劉廣寶 康冉冉 王麗 高媛

自Mullis于1985年首次發(fā)明PCR技術(shù)以來，PCR技術(shù)已經(jīng)在臨床診斷中得到廣泛應(yīng)用，現(xiàn)已衍生出數(shù)十種PCR技術(shù)，如原位PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR)等[1-2]。dPCR屬于第三代PCR技術(shù)，自20世紀(jì)末提出以來，作為一種絕對(duì)定量分析技術(shù)在生物標(biāo)志物檢測(cè)、臨床診斷等方面表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力，引起生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的高度重視并得以迅速發(fā)展[3-5]。隨著dPCR技術(shù)不斷改進(jìn)和完善，其應(yīng)用范圍也進(jìn)一步拓展，目前該技術(shù)主要應(yīng)用于癌細(xì)胞突變位點(diǎn)、病原微生物及食品成分分析等相關(guān)領(lǐng)域的檢測(cè)[3,6-7]。與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比較，dPCR不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)品，可直接檢測(cè)樣品中核酸的原始濃度，且技術(shù)靈敏度更高、耐受性更強(qiáng)，并且快速簡單、價(jià)格低廉[8]。按照分液技術(shù)的不同，目前dPCR主要分為三種：以孔板為載體的微孔板數(shù)字PCR、以“油包水”微滴為特點(diǎn)的微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)和以芯片為反應(yīng)倉的微流控芯片數(shù)字PCR。其中，ddPCR利用油包水乳化微滴顆粒作為反應(yīng)器進(jìn)行檢測(cè)，其研究和應(yīng)用最為廣泛[9]。

產(chǎn)前診斷(prenatal diagnosis)是運(yùn)用各種技術(shù)手段，在出生前對(duì)胚胎或胎兒的發(fā)育狀態(tài)、是否患有疾病等方面進(jìn)行檢測(cè)診斷，對(duì)可治性疾病可選擇適當(dāng)時(shí)機(jī)行宮內(nèi)治療；不可治療的疾病做到知情選擇[10]。目前ddPCR技術(shù)已開始應(yīng)用于產(chǎn)前診斷領(lǐng)域，本文就ddPCR技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、原理

ddPCR是將總反應(yīng)體系分為2萬個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)單元，每個(gè)反應(yīng)單元為體積相近的納升級(jí)微滴，微滴為“油包水”的結(jié)構(gòu)，每個(gè)微滴包含或者不包含1個(gè)或多個(gè)拷貝的靶分子，經(jīng)單分子模板PCR擴(kuò)增后，利用探針上的特異性熒光信號(hào)對(duì)每個(gè)微滴逐一檢測(cè)，其中包含靶分子的微滴熒光信號(hào)為陽性，不包含靶分子的微滴熒光信號(hào)為陰性[11]，根據(jù)泊松分布的原理，由檢測(cè)的熒光信號(hào)陽性及陰性的微滴數(shù)，即可計(jì)算出樣本中的靶分子數(shù)[4,7]。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算原始樣本中靶基因的拷貝數(shù)。

二、優(yōu)勢(shì)

與熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)及其他分子診斷技術(shù)相比，ddPCR在靈敏度、絕對(duì)定量、耐受性等方面具有一定的優(yōu)勢(shì)[12]。

1.高靈敏度：ddPCR技術(shù)把不同DNA模板分隔在2萬個(gè)油包水小微滴中，每個(gè)微滴獨(dú)立檢測(cè)目的序列，大大提高了檢測(cè)的靈敏度。在無創(chuàng)產(chǎn)前領(lǐng)域可準(zhǔn)確檢測(cè)孕婦外周血血漿胎兒的游離核酸(cell-free DNA，cffDNA)含量僅為2%甚至更低的樣本，其檢測(cè)下限明顯優(yōu)于qPCR等檢測(cè)技術(shù)[13-14]。

2.絕對(duì)定量：該技術(shù)通過泊松分布原理，可以由公式λ= - ln(1- k/ n)計(jì)算出靶分子的起始濃度，其中k為陽性微滴數(shù)，n為微滴總數(shù)，λ為平均微滴數(shù)[15]。與qPCR相比，ddPCR通過終點(diǎn)測(cè)量收集熒光信號(hào)，其結(jié)果不依賴于Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線，有效地避免了因起始濃度低而造成檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性較差的缺陷[8]。

3.高耐受性：對(duì)血液、組織、羊水等樣本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，在相應(yīng)的PCR反應(yīng)體系中，可能會(huì)存在擴(kuò)增反應(yīng)的抑制劑、母源性基因序列以及其他因素的干擾，一定程度上會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響。ddPCR技術(shù)微滴化的過程中，干擾因素和靶分子均勻的分配到每個(gè)反應(yīng)單元，從而顯著降低了干擾因素的影響，同時(shí)又以終點(diǎn)信號(hào)的有無為判斷依據(jù)，不受擴(kuò)增效率的限制，有效地提高了對(duì)干擾因素的耐受能力[5]。

此外，與其他分子診斷技術(shù)相比，ddPCR還具有重復(fù)性強(qiáng)、檢測(cè)周期短、價(jià)格低廉等優(yōu)勢(shì)[16]，這些優(yōu)點(diǎn)使得ddPCR能夠在產(chǎn)前診斷中得到很好的應(yīng)用。

三、ddPCR在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

據(jù)2012年衛(wèi)生部發(fā)布的官方數(shù)據(jù)，中國出生缺陷發(fā)生率在5.6%左右，每年新增出生缺陷數(shù)高達(dá)90萬例[17]，給家庭和社會(huì)帶來巨大的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，開展產(chǎn)前篩查與診斷，及早發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重致殘或致死性異常是防止出生缺陷發(fā)生的重要措施。隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，產(chǎn)前診斷技術(shù)不斷朝著快速、準(zhǔn)確、高靈敏度、無創(chuàng)傷的方向發(fā)展。

1.胎兒染色體非整倍體的產(chǎn)前檢測(cè)：21-三體綜合征又稱為唐氏綜合征，是一種常見的染色體非整倍體疾病，活產(chǎn)新生兒的發(fā)病率為1/600～1/800，患兒通常表現(xiàn)為特殊面容，智力障礙，生長發(fā)育遲緩和肌張力減退等[18]。目前臨床上通常聯(lián)合孕婦年齡、超聲學(xué)檢查和血清學(xué)檢查進(jìn)行21-三體綜合征產(chǎn)前篩查，但該方法存在一定的假陰性率和較高的假陽性率[19-20]。1997年Ioan等[21]在孕婦外周血中檢測(cè)到Y(jié)染色體上特異性DNA序列，證實(shí)孕婦外周血中存在胎兒游離核酸，這一發(fā)現(xiàn)為無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)(non-invasive prenatal testing，NIPT)就是利用孕婦外周血胎兒游離DNA對(duì)胎兒的某些遺傳信息進(jìn)行檢測(cè)，是一種無創(chuàng)操作，避免了有創(chuàng)操作帶來的不良妊娠風(fēng)險(xiǎn)。近年來，隨著高通量測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing，NGS)的發(fā)展，無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)日益完善，并在孕婦染色體非整倍體疾病、單基因遺傳病等方面廣泛應(yīng)用[22]。但是NGS成本較高、操作復(fù)雜、檢驗(yàn)周期長、數(shù)據(jù)解讀困難，給疾病檢測(cè)帶來一定的困難，而ddPCR在痕量樣本、低頻突變、拷貝數(shù)變異等檢測(cè)上的準(zhǔn)確性、靈敏性和穩(wěn)定性，使其在cffDNA的檢測(cè)上具有一定的優(yōu)勢(shì)[23]。

Allach等[15]人應(yīng)用ddPCR，設(shè)計(jì)出一種通過檢測(cè)孕婦外周血血漿中游離核酸(cell-free DNA，cfDNA)中胎兒游離核酸(cell-free fetal DNA，cffDNA)的含量來鑒別胎兒是否為染色體非整倍體的方法，并對(duì)213例孕婦血漿DNA進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，利用一組針對(duì)21號(hào)染色體和參照染色體(1號(hào)染色體)的水解探針，對(duì)孕婦血漿中cffDNA進(jìn)行分子計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，即使樣本中目的基因的含量低至5%，ddPCR技術(shù)依然可以準(zhǔn)確的區(qū)分21-三體組和正常組。Lee等[24]人用157例陰性樣本和三個(gè)T21陽性孕婦的四種不同來源的DNA樣本(羊水、細(xì)胞系、全血和孕婦血漿)作為標(biāo)準(zhǔn)，以此確定高風(fēng)險(xiǎn)的閾值，進(jìn)而對(duì)877例孕婦的血漿樣本行ddPCR的檢測(cè)，再利用金標(biāo)準(zhǔn)(羊膜腔穿刺等)對(duì)每例孕婦行產(chǎn)前診斷。通過比較，ddPCR檢測(cè)的準(zhǔn)確率高達(dá)99.66%。

以上研究表明，具備靈敏度高、簡便易行、檢測(cè)周期短等優(yōu)點(diǎn)的ddPCR技術(shù)，有望成為一種產(chǎn)前檢測(cè)21-三體的新選擇，值得在臨床上推廣[15,20,24-25]。

2.單基因遺傳病產(chǎn)前檢測(cè)中的應(yīng)用：ddPCR技術(shù)在單基因遺傳病檢測(cè)方面尚處于起步階段，鄒洋等[16]運(yùn)用ddPCR技術(shù)對(duì)56個(gè)脊肌萎縮癥(spinal muscular atrophy，SMA)家系共138例樣本(其中121例外周血樣本，13例羊水樣本，2例臍帶血樣本，2例絨膜絨毛樣本)行SMN1基因第7外顯子拷貝數(shù)檢測(cè)，其結(jié)果與多重連接依賴性探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation dependent probe amplification，MLPA)——目前國際推薦臨床應(yīng)用的SMN1基因第7外顯子拷貝數(shù)變異的檢測(cè)技術(shù)——檢測(cè)的結(jié)果一致，為SMA臨床基因檢測(cè)和產(chǎn)前診斷提供了新方法。

徐佩文等[26]應(yīng)用ddPCR技術(shù)對(duì)一白化病家系和苯丙酮尿癥家系孕婦進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)，通過檢測(cè)孕婦外周血漿cffDNA以確定胎兒是否遺傳了父親的致病基因突變位點(diǎn)，結(jié)果顯示ddPCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果與羊水DNA Sanger測(cè)序結(jié)果一致。Emmanuel等[27]應(yīng)用ddPCR技術(shù)對(duì)1例囊性纖維化高風(fēng)險(xiǎn)的家系進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)結(jié)果顯示胎兒攜帶父源性突變位點(diǎn)，不能排除子代患囊性纖維化的可能，須進(jìn)一步行有創(chuàng)產(chǎn)前診斷，檢測(cè)是否攜帶母源性突變位點(diǎn)。

Camunas-Soler等[28]利用ddPCR技術(shù)檢測(cè)cffDNA的方法，設(shè)計(jì)了一套針對(duì)單基因遺傳病的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)，并用之檢測(cè)9名有生育單基因疾病患兒風(fēng)險(xiǎn)的孕婦血液樣本，所涉及的疾病包括血友病、囊性纖維化、鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶缺乏癥、β-地中海貧血、甲羥戊酸激酶缺乏癥、乙酰膽堿受體缺乏癥和非綜合征型耳聾等。結(jié)果顯示2例陽性7例陰性，由新生兒測(cè)試予以證實(shí)，該技術(shù)在孕11周且胎兒DNA含量僅為3.7%時(shí)即可檢測(cè)成功。

孫藝佳等[29]應(yīng)用ddPCR技術(shù)建立了一種檢測(cè)母體血漿cffDNA中父源CD41-42基因突變的β-地中海貧血的方法，適用于夫婦為非同型β-地中海貧血基因突變攜帶者，排除父源CD41-42基因突變的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)，并對(duì)20例孕婦血漿樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與確診結(jié)果完全相符。

綜上，對(duì)于父源性致病基因突變的單基因遺傳病，可采用ddPCR技術(shù)對(duì)胎兒是否攜帶致病基因行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)，在不排除是否攜帶母源性致病基因的前提下，可有效避免有創(chuàng)產(chǎn)前診斷。

3.在鑒定胎兒性別和血型中的應(yīng)用：Rh血型系統(tǒng)是臨床輸血醫(yī)學(xué)最復(fù)雜最重要的系統(tǒng)之一，有D、E、C、c、e五種抗原，其中D抗原免疫原性最強(qiáng)，臨床上將缺乏D抗原者成為Rh陰性[30]。Rh陰性婦女懷有D抗原陽性胎兒，可產(chǎn)生初次免疫，再次懷有D抗原陽性胎兒時(shí)會(huì)造成新生兒溶血病，胎兒期即可出現(xiàn)嚴(yán)重溶血、貧血全身水腫，甚至死胎。因Rh陰性血型稀少，對(duì)孕產(chǎn)婦產(chǎn)后出血等危急情況的輸血治療帶來很大的難度。如何早期對(duì)Rh陰性孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷，對(duì)防治Rh血型引發(fā)的新生兒溶血病具有重要的意義[30-31]。

Madgett等[13]用ddPCR和qPCR兩種方法對(duì)46例RhD陰性孕婦的血液樣本行產(chǎn)前診斷，以RhD基因第5外顯子(RhD5)為靶片段時(shí)，ddPCR(100%)的靈敏度明顯高于qPCR(83%)。而且針對(duì)cffDNA含量低于2%的樣本，ddPCR的靈敏度均為100%，qPCR卻無法達(dá)到相同的水平。

某些伴性遺傳疾病的發(fā)生與胎兒性別密切相關(guān)，如杜氏肌營養(yǎng)不良、血友病等，為降低后代患病風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)已明確攜帶相關(guān)致病基因的夫婦可在孕期進(jìn)行胎兒性別鑒定，或直接行胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(preimplantation genetic testing,PGT)。D′Aversa等[14]采用ddPCR技術(shù)對(duì)29例孕早期的孕婦血漿中cffDNA行胎兒性別鑒定，結(jié)果顯示ddPCR可準(zhǔn)確的檢測(cè)出全部孕婦血漿中SRY基因靶點(diǎn)，表明ddPCR是一種靈敏、可靠的胎兒性別鑒定技術(shù)。

4.在其他相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用：qPCR具有檢測(cè)成本低廉、操作便捷且結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，是目前最常用的核酸檢測(cè)技術(shù)。耿娟等[32]采用ddPCR技術(shù)和短串聯(lián)重復(fù)序列的qPCR技術(shù)，分別檢測(cè)40組產(chǎn)前診斷標(biāo)本母體細(xì)胞污染情況，比較兩種方法結(jié)果的準(zhǔn)確性和靈敏度，ddPCR技術(shù)(≥1.56%)明顯優(yōu)于qPCR技術(shù)(≥6.25%)。

四、小結(jié)與展望

ddPCR技術(shù)作為一項(xiàng)新型生物檢測(cè)技術(shù)，在無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)中，發(fā)揮其在低含量核酸樣本檢測(cè)高靈敏度的優(yōu)勢(shì)，具有十分重要的臨床意義和應(yīng)用價(jià)值[5,33]。當(dāng)然，ddPCR在臨床應(yīng)用上還存在諸多局限性，如對(duì)整倍體變異、染色體平衡易位、基因倒位或大片段缺失等檢測(cè)的準(zhǔn)確性還有待提高[34-35]。但隨著應(yīng)用研究的逐步深入和完善，ddPCR已被越來越多的科研工作者所熟知和使用，其適用范圍會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)展，檢測(cè)的準(zhǔn)確性、時(shí)效性和廉價(jià)性也會(huì)逐步提高，進(jìn)而在產(chǎn)前診斷中發(fā)揮更大的作用。