吳芳芳,李太平,方衡,罕園園,譚梔恩,張孟麗,林浩,何艷梅,,歐敏,金亮子,代解杰*,王喜軍,*

(1.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園, 西南瀕危藥材資源開發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室,南寧 530023;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué), 中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究中心,哈爾濱 150040;3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所,昆明 650118)

流感是一種流感病毒引起的丙類傳染性疾病,主要以打噴嚏和咳嗽為傳染途徑的春冬季節(jié)多發(fā)性疾病,疾病表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力、肌肉酸痛、頭痛、咳嗽及輕微的呼吸系統(tǒng)癥狀,流感病毒具有較強(qiáng)的傳播和感染能力,危險(xiǎn)人群為免疫低下的兒童和老年,嚴(yán)重者導(dǎo)致病毒性肺炎和呼吸衰竭,流感病毒可感染呼吸道的所有各類細(xì)胞,并能在其內(nèi)復(fù)制,其致病的主要機(jī)制是病毒復(fù)制引起的細(xì)胞損傷及死亡[1-4]。

樹鼩是一種形似松鼠、吻部較長(zhǎng)的小型哺乳動(dòng)物,是樹鼩科樹鼩屬動(dòng)物,主要分布于南亞、東南亞及我國(guó)南部等地區(qū),由于樹鼩全基因組有超過90%與靈長(zhǎng)類動(dòng)物相似,并且近似于人類的組織解剖結(jié)構(gòu)、生理生化和免疫學(xué)等生物特征,因此在病毒、腫瘤、神經(jīng)、代謝等疾病研究具有強(qiáng)大的應(yīng)用潛力和應(yīng)用價(jià)值[5-6]。

代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分,憑借高通量和高靈敏的分析儀器洞悉生物體的代謝變化,目前,代謝組學(xué)技術(shù)被廣泛用于醫(yī)藥作用評(píng)價(jià),食品安全和環(huán)境污染監(jiān)測(cè)[7-9]。 基于此,本研究應(yīng)用代謝組學(xué)方法分析H1N1 病毒感染樹鼩模型的代謝變化,闡述病毒研究的理想動(dòng)物—樹鼩的代謝網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)其生物標(biāo)記物,為H1N1 流感病毒早期診治及藥物篩查提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

10 只2 ～ 3 周歲普通級(jí)TupaiaBelangeri Chiensis雄性樹鼩,體重120 ～ 140 g,來自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心【SCXK(滇)K2018-0002】,實(shí)驗(yàn)在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所進(jìn)行【SYXK(滇)K2018-0002】,飼養(yǎng)條件:飼養(yǎng)室為普通環(huán)境動(dòng)物隔離室;設(shè)定溫度20 ～ 25℃;設(shè)定相對(duì)濕度40% ～ 70%;照明時(shí)間:12 h/12 h(8:00 開燈,20:00 關(guān)燈,采用動(dòng)物照明控制系統(tǒng));換氣次數(shù)每小時(shí)＞15 次;工作照度: ＞200 LX;動(dòng)物照度:15 ～ 20 LX。 所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求,本研究方案實(shí)施前已經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所倫理審查委員會(huì)審查批準(zhǔn)(DWSP201902013)。

1.1.2 主要試劑與儀器

A/Michigan/45/2015(H1N1)pdm09 疫苗株(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所);色譜級(jí)甲醇( ThermoFisher, 美 國(guó), 批 號(hào): 193130 ); 乙 腈(ThermoFisher,美國(guó),批號(hào):191778);亮氨酸腦啡肽( Sigma, 美 國(guó), 批 號(hào): W19091942 ); 甲 酸(ThermoFisher,美國(guó),批號(hào):193497);純水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司,生產(chǎn)日期:20201224);戊巴比妥鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠, 批號(hào):20180716); 生理鹽水(廣西裕源藥業(yè), 批號(hào):H19082808)。

Waters ACQUITYTMUPLC 超高效液相色譜儀(Waters, 美 國(guó)), Waters G2Si Q/TOF 質(zhì) 譜 儀(Waters,美國(guó)),BEH C18色譜柱(2.1 mm × 100 mm id,1.8 μm,Waters,美國(guó));定量梯度PCR 儀-(Bio-Rad,美國(guó)); Masslynx V4.2 數(shù)據(jù)采集工作站(Waters,美國(guó));Progenesis QI 2.0 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理平臺(tái)(Waters,美國(guó));EZ info 3.0 軟件(Waters,美國(guó));低溫超高速離心機(jī)(ThermoFisher,美國(guó));New Classic MF 型電子天平(METTLER TOLED,德國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及樹鼩流感模型建立

樹鼩分2 組,模型組6 只(記為1#,2#,3#,4#,5#,6#),對(duì)照組4 只。 模型組樹鼩麻醉后,經(jīng)鼻滴入H1N1 流感病毒液100 μL,模型組樹鼩中每只動(dòng)物鼻內(nèi)給藥106.8TCID50;對(duì)照組樹鼩鼻內(nèi)滴入無病毒等體積的未感染尿囊液,置于樹鼩專用隔離器中進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.2.2 生物樣本采集及流感樹鼩模型評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)期間記錄樹鼩體溫、生存率,觀察并記錄有無咳嗽、流涕、嘔吐、食欲缺乏等表現(xiàn),稱量攻毒前后樹鼩體重。 此外,制備鼻洗液樣品作為標(biāo)本,并從每只安樂死或處死的動(dòng)物中收集肺和氣管的代表性切片,樣品在液氮中速凍并儲(chǔ)存在-80℃以備檢測(cè)病毒載量。 7 d 后,測(cè)量咽拭子,血清和肺組織的病毒載量,檢測(cè)血清抗體及組織病變。 所有血液樣品靜置30 min 后離心(4℃,3000 r/min,15 min),取100 μL 血清加400 μL 甲醇,渦旋30 s,靜置30 min,離心(4℃,3000 r/min,20 min)取上清液400 μL,40℃真空吹干,殘?jiān)?00 μL 甲醇復(fù)溶后離心(4℃,3000 r/min,20 min),取100 μL 上清液,供UPLC-MS 分析。

1.2.3 代謝組學(xué)分析條件

應(yīng)用UPLC-Q/TOF-MS 分析樹鼩的血清樣品。優(yōu)化后的分析條件如下:

色譜條件:色譜柱:BEH C18色譜柱(2.1 mm ×100 mm ID,1.8 μm);流動(dòng)相A:0.1%甲酸乙腈溶液,流動(dòng)相B:0.1%甲酸水溶液;柱溫:40℃;流速:0.4 mL/min;進(jìn)樣量:4 μL。 梯度洗脫方法見表1。

表1 樹鼩血清代謝組學(xué)分析色譜梯度洗脫條件Table 1 Chromatographic gradient elution conditions of tree shrew serum metabolomics analysis

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI);正離子模式毛細(xì)管電壓2.4 kV;負(fù)離子模式毛細(xì)管電壓2.3 kV;樣品錐孔電壓30 V;脫溶劑氣溫度350℃;脫溶劑氣流量800 L/h;錐孔反吹氣流量:50 L/h;離子源溫度:110℃。 鎖定質(zhì)量溶液:采用Lockspray 校正系統(tǒng)進(jìn)行在線質(zhì)量校正,亮氨酸-腦啡肽([M+H]+=556.2771,[M-H]-= 554.2615),溶液濃度為1 ng/μL,流速為5 μL/min;質(zhì)量掃描范圍:m/z 50 ～1200 Da,掃描時(shí)間0.2 s;MassLynx V4.2 工作站以continum 模式采集數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

代謝組學(xué)數(shù)據(jù)應(yīng)用Progenesis QI 軟件進(jìn)行降噪、峰提取、峰匹配和歸一化,識(shí)別離子信息,以備多變量統(tǒng)計(jì)分析,非監(jiān)督主成分分析(principal component analysis,PCA)判別模型和空白組間差異,正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least-squares discrimination analysis,OPLS-DA)預(yù)測(cè)模型可靠性和穩(wěn)定性,計(jì)算投影值的可變重要性(variable importance in projection value,VIP),同時(shí)計(jì)算組間離子的歸一化豐度,t檢驗(yàn)篩選P＜ 0.05的差異離子,結(jié)合MS/MS 信息和人類代謝組數(shù)據(jù)庫(HMDB),脂質(zhì)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(Lipid maps)及京都基因和基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(KEGG)確定潛在生物標(biāo)記物,對(duì)確定的生物標(biāo)記物進(jìn)行代謝通路富集分析,闡述其與急性肺炎疾病的生物關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 H1N1 感染樹鼩的一般行為學(xué)評(píng)價(jià)

模型制備期間未出現(xiàn)動(dòng)物死亡現(xiàn)象,但是模型制備前后所有樹鼩出現(xiàn)飲食減少,體重下降現(xiàn)象(圖1),模型制備第3 天,模型組樹鼩開始出現(xiàn)咳嗽,流涕等流感癥狀,造模前后模型組和對(duì)照組的體溫升高了近2℃(圖2),但是統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示兩組無顯著性差異。

2.2 H1N1 感染樹鼩的組織病理學(xué)觀察

所有動(dòng)物于攻毒后第7 天用戊巴比妥鈉麻醉后處死,進(jìn)行大體解剖,觀察肺組織病變程度,其中4 只攻毒樹鼩肺出現(xiàn)病變,在鏡下觀測(cè)到樹鼩肺組織肺間隔增寬,散在炎性細(xì)胞浸潤(rùn),局部可見異物結(jié)晶體及異物巨細(xì)胞,考慮為異物肉芽腫,另有支氣管固有層淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),詳見圖3和圖4,可能由于感染大量病毒后引發(fā)的炎癥損傷的病理改變。

2.3 H1N1 感染樹鼩的病毒載量和血清檢測(cè)

進(jìn)行咽拭子,血清及肺組織的病毒載量測(cè)定,判斷病毒感染情況。 結(jié)果顯示,從攻毒后第1 天開始,6 只攻毒動(dòng)物咽拭子都能檢測(cè)到低病毒載量狀態(tài),第2、3 天仍可以檢測(cè)到咽拭子的病毒載量(圖5A),第5、6 天逐漸降低,到第7 天不可檢出。 攻毒后第1 天直到第7 天安樂死,6 只攻毒動(dòng)物血清均出現(xiàn)低拷貝載量(圖5B),此外安樂死后肺部組織檢查發(fā)現(xiàn)了3 只攻毒動(dòng)物的低拷貝載量病毒(圖5C)。 血清抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)攻毒后第1 天,動(dòng)物血清開始出現(xiàn)抗體,第3 天升高明顯,并在第7 天持續(xù)升高(圖5D)。

2.4 H1N1 感染樹鼩的血清代謝組學(xué)分析

采用優(yōu)化后的分析條件,在正負(fù)離子模式下采集樹鼩的血清代謝輪廓(圖6),獲取的全部代謝組數(shù)據(jù)代入Progenesis QI 軟件進(jìn)行預(yù)處理,利用SIMCA-P 軟件對(duì)模型組不同時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)第7 天樹鼩血液代謝輪廓與空白組分離明顯,說明染毒第7 天樹鼩體內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)發(fā)生明顯變化,最終導(dǎo)致代謝軌跡的偏移(圖7)。

進(jìn)一步篩選對(duì)第7 天的空白組與模型組組間差異生物標(biāo)記物,采用OPLS-DA 尋找內(nèi)源性物質(zhì)的差異,計(jì)算正離子模式的R2X(CUM)= 0.981,Q2(CUM) = 0.863,負(fù)離子模式的R2X(CUM) =0.972,Q2(CUM)= 0.554,表明該統(tǒng)計(jì)模型具有一定的穩(wěn)定新和可預(yù)測(cè)性。 通過計(jì)算,獲得反應(yīng)離子貢獻(xiàn)度的VIP 值,選擇VIP 值大于1 的數(shù)據(jù),進(jìn)一步計(jì)算組件差異離子的歸一化豐度,同時(shí)匹配MS/MS、HMDB、Lipid map 等內(nèi)源性代謝物數(shù)據(jù)庫,結(jié)果共鑒定樹鼩流感模型血清生物標(biāo)記物24 個(gè),其中正離子模式16 個(gè)、負(fù)離子模式8 個(gè)(表2)。 鑒定結(jié)果通過 MetaboAnalyst (https:/ /www. metaboanalyst.ca/)進(jìn)行通路富集分析。

表2 樹鼩流感病毒模型血清生物標(biāo)記物鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of serum biomarkers in tree shrew influenza virus model

續(xù)表2

將24 個(gè)血清生物標(biāo)記物進(jìn)行代謝通路富集分析,異常的24 個(gè)代謝物干擾了7 個(gè)代謝通路(圖8),包括甘油磷脂代謝、鞘脂代謝、花生四烯酸代謝、亞油酸代謝、嘌呤代謝等,其中甘油磷脂代謝和鞘脂代謝最為顯著。

3 討論

本次實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)H1N1 流感株能夠漸進(jìn)式引起樹鼩出現(xiàn)流感癥狀,首先滴鼻后在咽部出現(xiàn)病毒載量,之后成功進(jìn)入肺部,并在血清內(nèi)一直呈現(xiàn)低拷貝載量狀態(tài)存在,病理結(jié)果表明與感染相關(guān),該病毒株可感染樹鼩。 樹鼩感染病毒后,體溫出現(xiàn)顯著性升高,約2℃。 同時(shí)發(fā)現(xiàn),感染樹鼩血清第1 天開始產(chǎn)生抗體,其中,4 只樹鼩的抗體第3 天到達(dá)峰值,2 只樹鼩的抗體第7 天到達(dá)峰值,抵抗病毒感染,抗體呈現(xiàn)階梯式上升。

經(jīng)血清代謝組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)了24 個(gè)差異離子介導(dǎo)了7 條代謝通路,H1N1 感染樹鼩模型發(fā)生了系列的代謝紊亂,這些差異離子和紊亂的代謝通路可能促進(jìn)了炎癥反應(yīng),造成樹鼩流感樣癥狀。 流感會(huì)引起系列的呼吸道癥狀,并且會(huì)引起脂類代謝、氨基酸代謝及糖代謝的異常[10-11]。 通過代謝通路富集分析,發(fā)現(xiàn)甘油磷脂代謝和鞘脂代謝發(fā)生強(qiáng)烈的擾動(dòng),它們屬于脂質(zhì)中重要的一類物質(zhì)。 作為生物體重要的組成部分,脂質(zhì)具有重要的生物功能和地位,脂質(zhì)類化合物可以傳遞細(xì)胞間的信號(hào),并介導(dǎo)物質(zhì)進(jìn)入和流出細(xì)胞,維持細(xì)胞正常的生存和凋亡。 同樣,流感病毒在宿主細(xì)胞生存和復(fù)制依賴于脂質(zhì),因?yàn)榱鞲胁《驹诎l(fā)芽過程中獲得宿主衍生的脂質(zhì)包膜,流感病毒可定制過氧化物酶體,以便進(jìn)行有效復(fù)制[12-13]。 本研究結(jié)果顯示,許多涉及脂質(zhì)代謝的磷脂酰膽堿等化合物水平在H1N1 感染樹鼩的血清中相對(duì)豐度低于對(duì)照組樹鼩,說明病毒的復(fù)制和生存與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)。

病毒-宿主相互作用是病毒復(fù)制和免疫反應(yīng)的重要決定因素,研究表明,人支氣管氣道上皮細(xì)胞在感染H1N1 病毒后會(huì)發(fā)生近百種蛋白的上調(diào),并且它們集中于嘌呤的生物合成代謝,糖代謝和蛋白質(zhì)修飾[14]。 此外,作為公共衛(wèi)生安全的主要威脅性傳染病,流感病毒感染和登革熱病毒感染也會(huì)引發(fā)嘌呤代謝的異常[15],此外,這些病毒性感染還會(huì)引起花生四烯酸代謝和脂肪酸生物合成等代謝紊亂。我們?cè)贖1N1 感染后的樹鼩血清中發(fā)現(xiàn)了參與嘌呤代謝的二磷酸脫氧腺苷,經(jīng)多變量統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)它顯著高于對(duì)照組血清中的歸一化豐度,是感染H1N1 病毒樹鼩和正常樹鼩代謝輪廓差異的背景之一,代謝差異形成的原因可能與嘌呤代謝生成的尿酸致炎性相關(guān)[11]。 花生四烯酸代謝和亞油酸代謝是感染H1NI 樹鼩發(fā)生的代謝異常之一。 花生四烯酸在許多疾病的發(fā)生發(fā)展中起到促進(jìn)作用,花生四烯酸可由不飽和脂肪酸前體化合物轉(zhuǎn)化而來,此外,經(jīng)環(huán)氧化和脂氧化途徑,花生四烯酸可以進(jìn)一步生成促炎性化合物,例如前列腺素和血栓素[16]。

綜上所述,本研究成功建立H1N1 感染樹鼩流感模型,應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了樹鼩發(fā)生流感樣病理改變的代謝機(jī)制,H1N1 病毒感染樹鼩主要發(fā)生了甘油磷脂代謝、鞘脂代謝、花生四烯酸代謝、亞油酸代謝及嘌呤代謝異常。

參 考 文 獻(xiàn)(References)

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