江麗青,張溧昀,師恒,楊家昌,劉金成,段維勛

(空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院心血管外科,西安 710032)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是心力衰竭最重要的病因之一,在全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率都很高,嚴重危害人類生命健康。但隨著早期再灌注策略的實施以及治療方法的改進,急性心梗30 d 內(nèi)死亡率顯著降低,其預后效果也獲得了很大改善[1-3]。 但生存率的提高伴隨的是心梗后慢性心衰病人明顯增多,這與心梗后一系列病理性心肌重構(gòu)密切相關(guān)[4-5]。 目前,臨床上缺乏針對心梗后病理性心肌重構(gòu)的有效防治藥物,隨著中醫(yī)藥研究的發(fā)展,中藥在心梗預防和治療方面起到的作用日益顯著。

和厚樸酚(honokiol,HKL)是一種從木蘭科植物中提取的多酚類化合物,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤以及神經(jīng)保護等多種藥理作用,已被廣泛用于中藥制劑研究[6-10]。 近年來,HKL 在心血管疾病方面的作用也備受關(guān)注,如Tsai 等[11]發(fā)現(xiàn),給大鼠靜脈注射HKL,可顯著降低心肌缺血后左室心律失常的發(fā)生率并縮短持續(xù)時間。 Pillai 等[12]亦證實HKL 不僅可以通過改善線粒體功減輕多柔比星引起的心臟毒性,也可以阻斷甚至逆轉(zhuǎn)心肌肥厚反應的發(fā)生。 雖然Wang 等[13]、Zhang 等[14]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HKL 能明顯減輕大鼠的心肌缺血/再灌注損傷,然而,其在小鼠急性心梗后近遠期治療效果及其具體分子機制還尚待研究。 本研究將探討HKL 對急性心梗小鼠心肌損傷的影響及其可能的調(diào)控機制,為HKL 新的臨床藥用價值提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

8 周齡SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠80 只,體重20 ～ 25 g,購自空軍軍醫(yī)大學動物實驗中心【SCXK(陜)2019-001】,小鼠由空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心飼養(yǎng)【SYXK(陜)2019-001】。 飼養(yǎng)期間所有小鼠自由飲食,12 h 循環(huán)光照,溫度24 ～ 26℃,濕度50% ～ 60%。 所有操作均符合空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心實驗倫理學要求(IACUC-20190115)。

1.1.2 主要試劑與儀器

和厚樸酚(美國Sigma-Aldrich 公司,化學合成物,純度 ≥ 98%,批號:H4914);戊巴比妥鈉(北京索來寶有限公司,中國,批號:57-33-0);SIRT1 抑制劑EX527(美國Sigma-Aldrich 公司,批號:E7034);SIRT1(GR3392540-1)、Bcl-2(GR3390921-1) 一抗(美國Abcam 公司);Bax(美國CST 公司,批號:12)、 GAPDH ( 美 國 Proteintech 公 司, 批 號:00081503),Ac-Foxo1(美國Santa Cruz 公司,批號:F1714)、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 二抗(中杉金橋,中國,批號:200830803);BCA 蛋白定量試 劑 盒( 美 國 Thermo Fisher 公 司, 批 號:VK314219);TUNEL 試劑盒(德國Roche 公司,批號:49330900);DAPI 染液(美國Sigma-Aldrich 公司,批號:D9542);IL-β、IL-6、TNF-α 檢測試劑盒(美國Thermo Fisher 公司,批號分別為;5EEUZ9PLRK、KZ9XUYNEYN、3B164BNQLX);Vevo3100 小動物超聲儀(Visual-Sonics 公司,加拿大);FV10-ASW 激光共聚焦顯微鏡(Olympus 公司,日本);Western 發(fā)光照相系統(tǒng)(Bio-Rad 公司,美國)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立

小鼠心肌梗死模型是聘請美國Thomas Jefferson大學的Gao Erhe 教授構(gòu)建,具體方法參照文獻[15],結(jié)扎冠脈左前降支,結(jié)扎線下方心肌缺血變白且心電圖顯示ST 波倒置,代表造模成功,模型成功率達98%以上。

1.2.2 實驗分組及給藥方式

將80 只小鼠隨機分成4 組,每組20 只,即Sham 組、MI + V 組、MI + HKL 組、MI + HKL + EX組。 治療組在行心梗手術(shù)前1 周開始口服HKL(5 mg/(kg·d),溶于 ＜ 1% DMSO 的純凈水中),抑制劑組除按前面劑量口服HKL 外,腹腔注射Ex527 抑制劑,每5 d 1 次(5 mg/(kg·d),溶于 ＜ 1% DMSO的無菌生理鹽水中),注射6 次,HKL 給藥劑量參照文獻[14]。

1.2.3 心臟功能檢測

各組小鼠在心梗術(shù)后第28 天,剔除小鼠胸前毛,每組隨機取5 只用異氟烷麻醉小鼠并將其固定于恒溫檢測臺上,用小動物超聲儀采集二維超聲心動圖像,并用軟件計算出相應的左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)與左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)等心功能指標。

1.2.4 血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的檢測

超聲檢測小鼠心功能后,使用異氟烷麻醉小鼠并固定于小動物操作臺上,頸部消毒,眼科剪沿頸前正中線剪開并剝離出頸動脈,剪斷后收集血液,靜置30 min 后離心收集上層血清,參照ELISA 檢測試劑盒說明書要求,檢測各組血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量。

1.2.5 心肌組織活性氧簇生成量檢測

小鼠MI 術(shù)后第28 天,采集完血液后取下小鼠心臟,取5 個用預冷的PBS 洗滌后,在液氮中快速冷凍,用冰凍切片包埋劑處理后并切成5 μm 厚度組織切片。 然后,用DHE 和DAPI 染料對組織切片進行染色,光鏡下掃描并拍照,使用Image-Pro Plus軟件測定每組中的乙錠熒光。

1.2.6 心肌組織TUNEL 檢測

小鼠MI 術(shù)后第28 天,采集完血液后取下小鼠心臟,取5 個浸泡在4%多聚甲醛,石蠟包埋后切片備用,按TUNEL 常規(guī)染色步驟染色,光鏡下掃描并拍照,然后統(tǒng)計每組心肌細胞凋亡率,以綠色凋亡小體個數(shù)/藍色核個數(shù)表示細胞凋亡率。

1.2.7 心肌組織SIRT1、Ac-Foxo1、Bax、Bcl-2 蛋白表達檢測

小鼠MI 術(shù)后第28 天,采集血液后取下小鼠心臟,取左室部分組織稱重,在預冷PBS 中剪碎,離心5 min,去除上清,加入相應體積的裂解液并進行組織勻漿。 然后在4℃條件下充分裂解20 min,再以12 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心20 min。 采用BCA 法檢測上清液中蛋白濃度,其余上清液以1 ∶4 的比例與蛋白上樣緩沖液(5 ×)混合后煮沸使蛋白變性,-80℃冰箱保存,待用。 經(jīng)蛋白凝膠電泳分離后,用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上,5%脫脂牛奶封閉后,切膜,于4℃條件下孵育一抗,稀釋比例為:SIRT1、Ac-Foxo1、Bax、 Bcl-2 均 為1 ∶ 1000, GAPDH 為1 ∶5000,孵育過夜,TBST 洗脫3 次,每次10 min,分別加1 ∶5000 HRP 標記的二抗(山羊抗鼠及山羊抗兔),室溫孵育2 h,TBST 洗脫3 次,每次10 min,使用ECL 化學發(fā)光液進行曝光顯影,采用Bio-Rad 照相系統(tǒng)進行拍照和并用Image Lab 軟件分析蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計學軟件進行分析,符合正態(tài)分布的計量資料以平均值 ± 標準差(±s)表示;多組之間的比較通過One-ANOVA分析方法進行統(tǒng)計。P＜ 0.05 表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 小鼠MI 后28 d 生存率及HKL 對MI 小鼠心功能的影響

小鼠行MI 手術(shù)后,觀察28 d 生存情況,Sham組無死亡小鼠,MI + V 組、MI + HKL 組、MI + HKL+ EX 組均有死亡,3 組之間無顯著性差異,但較Sham 組生存率明顯下降(P＜ 0.01),如圖1A。 小鼠MI 后第28 天超聲心動圖統(tǒng)計結(jié)果顯示,與Sham組相比較,MI + V 組小鼠心功能損傷顯著加重(P＜ 0.01);與MI + V 組比較,口服HKL 治療后心功能明顯得到改善(P＜ 0.01),而加SIRT1 抑制劑EX527 后顯著抑制了HKL 的心功能改善作用(P＜ 0.05)(見圖1B,圖1C,圖1D)。

2.2 口服HKL 治療降低MI 小鼠血清炎癥因子水平

小鼠血清檢測結(jié)果顯示,MI 術(shù)后小鼠血清中炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-6、TNF-α 含量較Sham 組顯著升高(P＜ 0.01),與MI+V 組比較,口服HKL 治療后血清中炎癥相關(guān)因子含量又顯著下降(P＜0.01),而加SIRT1 抑制劑EX527 后,炎癥水平又明顯加重(P＜ 0.05)(見表1)。

表1 和厚樸酚對心梗小鼠小鼠血清炎癥因子的影響(pg/mL,±s,n = 5)Table 1 Effect of honokiol on serum inflammatory factors in mice with myocardial infarction(pg/mL, ±s, n = 5)

表1 和厚樸酚對心梗小鼠小鼠血清炎癥因子的影響(pg/mL,±s,n = 5)Table 1 Effect of honokiol on serum inflammatory factors in mice with myocardial infarction(pg/mL, ±s, n = 5)

組別Groups白細胞介素-1β IL-1β白細胞介素-6 IL-6腫瘤壞死因子-α TNF-α Sham 組Sham group 1.69 ± 0.08 1.82 ± 0.74 16.20 ± 5.42 MI + V 組MI + V group 9.66 ± 1.47a 8.95 ± 1.64a 109.80 ± 17.27a MI + HKL 組MI + HKL group 3.35 ± 0.63b 4.24 ± 1.61b 33.86 ± 11.30b MI + HKL + EX 組MI + HKL + EX group 5.40 ± 1.06c 6.62 ± 2.80c 46.28 ± 14.34c

2.3 口服HKL 治療對MI 小鼠心肌組織氧化應激和心肌細胞凋亡水平的影響

心肌組織DHE 和TUNEL 染色結(jié)果顯示,與Sham 組比較,MI + V 組氧化應激和凋亡水平明顯加重(P＜ 0.01),與MI+V 組比較,口服HKL 治療后顯著改善了MI 小鼠心肌組織氧化應激和凋亡水平(P＜ 0.01),而加SIRT1 抑制劑EX527 后,這種改善作用又明顯減弱(P＜ 0.05)(見圖2)。

2.4 口服HKL 治療對MI 小鼠心肌組織凋亡相關(guān)蛋白及SIRT1/Ac-Foxo1 信號通路的影響

與Sham 組相比較,MI + V 組凋亡相關(guān)蛋白Bax和SIRT1 信號通路下游蛋白Ac-Foxo1 的表達顯著增加(P＜ 0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2 和SIRT1 信號的表達水平顯著降低(P＜ 0.01);而口服HKL 治療后可顯著緩解MI 后心肌損傷,Bax 和Ac-Foxo1 的表達較MI+V 組明顯降低(P＜ 0.01),Bcl-2 和SIRT1 的表達水平又明顯升高(P＜ 0.01);加入SIRT1 抑制劑EX527 后,這種改善作用又明顯減弱(P＜ 0.05)(見圖3)。

3 討論

本研究通過對急性心梗小鼠模型的實驗研究發(fā)現(xiàn),較假手術(shù)組,心肌梗死后小鼠28 d 內(nèi)生存率明顯下降,心功能明顯變差;口服和厚樸酚治療可以顯著改善心梗小鼠的心功能,并顯著降低小鼠血清中炎癥因子水平,生存率略有改善但無明顯差異。 和厚樸酚作為一種中藥材中天然、安全的“靶向”藥物,在心血管領(lǐng)域能夠發(fā)揮多重積極的作用,如降血壓、抑制動脈血栓形成、逆轉(zhuǎn)心肌肥厚反應以及保護線粒體等[12,16-17]。 此外,和厚樸酚已被廣泛用于減輕多個臟器缺血再灌注損傷的研究中。重要的是,Zhang 等[14]研究發(fā)現(xiàn),和厚樸酚可以顯著改善糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷后的心臟功能障礙,但其在急性心梗后如何發(fā)揮保護效應還鮮有研究報道。 因此,和厚樸酚對近遠期缺血性心臟病的防治效果研究顯得尤為迫切。

據(jù)報道,心梗后一系列病理變化包括心肌組織氧化應激增加、炎性細胞廣泛浸潤、心肌細胞死亡、心臟收縮功能變差等,這些導致心臟病理性架構(gòu)變化,并最終導致心衰[5,18-19]。 張超等[20]研究發(fā)現(xiàn),和厚樸酚可以通過減輕炎癥因子水平和抗凋亡作用對D-半乳糖致腰椎間盤退變有明顯治療作用。本研究通過給予心梗小鼠口服和厚樸酚發(fā)現(xiàn),治療組可以明顯降低小鼠心肌組織氧化應激水平,減少心肌細胞凋亡,同時抗凋亡蛋白Bcl-2 表達量顯著增加,凋亡蛋白Bax 表達水平顯著降低,表明和厚樸酚可通過降低小鼠血清炎癥因子水平和心肌細胞凋亡率改善心梗后小鼠心功能。

SIRT1 是一種主要分布于細胞核中的去乙?；?通過對一些組蛋白和非組蛋白的去乙酰化作用,參與調(diào)控多種組織細胞的生存、凋亡、生長、衰老以及物質(zhì)代謝[21]。 此外,文獻報道表明SIRT1 可通過抑制細胞凋亡、降低氧化應激與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激水平、調(diào)控細胞自噬等途徑來減輕心肌缺血再灌注損傷[22],那么,心肌梗死后和厚樸酚是否能通過激活SIRT1 信號發(fā)揮保護作用尚需證實。 本研究通過給心梗模型小鼠腹腔注射SIRT1 抑制劑EX527,同時給予和厚樸酚口服給藥,發(fā)現(xiàn)加入抑制劑后,較單純給藥組,心肌組織氧化應激和心肌細胞凋亡水平明顯增加,血清炎癥因子也顯著增加,同時和厚樸酚的心功能明顯變差,SIRT1 下游分子Ac-Foxo1 表達顯著增加。 因此,該研究表明和厚樸酚對心梗小鼠心功能的保護作用部分是通過SIRT1/Ac-Foxo1信號的抗凋亡作用實現(xiàn)的。

綜上所述,該研究表明和厚樸酚可減輕心梗后小鼠心肌損傷,其潛在的作用機制可能是通過激活SIRT1/Ac-Foxo1 信號通路抑制心肌細胞凋亡,但其具體的下游機制仍需進一步研究。 因此,本研究將為和厚樸酚在臨床上治療心肌梗死提供可能的理論依據(jù)。

參 考 文 獻(References)

[ 1] Bhatt AS, Ambrosy AP, Velazquez EJ. Adverse remodeling and reverse remodeling after myocardial infarction [J]. Curr Cardiol Rep, 2017, 19(8): 71-79.

[ 2] Ibanez B, James S, Agewall S, et al. 2017 ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation of the european society of cardiology(ESC) [J]. Eur Heart J, 2018, 39(2): 119-177.

[ 3] Tamis-Holland JE, Jneid H, Reynolds HR, et al. Contemporary diagnosis and management of patients with myocardial infarction in the absence of obstructive coronary artery disease: a scientific statement from the american heart association [J]. Circulation,2019, 139(18): 891-908.

[ 4] Lewis EF, Moye LA, Rouleau JL, et al. Predictors of late development of heart failure in stable survivors of myocardial infarction: the Care study [J]. J Am Coll Cardiol, 2003, 42(8): 1446-1453.

[ 5] Oliveira JB, Soares AASM, Sposito AC. Inflammatory response during myocardial infarction [J]. Adv Clin Chem, 2018, 84: 39-79.

[ 6] Ye JS, Chen L, Lu YY, et al. SIRT3 activator honokiol ameliorates surgery/anesthesia-induced cognitive decline in mice throughanti-oxidativestressandanti-inflammatory in hippocampus [J]. CNS Neurosci Ther, 2019, 25(3): 355-366.

[ 7] Wijesuriya YK, Lappas M. Potent anti-inflammatory effects of honokiol in human fetal membranes and myometrium [ J].Phytomedicine, 2018, 49: 11-22.

[ 8] Lee JS, Sul JY, Park JB, et al. Honokiol induces apoptosis and suppresses migration and invasion of ovarian carcinoma cells via AMPK/mTOR signaling pathway [J]. Int J Mol Med, 2019, 43(5): 1969-1978.

[ 9] Woodbury A, Yu SP, Chen D, et al. Honokiol for the treatment of neonatal pain and prevention of consequent neurobehavioral disorders [J]. J Nat Prod, 2015, 78(11): 2531-2536.

[10] Rauf A, Olatunde A, Imran M, et al. Honokiol: a review of its pharmacological potential andtherapeuticinsights [ J ].Phytomedicine, 2021, 90: 153647.

[11] Tsai SK, Huang CH, Huang SS, et al. Antiarrhythmic effect of magnolol and honokiol during acute phase of coronary occlusion in anesthetized rats: influence of L-NAME and aspirin [ J].Pharmacology, 1999, 59(5): 227-233.

[12] Pillai VB, Samant S, Sundaresan NR, et al. Honokiol blocks and reverses cardiac hypertrophy in mice by activating mitochondrial Sirt3 [J]. Nat Commun, 2015, 6: 6656.

[13] Wang Y, Zhang ZZ, Wu Y, et al. Honokiol protects rat hearts against myocardial ischemia reperfusion injury by reducing oxidative stress and inflammation [J]. Exp Ther Med, 2013, 5(1): 315-319.

[14] Zhang B, Zhai M, Li B, et al. Honokiol ameliorates myocardial ischemia/reperfusion injury in type 1 diabetic rats by reducing oxidative stress and apoptosis through activating the SIRT1-Nrf2 signaling pathway [ J]. Oxid Med Cell Longev, 2018,2018: 3159801.

[15] Gao E, Lei YH, Shang X, et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse[J]. Circ Res, 2010, 107(12): 1445-1453.

[16] Zhang GS, Wang RJ, Zhang HN, et al. Effects of chronic treatment with honokiol in spontaneously hypertensive rats [J].Biol Pharm Bull, 2010, 33(3): 427-431.

[17] Pillai VB, Kanwal A, Fang YH, et al. Honokiol, an activator of Sirtuin-3 (SIRT3) preserves mitochondria and protects the heart from doxorubicin-induced cardiomyopathy inmice

[ J ].Oncotarget, 2017, 8(21): 34082-34098.

[18] Prabhu SD, Frangogiannis NG. The biological basis for cardiac repair after myocardial infarction: from inflammation to fibrosis[J]. Circ Res, 2016, 119(1): 91-112.

[19] Teringova E, Tousek P. Apoptosis in ischemic heart disease[J]. J Transl Med, 2017, 15(1): 87.

[20] 張超, 吳俊學, 王冶, 等. 和厚樸酚對D-半乳糖致腰椎間盤退變大鼠血清炎癥因子及細胞線粒體凋亡通路的影響 [J].中國比較醫(yī)學雜志, 2021, 31(11): 62-68, 75.Zhang C, Wu JX, Wang Z, et al. Effect of honokiol on serum inflammatory factors and mitochondrial apoptosis pathway in rats with D-galactose-induced lumbar intervertebral disc degeneration[J]. Chin J Comp Med, 2021, 31(11): 62-68, 75.

[21] Ma L, Li Y. SIRT1: role in cardiovascular biology [J]. Clin Chim Acta, 2015, 440: 8-15.

[22] Hsu CP, Zhai P, Yamamoto T, et al. Silent information regulator 1 protects the heart from ischemia/reperfusion [J].Circulation, 2010, 122(21): 2170-2182.