馮勝藍(lán),孫曉東,謝麗霞,葉俊杰,覃冰清,許倩倩,杜凱麗,王敏,桑明*

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心,湖北 襄陽 441000;2.湖北省帕金森病臨床醫(yī)學(xué)研究中心,湖北 襄陽 441000;3.武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 十堰 442000)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)也稱為震顫麻痹(paralysis agitans),在中老年人群中多發(fā),隨著人口老齡化的不斷加劇,PD 的發(fā)病率不斷升高[1]。PD 的主要病理特征為中腦黑質(zhì)和紋狀體處多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失以及α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-Syn)的積累,臨床上伴隨典型運(yùn)動(dòng)遲緩、靜止性震顫等運(yùn)動(dòng)功能障礙[2]。 有研究發(fā)現(xiàn),PD 患者的血清及腦脊液中促炎因子IL-6(interleukin-6)、IL-1β 升高,抗炎因子IL-10 降低,說明PD 患者存在神經(jīng)炎癥反應(yīng)[3]。 PD 患者的外周血中CD3+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞占比減少,說明PD患者存在免疫調(diào)節(jié)異常的現(xiàn)象[4]。 目前,PD 的具體發(fā)病原因及機(jī)制尚不明確,缺乏有效的治療方法[5]。 白藜蘆醇(resveratrol,RES)是一種藥食同源的天然多酚類化合物,具有抗炎、抗凋亡、抗氧化及神經(jīng)保護(hù)等作用[6]。 同時(shí),RES 是沉默信息調(diào)節(jié)器1(silence information regulator 1,SIRT1)的變構(gòu)激活劑,具有調(diào)控自噬作用[7]。 在PD 患者中,SIRT1 的酶活性降低,減弱了其抵抗神經(jīng)毒素的能力,導(dǎo)致神經(jīng)炎癥發(fā)生[8]。 研究表明,RES 在帕金森動(dòng)物模型中具有神經(jīng)保護(hù)作用[9-11]。 Prnp-SNCA-A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠是過表達(dá)包含A53T 突變的人源SNCA 基因的PD 模型小鼠,后代純合子小鼠從8 月齡開始出現(xiàn)進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)障礙[12-13]。 該模型很好的模擬帕金森癥發(fā)病情況,是研究PD 發(fā)病機(jī)制較理想的小鼠模型。 研究發(fā)現(xiàn)RES 對(duì)該模型小鼠運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知功能和神經(jīng)病理具有積極改善作用[14-16]。 RES 的上述作用機(jī)制尚不明確,因此,本實(shí)驗(yàn)以RES 灌胃治療A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠3 個(gè)月,研究RES 對(duì)該模型小鼠運(yùn)動(dòng)功能、T 淋巴細(xì)胞亞群和外周炎癥因子影響,為應(yīng)用RES 治療PD 提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12 只SPF 級(jí)8 月齡A53T 轉(zhuǎn)基因陽性小鼠及12 只同窩轉(zhuǎn)基因陰性小鼠,雄性,體重20 ～ 30 g,本研究所用A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠是武漢大學(xué)張振濤教授實(shí)驗(yàn)室【SCXK(鄂)2019-0004】贈(zèng)予,在襄陽市第一人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室【SYXK(鄂)2022-0093】擴(kuò)繁和飼養(yǎng)。 晝夜各半循環(huán)照明,環(huán)境相對(duì)濕度40% ～ 60%,溫度控制范圍20 ～ 24℃之內(nèi),日溫差 ≤ 1℃,食物供給充足,按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用原則(3R 原則)給予人道主義關(guān)懷。 本項(xiàng)目動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過襄陽市第一人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(2021DW008)。

1.1.2 主要試劑與儀器

白藜蘆醇(1602105-100MG,Sigma-Aldrich,美國);IL-6(MM-1011M2)、IL-18(MM-0169M1)、TNFα(MM-0132M2)及TGF-β(MM-45041M2)ELISA 試劑盒(江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司),單抗試劑:APC-Cy7 anti-mouse,Percpcy 5.5 anti-mouse CD3e,FITC antimouse CD4,PE anti-mouse CD8a(BD,美國),SYBR Green PCR Mix(Promega,美國),實(shí)驗(yàn)所用引物由湖北省武漢市金開瑞生物工程有限公司合成(武漢),Phospho-alpha-Synuclein(S129) Antibody(PPS091,R＆D SYSTEMS, 美 國)。 SpectraMax i3x 酶 標(biāo) 儀(Molecular Devices,美國);ABI 7500 PCR 儀(Life technology,美國);BD FACS AriaII 流式細(xì)胞分析儀(BD,美國);XR501 型大小鼠抓力測定儀(上海欣軟信息科技有限公司);XR-6C 型小鼠轉(zhuǎn)棒疲勞儀(上海欣軟信息科技有限公司);自備一根直徑1 cm、長度50 cm 的表面粗糙的木桿。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

8 月齡SPF 級(jí)A53T 轉(zhuǎn)基因陽性小鼠12 只,隨機(jī)分成兩組,模型組(PD),模型治療組(PD +RES);選取同窩轉(zhuǎn)基因陰性小鼠12 只,隨機(jī)分成兩組,對(duì)照組(WT),對(duì)照治療組(WT + RES),給藥組每3 d 灌胃1 次RES(30 mg/kg),至11 月齡;對(duì)照組和模型組每3 d 灌胃等容積生理鹽水。 在治療的4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0、1、2、3 月)進(jìn)行運(yùn)動(dòng)行為學(xué)測試,治療終點(diǎn)取小鼠外周血進(jìn)行T 淋巴細(xì)胞亞群和血清炎癥因子檢測。

1.2.2 熒光定量PCR 檢測SNCA 基因表達(dá)

剪小鼠尾尖組織,提取小鼠組織DNA。 按SYBR Green 試劑盒說明進(jìn)行擴(kuò)增,PCR 體系為20 μL,反應(yīng)條件:95℃變性15 s,60℃ 30 s,40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)復(fù)孔,引物序列見表1。 轉(zhuǎn)基因陽性小鼠的基因型是通過使用適當(dāng)?shù)膬?nèi)源參照基因片段,將每個(gè)未知樣本的2-ΔΔCt值與已知的純合子和雜合子對(duì)照進(jìn)行比較確定的。 計(jì)算方法如下,將樣本差異以內(nèi)參基因均一化,ΔCt = Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因;然后,將待測樣本與對(duì)照樣本比較得出ΔΔCt,ΔΔCt = ΔCt處理樣本-ΔCt對(duì)照樣本;利用公式計(jì)算獲得待測樣本的RQ 值(倍數(shù)變化)= 2-ΔΔCt。

表1 引物列表Table 1 List of primers

1.2.3 免疫組化檢測P-α-Syn(S129)蛋白在小鼠中腦組織中的表達(dá)

取小鼠中腦腦組織,4%的多聚甲醛固定、石蠟包埋,5 μm 連續(xù)切片。 采用免疫組織化學(xué)方法檢測中腦組織中,P-α-Syn 蛋白的表達(dá)。 陽性染色為棕黃色。 首先選擇在低倍鏡觀察整個(gè)組織切片,圈定4 個(gè)細(xì)胞染色清晰、組織結(jié)構(gòu)良好的區(qū)域視野,最后選擇高倍鏡觀察。

1.2.4 小鼠行為學(xué)測試

(1)爬桿實(shí)驗(yàn):記錄小鼠從爬桿頂部爬至桿底的時(shí)長,每只小鼠重復(fù)3 次,取平均值。 (2)轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn):將小鼠置于恒定轉(zhuǎn)速(30 r/min,以正常小鼠3 min 內(nèi)掉下為標(biāo)準(zhǔn))的轉(zhuǎn)棒儀上,記錄小鼠掉落時(shí)所轉(zhuǎn)的總路程,每只小鼠重復(fù)3 次,取平均值。 (3)抓力實(shí)驗(yàn):依次將小鼠放于抓力測試儀上,抓住鼠尾,當(dāng)小鼠前爪在儀器抓桿上抓牢后,以勻速勻力向后拉,待小鼠松爪,記錄小鼠前爪最大拉力,每只小鼠重復(fù)3 次,取平均值。 (4)下肢抱緊實(shí)驗(yàn):尾根部懸吊小鼠并堅(jiān)持15 s 后,根據(jù)后肢抱緊的嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分,進(jìn)行評(píng)分從0 到3 計(jì)算:0 = 后肢遠(yuǎn)離腹部,向外張開;1 = 觀察期間一側(cè)下肢部分向腹部內(nèi)縮回至少50%;2 = 在觀察期雙下肢部分向腹部內(nèi)縮回至少50%;3 = 觀察期間兩后肢完全向腹部內(nèi)縮少于50%。 評(píng)分為0.5 分屬正常數(shù)值,在連續(xù)3 d的3 個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后,取平均值。

1.2.5 外周血T 淋巴細(xì)胞及其亞群檢測

采用多色抗小鼠單克隆抗體(mAbs)聯(lián)合試劑APC-Cy7 anti-mouse CD45,Percpcy 5.5 anti-mouse CD3,FITC anti-mouse CD4,PE anti-mouse CD8 和匹配的同型對(duì)照,在灌胃RES 治療3 個(gè)月后,取血至EDTA 抗凝小管中,進(jìn)行抗體染色,PBS 清洗兩次后,進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測,計(jì)數(shù)1 × 105個(gè)細(xì)胞。 所有樣本均采用BD FACS Aria II 流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測,應(yīng)用Flow J 軟件對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.6 外周血血清炎癥因子檢測

取外周血后,分離血清,-20℃保存,測定前復(fù)融,混勻,2000 r/min 轉(zhuǎn)速離心20 min,取上清后按ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作。 檢測IL-6、IL-18、TNF-α 及TGF-β 表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并整理,連續(xù)變量用均值表示,計(jì)量資料采用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 帕金森病A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定

熒光定量PCR 檢測A53T 轉(zhuǎn)基因陽性小鼠的SNCA 基因鑒定結(jié)果如表2 所示;免疫組化檢測小鼠中腦中P-α-Syn(S129)蛋白的表達(dá),結(jié)果與對(duì)照組相比,A53T 小鼠的P-α-Syn 蛋白表達(dá)顯著增多(圖1),表明本實(shí)驗(yàn)所用小鼠基因型正確符合要求。

表2 A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠SNCA 基因鑒定Table 2 SNCA gene identification in α-Synuclein A53T mice

2.2 RES 對(duì)A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙的影響

RES 治療3 個(gè)月后,與模型組相比,模型治療組小鼠爬桿總時(shí)長顯著縮短(P＜ 0.01)(圖2A)。 與對(duì)照組相比,模型組小鼠前腳抓力顯著較小(P＜0.05),RES 治療后,與模型組相比,模型治療組小鼠前腳抓力顯著增加(P＜ 0.05)(圖2B)。 同時(shí),與對(duì)照組相比,模型組小鼠轉(zhuǎn)棒總路程顯著縮短(P＜0.05),RES 治療后,與模型組相比,模型治療組小鼠轉(zhuǎn)棒總路程顯著延長(P＜ 0.05)(圖2C)。 與對(duì)照組相比,對(duì)照治療組爬桿時(shí)長,抓力大小以及轉(zhuǎn)棒總路程均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

同時(shí),對(duì)小鼠體重進(jìn)行測量,發(fā)現(xiàn)RES 對(duì)小鼠體重?zé)o顯著差異(圖3A);與對(duì)照組相比,模型組小鼠在尾部懸吊之后表現(xiàn)出下肢抱緊行為,這是神經(jīng)退行性疾病小鼠模型常見的運(yùn)動(dòng)障礙特征;RES 治療后,與模型組相比,模型治療組小鼠抱緊行為改善(圖3B)。 與對(duì)照組相比,模型組小鼠四肢抱緊運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分升高(P＜ 0.005);RES 治療后,與模型組相比,模型治療組小鼠四肢抱緊運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分顯著降低(P＜ 0.01)。 與對(duì)照組相比,對(duì)照治療組四肢抱緊運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分無顯著性差異(圖3C)。

2.3 RES 對(duì)A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠外周T 淋巴細(xì)胞及其亞群影響

流式圈門策略及典型示例見圖4 所示。 流式檢測結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,模型組T 淋巴細(xì)胞占比顯著降低,差異具有顯著性(P＜ 0.001);經(jīng)3 個(gè)月RES 灌胃治療后,與模型組相比,模型治療組T淋巴細(xì)胞占比增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)(圖5A)。 與對(duì)照組相比,模型組Th 細(xì)胞(CD3+CD4+)占比顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜ 0.001);與模型組相比,模型治療組Th 細(xì)胞(CD3+CD4+)占比增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0. 005)(圖5C)。 與對(duì)照組相比,模型組Tc 細(xì)胞(CD3+CD8+)占比差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與模型組相比,模型治療組Tc 細(xì)胞(CD3+CD8+)占比不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5B)。 與對(duì)照組相比,模型組CD4+/CD8+比值降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與模型組相比,模型治療組CD4+/CD8+比值增加,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5D)。 與對(duì)照組相比,對(duì)照治療組T 淋巴細(xì)胞占比、CD4+T 淋巴細(xì)胞占比、CD8+T 淋巴細(xì)胞占比及CD4+/CD8+比值均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)。

2.4 RES 對(duì)A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠外周血血清炎癥因子的影響

與對(duì)照組相比,模型組小鼠血清中IL-6、IL-18含量顯著增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜ 0.005,P＜ 0.01);經(jīng)3 個(gè)月RES 灌胃治療后,與模型組相比,模型治療組小鼠血清中IL-6、IL-18 含量顯著減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜ 0.001,P＜0.05)(圖6A,6B)。 在各組間血清TNF-α 含量差異不具有顯著性(圖6C)。 與對(duì)照組相比,模型組小鼠血清TGF-β 含量顯著減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜ 0.05);與模型組相比,模型治療組小鼠血清中TGF-β 含量回升,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6D)。 與對(duì)照組相比,對(duì)照治療組IL-6、IL-18、TNF-α及TGF-β 含量均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6)。

3 討論

近年來大量研究證實(shí)RES 可以減少神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡,從而減少神經(jīng)炎癥發(fā)生[17]。 RES 作為SIRT1 基因的激活劑,可激活線粒體自噬,減輕DA能神經(jīng)元中α-Syn 低聚物的形成,保護(hù)神經(jīng)元,從而改善PD 模型大鼠運(yùn)動(dòng)障礙[8,18]。 本研究顯示,RES縮短A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠爬桿時(shí)長,降低小鼠四肢抱緊運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分,增加A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠轉(zhuǎn)棒路程及前腳抓力,說明應(yīng)用RES 治療PD 有較大潛力,這與已有報(bào)道一致。

PD 患者普遍存在免疫功能異常,T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能減退[19]。 正常情況下,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中激活的T 淋巴細(xì)胞較少出現(xiàn),當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí),神經(jīng)元釋放促炎因子(IL-1β、TNF-α 等),改變血腦屏障通透性,從而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中產(chǎn)生激活的T 淋巴細(xì)胞,被激活的T 淋巴細(xì)胞會(huì)進(jìn)一步遷移至神經(jīng)元損傷部位,加速神經(jīng)炎癥的發(fā)展[20]。 研究發(fā)現(xiàn),激活的小膠質(zhì)細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)釋放IL-6、TNF-α 和IL-1β 等細(xì)胞因子,誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥的發(fā)生,導(dǎo)致DA 能神經(jīng)元的損傷以及神經(jīng)元數(shù)量減少[21-22]。 以上研究提示,免疫功能的紊亂及神經(jīng)炎癥的發(fā)生是PD 病理進(jìn)展的重要方面。 研究指出,PD 患者外周血中CD3+T 淋巴細(xì)胞占比、CD4+T 細(xì)胞占比及CD4+/CD8+T 細(xì)胞比值與健康對(duì)照人群相比顯著降低[23],IL-6 作為主要的炎癥因子參與炎癥反應(yīng),是組織損傷程度與炎癥反應(yīng)的重要標(biāo)志物之一,與健康對(duì)照相比,在PD 患者血漿中IL-6 的表達(dá)增高[24-25]。 IL-18 作為白細(xì)胞介素的重要成員,通過參與CD4+T 細(xì)胞的增值與分化過程、增加促炎因子TNF-γ 的產(chǎn)生發(fā)揮免疫應(yīng)答作用[26],最近的研究發(fā)現(xiàn)IL-18 可以與小膠質(zhì)細(xì)胞受體結(jié)合,加快小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,激活的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步釋放炎性因子,惡性循環(huán)的過程導(dǎo)致神經(jīng)炎癥的發(fā)生,加速PD 的進(jìn)展[27]。 同時(shí),研究指出另一種參與免疫調(diào)節(jié)的重要成員TGF-β,其是具有免疫抑制功能的細(xì)胞因子,可以通過對(duì)黏附分子的下調(diào)作用,參與機(jī)體免疫耐受過程。 TGF-β 可刺激T 細(xì)胞分化成CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(Treg)細(xì)胞,分泌IL-10 等抑制性細(xì)胞因子維持機(jī)體免疫系統(tǒng)的平衡,這也是Treg 細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制功能的重要途徑之一[28]。 因此,T 淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用和炎癥因子異常釋放參與PD 發(fā)病進(jìn)展。

本研究發(fā)現(xiàn)A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠相比,T 淋巴細(xì)胞占比、CD4+T 細(xì)胞占比、CD4+/CD8+比值均顯著降低,說明A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠存在免疫功能減退和免疫系統(tǒng)失調(diào)。 有研究證實(shí),淋巴細(xì)胞占比下降和CD4+T 細(xì)胞百分比減少有關(guān)[29],這說明A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠CD4+T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫過程存在異常。 CD4+/CD8+比值可以間接反應(yīng)機(jī)體免疫狀態(tài),A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠相比CD4+/CD8+比值下降,說明A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠存在免疫調(diào)節(jié)異常。 同時(shí),A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠相比,IL-6、IL-18 表達(dá)顯著增高,TGF-β 表達(dá)降低,一方面說明,A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠存在機(jī)體內(nèi)的神經(jīng)炎癥反應(yīng);另一方面說明,抗原提呈細(xì)胞抗原提呈的過程受到影響,抑制了T 淋巴細(xì)胞及CD4+T 細(xì)胞增殖與分化,免疫系統(tǒng)的平衡存在紊亂。 RES 治療后顯著增加T 淋巴細(xì)胞占比、CD4+T 細(xì)胞占比以及CD4+/CD8+比值;顯著降低了IL-6、IL-18 炎癥因子的表達(dá),說明RES 可改善A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫功能異常。

綜上所述,Prnp-SNCA-A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠可模擬帕金森病的部分外周免疫異常狀態(tài),本研究結(jié)果證實(shí)RES 可顯著改善該模型小鼠的運(yùn)動(dòng)功能障礙,通過調(diào)節(jié)小鼠外周T 淋巴細(xì)胞數(shù)量和炎癥因子水平,使小鼠免疫狀態(tài)恢復(fù)正常。 本研究為RES 在PD 的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)(References)

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