嚴(yán)露,張纓

(1.北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)與體質(zhì)健康教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100084;2.北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院,北京 100084)

骨骼肌占人體體重約40%[1],是重要的代謝調(diào)節(jié)組織,可將大部分餐后血糖吸收攝取并儲(chǔ)存,對于維持血糖水平的穩(wěn)定至關(guān)重要[2-4]。 骨骼肌糖代謝水平則是影響有氧運(yùn)動(dòng)能力的重要因素[5],而骨骼肌糖代謝水平會(huì)受到生物鐘的調(diào)控[6]。 BMAL1(brain and muscle ARNT-like protein 1)是核心生物鐘分子,可與CLOCK (circadian locomotor output cycles kaput)形成BMAL1-CLOCK 異二聚體,它們作為轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控生物鐘靶基因的轉(zhuǎn)錄[7-8]。Chrono( computationally highlighted repressor of network oscillator,也稱Gm129、Ciart、C1orf51 等)是近年新發(fā)現(xiàn)的生物鐘基因[9],其編碼的CHRONO 蛋白可直接與轉(zhuǎn)錄因子BMAL1 相結(jié)合,并反饋性抑制BMAL1-CLOCK 的轉(zhuǎn)錄活性[10-11], CHRONOBMAL1 被認(rèn)為是調(diào)控生物節(jié)律的重要通路。 另外,研究發(fā)現(xiàn),骨骼肌生物鐘核心分子BMAL1 參與調(diào)節(jié)骨骼肌胰島素敏感性[12],調(diào)控骨骼肌中糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的節(jié)律性變化,以維持血糖水平穩(wěn)定[13],骨骼肌BMAL1 缺失則會(huì)顯著降低骨骼肌葡萄糖攝取[6,l4-15]和糖耐量水平[16]。 因此,BMAL1 不僅參與骨骼肌生物鐘調(diào)節(jié),可能也是調(diào)節(jié)骨骼肌糖代謝的重要分子。 然而,CHRONO 作為BMAL1 的轉(zhuǎn)錄抑制因子,CHRONO-BMAL1 通路是否會(huì)對糖耐量產(chǎn)生影響? 進(jìn)而影響運(yùn)動(dòng)能力呢? 這些問題目前未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

因此,本研究擬通過骨骼肌特異性Chrono過表達(dá)和野生型小鼠,探討CHRONO-BMAL1 通路對糖耐量和運(yùn)動(dòng)能力的影響,為闡明調(diào)節(jié)糖耐量與影響骨骼肌健康的新機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

20 只8 周齡SPF 級C57BL/6N 野生鼠(Wild Type,WT),其中雄性10 只,體重(22.65 ± 0.21)g,雌性10 只,體重(18.41 ± 0.13)g。 20 只8 周齡SPF 級骨骼肌特異性Chrono過表達(dá)鼠(Chrono-TG),其中雄性10 只,體重(23.16 ± 0.37)g,雌性10 只,體重(18.69 ± 0.29)g。 WT 鼠由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供【SCXK(京)2016-0006】,Chrono-TG 鼠其背景為C57BL/6N 鼠,由賽業(yè)生物科技有限公司制作,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所負(fù)責(zé)繁育【SCXK(京)2019-0011】。

所有小鼠飼養(yǎng)及測試工作均在北京體育大學(xué)動(dòng)物房【SYXK(京)2021-0053】完成。 動(dòng)物房室內(nèi)溫度維持在25℃左右,相對濕度60% ～ 70%,12 h光照～12 h 黑暗周期(7:00 開,19:00 關(guān))。 飼養(yǎng)采用國家嚙齒類動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飼料,整個(gè)飼養(yǎng)過程動(dòng)物可以自由飲水、進(jìn)食。 本研究經(jīng)北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號:2021042A)。

1.1.2 主要試劑與儀器

血漿胰島素試劑盒(GEL2579-B,金恩來,中國北京),糖原含量檢測試劑盒(BC0345,索萊寶,中國北京),RNAiso Plus(9109,TaKaRa,日本),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(FSQ101,Toyobo,日本),SYBR Green Realtime PCR Master Mix(QPK-201,Toyobo,日本),18S引物( QT02448075, QIAGEN, 德 國)、Chrono引 物(QT01533749,QIAGEN,德國)。

小動(dòng)物體成分分析儀(Echo-MRI,美國),小鼠自主活動(dòng)轉(zhuǎn)輪籠系統(tǒng)(武漢一鴻科技,中國),動(dòng)物跑臺(tái)(Columbus Instruments,美國),小鼠抓力測試儀(北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技,中國),血糖儀及血糖試紙(三諾GA-6,中國),組織研磨儀(Next Advance,美國),低溫離心機(jī)(Eppendorf,德國),微量分光光度計(jì)(NanoDrop 2000,Thermo Fisher Scientific,美國),PCR 擴(kuò)增儀(A300,LongGene,中國杭州),熒光定量PCR 儀(ABI7500,美國)。

1.2 方法

1.2.1 體重、攝食量記錄及體成分測試

定時(shí)記錄各組小鼠每周體重及攝食量。 采用小動(dòng)物體脂成分分析儀對各組小鼠的脂肪含量和瘦體重含量進(jìn)行分析測定。

1.2.2 自主活動(dòng)性測試采用小鼠自主活動(dòng)轉(zhuǎn)輪籠系統(tǒng)連續(xù)記錄采集黑暗下72 h 小鼠自主活動(dòng)情況。

1.2.3 遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)能力測試

遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)能力測試參照Burch 等[17]的研究并進(jìn)行了改良。 具體如圖1:跑臺(tái)+5°坡度,以10 m/min 速度跑5 min,6 min 跑速增為13 m/min,之后每3 min 增加跑速3 m/min,讓小鼠運(yùn)動(dòng)至力竭。力竭的判斷標(biāo)準(zhǔn)是:小鼠不能維持現(xiàn)有跑速繼續(xù)運(yùn)動(dòng),機(jī)械刺激和電刺激小鼠10 s 以上仍不能繼續(xù)運(yùn)動(dòng)即判斷為力竭。

1.2.4 抓力測試

先進(jìn)行3 d 的抓力測試適應(yīng),正式測試時(shí)讓小鼠兩只前爪握住抓力桿,測試者抓住小鼠尾巴讓小鼠身體與抓力儀保持平行,并保證小鼠兩前爪能持續(xù)穩(wěn)定的發(fā)力,記錄下持續(xù)發(fā)力階段的握力最大值和平均值。

1.2.5 血糖及葡萄糖耐量測試

采集小鼠尾靜脈血,測試小鼠在非禁食狀態(tài)下的血糖值。

葡萄糖耐量試驗(yàn)(glucose tolerance test,GTT):小鼠禁食8 h 后,根據(jù)體重通過腹腔注射1 g/kg 體重的葡萄糖溶液(100 mg/mL)。 檢測小鼠尾靜脈末梢血糖水平,記錄下注射前(0 min)及注射后15、30、45、60、90 和120 min 7 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血糖值。

計(jì)算血糖曲線下面積(area under the curve,AUC)=(0 min 血糖值+15 min 血糖值)×15/2+(15 min 血糖值+30 min 血糖值)×15/2+(30 min 血糖值+45 min 血糖值)×15/2+(45 min 血糖值+60 min 血糖值)×15/2+(60 min 血糖值+90 min 血糖值)×30/2+(90 min 血糖值+120 min 血糖值)×30/2。

1.2.6 動(dòng)物取材及骨骼肌稱重

收集小鼠眼眶后靜脈血并制備血漿,隨后脫頸處死,取心臟、肝和腎,并迅速分離腿部骨骼肌,對各塊骨骼肌進(jìn)行稱重記錄,隨后用錫紙包好編號,投入液氮并轉(zhuǎn)入-80℃保存。

1.2.7 血漿胰島素測定

按照試劑盒說明書測定小鼠血漿中胰島素含量。

1.2.8 骨骼肌糖原含量檢測

取50 mg 腓腸肌,按照試劑盒說明書進(jìn)行糖原提取與測定。

1.2.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

提取腓腸肌總RNA,檢測目的基因Chrono、肌球蛋白重鏈I 型(MyhcI)、肌球蛋白重鏈IIa 型(MyhcIIa)、肌球蛋白重鏈IIb 型(MyhcIIb)、肌球蛋白重鏈IIx 型(MyhcIIx)、丙酮酸脫氫酶E1α 亞單位(Pdha1)的相對表達(dá)。 除內(nèi)參18S和Chrono外,其余引物序列由 Primerbank ( https:/ /pga. mgh.harvard.edu/primerbank/index.html)網(wǎng)站查詢獲得,見表1,由Thermo Fisher Scientific 合成。 取50 mg腓腸肌組織,加入800 μL 預(yù)冷的RNAiso Plus 進(jìn)行組織研磨,4℃,11 304 r/min 離心10 min 后取上清,氯仿分相,取上層無色水相用異丙醇分離RNA,4℃,11 304 r/min 離心20 min 后用75%乙醇洗滌RNA,然后進(jìn)行干燥,再懸浮,得到總RNA 提取液。測定所提RNA 濃度及純度,之后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)條件為65℃,5 min;37℃,15 min;98℃,5 min。 加入反應(yīng)體系和相應(yīng)的引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測。 通過儀器自帶軟件讀取實(shí)時(shí)熒光量CT 值,用比較CT 法對目的基因的表達(dá)進(jìn)行相對定量,公式如下:目的基因=2-ΔΔCT。

表1 引物信息Table 1 Information of primers

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理,結(jié)果用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤差(x-±sx-)表示。 采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,P＜ 0.05 和P＜ 0.01 分別代表具有顯著性和非常顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠不同組織Chrono mRNA 表達(dá)

在TG 鼠中,雌鼠骨骼肌ChronomRNA 表達(dá)顯著高出雄鼠65.36%;與WT 鼠比,其雄、雌鼠的心臟和腎中ChronomRNA 的表達(dá)略高,Chrono-TG 雄鼠心臟和腎中ChronomRNA 表達(dá)分別為WT 雄鼠的2.6 倍和2.07 倍,TG 雌鼠腎中ChronomRNA 表達(dá)為WT 雌鼠的3.98 倍,而TG 鼠腓腸肌(gastrocnemius)的ChronomRNA 表達(dá)則非常顯著地高于WT 鼠,雄鼠高49.88 倍,雌鼠高99.45 倍(圖2)。

2.2 各組小鼠體重、攝食量及體成分變化

在Chrono-TG 鼠中, 雌鼠體重從(18.69 ±0.29)g 增長至(21.00 ± 0.35) g,雄鼠體重從(23.16 ± 0.37)g 增長至(25.46 ± 0.39)g,整個(gè)飼養(yǎng)周期中雌鼠體重始終顯著低于雄鼠(P＜ 0.01),TG 雌鼠在第1、2 周攝食量明顯低于雄鼠(P＜0.05),體脂百分比和瘦體重百分比則無明顯變化;在WT 鼠中,雌鼠體重從(18.41 ± 0.13)g 增長至(21.49 ± 0.21)g,雄鼠則從(22.65 ± 0.21)g 增長至(26.62 ± 0.25)g,雌鼠體重始終顯著低于雄鼠(P＜ 0.01),且雌鼠在第2、3、4、5 周的攝食量均顯著低于雄鼠(P＜ 0.05 或P＜ 0.01)。Chrono-TG 雄鼠體重在第4、5 周分別為(25.09 ± 0.36)g 和(25.46 ±0.39)g,WT 雄鼠體重在第4、5 周則為(26.13 ±0.30)g 和(26.62 ± 0.25)g,在這兩周TG 雄鼠體重明顯低于WT 雄鼠(P＜ 0.05)(圖3)。

2.3 各組小鼠自主活動(dòng)變化

圖4A 可以看出,TG 鼠中雄鼠自主轉(zhuǎn)輪活動(dòng)總量為(20 628.91 ± 2 108.31)m,雌鼠自主轉(zhuǎn)輪活動(dòng)總量為(25 323.53 ± 2 772.84)m,雌雄并無明顯差異,WT 鼠中雄鼠自主轉(zhuǎn)輪活動(dòng)總量為(30017.26 ±1913.43)m,雌鼠為(35920.16 ± 1131.04)m,雌性活動(dòng)總量顯著高于雄性(P＜ 0.05);TG 鼠與WT 鼠相比,雌、雄鼠的自主轉(zhuǎn)輪活動(dòng)總量均顯著降低(P＜ 0.01)。 圖4B 顯示,在TG 鼠中,其雄鼠和雌鼠在全天24 h 內(nèi)的轉(zhuǎn)輪活動(dòng)量無顯著變化,在WT 鼠中,雌鼠在夜晚(19:00 ～ 7:00)明顯高于雄鼠(P＜0.05 或P＜ 0.01);TG 鼠與WT 鼠相比,雌、雄鼠在夜晚的轉(zhuǎn)輪活動(dòng)量均明顯減少(P＜ 0.05 或P＜0.01)。

2.4 各組小鼠跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)能力變化

從圖5 知,在TG 鼠中,雄鼠進(jìn)行遞增負(fù)荷至力竭的運(yùn)動(dòng)時(shí)間為(43.76 ± 1.57)min,運(yùn)動(dòng)距離為(1218.81 ± 77.53)m,雌鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)間為(44.17 ±1.14)min,運(yùn)動(dòng)距離為(1233.35 ± 57.90)m,雌雄之間無明顯變化;WT 雄鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)間為(51.34 ±1.35)min,距離為(1608.34 ± 75.22)m,WT 雌鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)間為(48.78 ± 1.81)min,距離為(1480.42 ±96.47)m,與WT 鼠比,TG 鼠其雌、雄鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)間和距離均顯著下降(P＜ 0.05 或P＜ 0.01)。

2.5 各組小鼠葡萄糖耐量、非禁食血糖和胰島素濃度變化

如圖6A 所示,在TG 鼠中,雌鼠在第30、45、60、90、120 min 的血糖值顯著低于雄鼠(P＜ 0.01),WT鼠中,雌鼠在第0、30、45、60、90、120 min 的血糖值明顯低于雄鼠(P＜ 0.05 或P＜ 0.01);TG 鼠與WT鼠相比,其雌、雄鼠在第15、30、45、60、90、120 min這6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血糖值都顯著升高(P＜ 0.05 或P＜ 0.01)。 圖6B 顯示,TG 雄鼠GTT 曲線下面積(AUC) 為(1161.82 ± 25.56),TG 雌 鼠AUC 為(1028.58 ± 18.30),WT 雄鼠AUC 為(1004.68 ±20.25),WT 雌鼠AUC 為(897.64 ± 22.34)。 在TG鼠和WT 鼠中,雌鼠AUC 均顯著低于雄鼠(P＜0.01),TG 鼠與WT 鼠相比,其雌、雄鼠AUC 均顯著升高(P＜ 0.01)。 圖6C 和6D 可以看出,TG 鼠中雌鼠非禁食血糖為(6.58 ± 0.25)mmol/L,血漿胰島素濃度為(9.79 ± 0.17)mIU/L,雄鼠非禁食血糖為(6.91 ± 0.12)mmol/L,胰島素為(9.69 ± 0.18)mIU/L,雌雄之間無明顯差異,WT 鼠中雌鼠非禁食血糖為(6.22 ± 0.13)mmol/L,顯著低于雄鼠的(6.93 ± 0.24)mmol/L(P＜ 0.05)。

2.6 各組小鼠抓力、骨骼肌重量及肌纖維類型mRNA 表達(dá)變化

圖7A 表明,在TG 鼠中,雌鼠抓力相對最大值(2.40 ± 0.11),相對平均值(2.09 ± 0.07),明顯高于雄鼠最大值(2.04 ± 0.08)和平均值(1.75 ±0.06)(P＜ 0.05 或P＜ 0.01);與WT 雄鼠抓力最大值(2.35 ± 0.10),平均值(2.04 ± 0.08)相比,TG雄鼠抓力最大值和平均值顯著降低(P＜ 0.05 或P＜ 0.01)。 圖7B 中顯示,TG 雌鼠腓腸肌和股四頭肌相對重量為(5.93 ± 0.08)和(7.93 ± 0.11),顯著低于TG 雄鼠的(6.44 ± 0.08)和(8.41 ± 0.10)(P＜ 0.01),WT 鼠中雌鼠的腓腸肌和股四頭肌相對重量為(5.40 ± 0.08)和(7.38 ± 0.10),顯著低于WT 雄鼠的(5.72 ± 0.06)和(7.76 ± 0.09)(P＜0.01);TG 鼠與WT 鼠比,其雌、雄鼠腓腸肌、比目魚肌、趾長伸肌、脛骨前肌和股四頭肌的相對重量都明顯增加(P＜ 0.05 或P＜ 0.01)。 圖7C 和7D 顯示,TG 鼠中,雌鼠和雄鼠骨骼肌MyhcI的mRNA 表達(dá)無明顯變化,雌鼠MyhcIIa、MyhcIIb和MyhcIIx的mRNA 表達(dá)則明顯多于雄鼠(P＜ 0.05),分別高0.54、0.38 和0.33 倍,WT 鼠中雌鼠MyhcIIa的mRNA 表達(dá)顯著高于雄鼠0.41 倍(P＜ 0.01);TG鼠與WT 鼠比,其雄鼠MyhcIIa和MyhcIIb的mRNA表達(dá)顯著降低32.35%和29.41%(P＜ 0.05 或P＜0.01),雌鼠MyhcIIamRNA 表達(dá)明顯減少26.39%(P＜ 0.05)。

2.7 各組小鼠肌糖原含量和骨骼肌丙酮酸脫氫酶(Pdha1)mRNA 表達(dá)變化

由圖8A 可看出, TG 雌鼠肌糖原含量為(0.0120 ± 0.0009) mg, TG 雄鼠為(0.0092 ±0.0002) mg,WT 雌鼠肌糖原含量為(0.0099 ±0.0005)mg,WT 雄鼠則為(0.0080 ± 0.0005)mg。在TG 鼠和WT 鼠中,雌鼠肌糖原含量均明顯高于雄鼠(P＜ 0.05 或P＜ 0.01);TG 鼠與WT 鼠相比,其雌、雄鼠肌糖原含量均顯著增多(P＜ 0.05)。 圖8B 顯示,TG 鼠中雌鼠骨骼肌Pdha1 mRNA 表達(dá)顯著多于雄鼠0.57 倍(P＜ 0.05);TG 鼠與WT 鼠相比,雄鼠骨骼肌中Pdha1 mRNA 表達(dá)顯著降低32.04%(P＜ 0.01)。

3 討論

Chrono是近年來在哺乳動(dòng)物中新發(fā)現(xiàn)的生物鐘基因[18-19]。Chrono可影響小鼠晝夜節(jié)律周期[9]。研究表明,Chrono是BMAL1 的靶基因,Chrono編碼的CHRONO 蛋白可以和內(nèi)源性BMAL1 相結(jié)合,并能抑制BMAL1-CLOCK 對其生物鐘靶基因的轉(zhuǎn)錄活性[10-11]。 因此,CHRONO 蛋白被認(rèn)為是BMAL1 的轉(zhuǎn)錄抑制因子,CHRONO-BMAL1 通路也是調(diào)控生物節(jié)律的重要通路[20]。

3.1 骨骼肌Chrono 過表達(dá)對小鼠自主活動(dòng)節(jié)律性的影響

本研究對該鼠不同組織器官進(jìn)行ChronomRNA表達(dá)的檢測,發(fā)現(xiàn)在心臟、腎和肝中ChronomRNA的表達(dá)與WT 鼠相比雖有所提高但倍數(shù)較小,而腓腸肌中ChronomRNA 的表達(dá)高于WT 鼠約50 ～100 倍,并表現(xiàn)出了較大的性別差異。 表明該鼠確實(shí)是骨骼肌特異性Chrono過表達(dá)鼠。

該研究對骨骼肌特異性Chrono-TG 鼠進(jìn)行自主活動(dòng)節(jié)律性測試,利用自主轉(zhuǎn)輪籠系統(tǒng)連續(xù)記錄小鼠的運(yùn)動(dòng)情況,發(fā)現(xiàn)在3 d 全黑時(shí)間里,TG 鼠總活動(dòng)量顯著低于WT 鼠,而在24 h 的晝夜周期中,7:00 ～ 19:00 為休息期,活動(dòng)量較少,在19:00 ～7:00 為活躍期,TG 鼠活動(dòng)量明顯低于WT 鼠,TG鼠其雌、雄鼠總活動(dòng)量和活躍期活動(dòng)量并無明顯差異。 表明骨骼肌Chrono過表達(dá)可顯著降低小鼠的自主活動(dòng)性,而這種影響并無性別差異。

3.2 骨骼肌Chrono 過表達(dá)對小鼠體重、攝食及體成分的影響

本研究觀察了骨骼肌Chrono過表達(dá)對小鼠體重、攝食量和體成分的影響,發(fā)現(xiàn)在攝食量和體成分上,TG 鼠和WT 鼠無顯著差異,而體重在飼養(yǎng)第4、5 周出現(xiàn)TG 雄鼠明顯低于WT 雄鼠的現(xiàn)象,這可能與TG 雄鼠攝食量始終偏低有關(guān),導(dǎo)致其體重增長速度低于WT 雄鼠,從而在飼養(yǎng)后期出現(xiàn)體重差異增加。 此外,兩種鼠在5 周飼養(yǎng)期內(nèi)體重和攝食量均出現(xiàn)明顯的性別差異,即雌鼠體重明顯低于雄鼠,攝食量總體上低于雄鼠,而體脂百分比和瘦體重百分比無性別差異。 以上表明,骨骼肌Chrono過表達(dá)對小鼠體重、攝食量和體成分影響不大。

3.3 骨骼肌Chrono 過表達(dá)對小鼠運(yùn)動(dòng)能力、抓力和肌纖維類型的影響

研究發(fā)現(xiàn),核心生物鐘基因Bmal1 的表達(dá)可影響機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力。Bmal1 基因敲除鼠與同窩對照鼠相比,白天進(jìn)行耐力運(yùn)動(dòng)的時(shí)間明顯增加,晚上則無變化[21]。 骨骼肌特異性Bmal1 基因敲除鼠與同窩對照鼠相比,跑臺(tái)測試中的運(yùn)動(dòng)距離和運(yùn)動(dòng)時(shí)間都顯著升高[22]。 然而也有研究表明,Bmal1 基因與運(yùn)動(dòng)能力關(guān)系不大。 骨骼肌特異性Bmal1 基因過表達(dá)小鼠在進(jìn)行遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)能力測試時(shí)的運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)及最大攝氧量與野生鼠并無差異[23]。

CHRONO 作為BMAL1 的轉(zhuǎn)錄抑制因子,其對運(yùn)動(dòng)能力的影響目前尚不明確,因此,本研究采用骨骼肌特異性Chrono過表達(dá)鼠和WT 鼠,進(jìn)行跑臺(tái)遞增負(fù)荷至力竭的運(yùn)動(dòng)能力測試,TG 鼠運(yùn)動(dòng)至力竭的時(shí)間和距離均明顯低于WT 鼠,TG 鼠遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)至力竭的運(yùn)動(dòng)能力無性別差異。 表明骨骼肌Chrono過表達(dá)可顯著降低小鼠有氧運(yùn)動(dòng)能力。

生物鐘基因Bmal1 還可影響骨骼肌重量及肌纖維類型。Bmal1 敲除會(huì)使小鼠肌肉力量下降,粗細(xì)肌絲的超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損壞,甚至出現(xiàn)嚴(yán)重的肌肉萎縮等[24-26]。 非誘導(dǎo)型和可誘導(dǎo)型骨骼肌特異性Bmal1 敲除小鼠,均表現(xiàn)出正常的骨骼肌形態(tài)及超微結(jié)構(gòu),同時(shí)肌肉重量略有增加,肌纖維橫截面積也更大,但肌肉力量有所下降,快肌纖維比例減少[14,27]。

而Chrono基因是否也會(huì)對骨骼肌產(chǎn)生影響呢?目前尚不清楚。 因而本研究對小鼠骨骼肌相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)TG 鼠其雌、雄鼠的腓腸肌、比目魚肌、趾長伸肌、脛骨前肌和股四頭肌的相對重量都明顯高于WT 鼠,骨骼肌相對重量也表現(xiàn)出性別差異,WT 雌鼠和TG 雌鼠的腓腸肌與股四頭肌相對重量均顯著低于各自雄鼠。 此外,對小鼠前肢的抓力測試顯示,TG 雄鼠的抓力顯著低于WT 雄鼠,兩種雌鼠間無明顯差異,而雌性TG 鼠抓力則顯著大于雄性TG 鼠。 TG 雄鼠的骨骼肌相對重量較大,但其抓力卻較小,其原因可能與骨骼肌纖維類型的改變有關(guān),而持續(xù)較短時(shí)間的前肢抓力則更多與快肌纖維相關(guān)[28]。 本研究對小鼠腓腸肌纖維類型進(jìn)行mRNA 表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn),慢肌纖維即MyhcI型在TG 鼠和WT 鼠中并無較大變化,但快肌纖維即MyhcII型的差異卻比較明顯,TG 雄鼠的MyhcIIa和MyhcIIb型肌纖維表達(dá)顯著低于WT 雄鼠,TG 雌鼠3 種II 型肌纖維的表達(dá)均高于TG 雄鼠,這可能是造成TG 雄鼠抓力比WT 雄鼠和TG 雌鼠均較差的原因。

3.4 骨骼肌Chrono 過表達(dá)對小鼠糖耐量、肌糖原和骨骼肌丙酮酸脫氫酶(Pdha1)mRNA 表達(dá)的影響

核心生物鐘基因Bmal1 被證實(shí)可顯著影響骨骼肌糖代謝功能。 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,沉默Bmal1 基因會(huì)減弱C2C12 細(xì)胞的胰島素信號通路作用,產(chǎn)生明顯的胰島素抵抗[12]。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,骨骼肌Bmal1特異性敲除可顯著下調(diào)糖代謝相關(guān)基因mRNA 表達(dá),使骨骼肌糖酵解作用減弱,葡萄糖吸收利用減少和糖耐量水平下降[13-14,16]。 而骨骼肌Bmal1 過表達(dá)會(huì)降低急性睡眠剝奪后小鼠骨骼肌的胰島素敏感性[29]。

本研究發(fā)現(xiàn),CHRONO 作為BMAL1 的轉(zhuǎn)錄抑制因子,與BMAL1 相同也會(huì)對小鼠糖耐量水平產(chǎn)生顯著影響。 TG 鼠糖耐量血糖值及曲線下面積都明顯高于WT 鼠,并且在WT 鼠和TG 鼠中都呈現(xiàn)出非常明顯的性別差異,即雌鼠的糖耐量血糖值和曲線下面積顯著低于雄鼠,而在血漿胰島素和非禁食血糖方面,TG 鼠與WT 鼠相比并無異常。 同時(shí)TG雌、雄鼠肌糖原含量均明顯高于WT 鼠,出現(xiàn)肌糖原大量積累的情況,而TG 雄鼠丙酮酸脫氫酶Pdha1 mRNA 的表達(dá)顯著低于WT 雄鼠,丙酮酸脫氫酶是糖酵解進(jìn)入三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵[30],其表達(dá)減少提示糖有氧氧化過程受到抑制。 另外,兩種雌鼠的肌糖原均明顯高于各自相應(yīng)雄鼠,Pdha1 mRNA 的表達(dá)也高于雄鼠或有升高的趨勢,這可能是造成小鼠糖耐量出現(xiàn)性別差異的原因之一。 以上結(jié)果表明,骨骼肌Chrono過表達(dá)可導(dǎo)致小鼠肌糖原堆積,骨骼肌Pdha1 mRNA 表達(dá)減少,糖耐量異常。

骨骼肌Chrono過表達(dá)可降低小鼠自主活動(dòng)性,導(dǎo)致糖耐量降低,并影響有氧運(yùn)動(dòng)能力。

參 考 文 獻(xiàn)(References)

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