的個體差異仍無法避免，需要進(jìn)一步研究以獲得成分穩(wěn)定性更好的CEFFE。另外，目前CEFFE 的遞送方式局限于原位注射，若應(yīng)用于心臟領(lǐng)域，心肌內(nèi)注射造成的損傷無法忽視，一種有效且損傷輕微的遞送方式可能是后續(xù)研究的重點。

5 小結(jié)

基于MSC 的心臟再生醫(yī)學(xué)已取得重大進(jìn)展，盡管大量的臨床前和臨床工作支持其安全性和修復(fù)作用，但其確切的作用機制仍未完全明確。MSC旁分泌作用是其治療潛力的關(guān)鍵，由此衍生出相應(yīng)的脫細(xì)胞療法，相較于MSC 療法有一定的制備存儲、安全性方面的優(yōu)勢，但其有效性、穩(wěn)定性仍待進(jìn)一步研究證實。