邢淑雁,晉一帆,王含雪,孫竹筠,孫啟慧,劉孝云,葉冬雪,宮寧遠,李正昊,楊勇*,容蓉,3*

(1.山東中醫(yī)藥大學藥學院,濟南 250355;2.山東中醫(yī)藥大學實驗中心,濟南 250355;3.山東省高校中醫(yī)藥抗病毒協(xié)同創(chuàng)新中心,濟南 250355;4.山東省中醫(yī)藥抗病毒工程研究中心,濟南 250355)

目前,肺癌動物模型的構(gòu)建方法有異位移植法、原位移植法、化學誘導法等[1-4]。 其中,異位皮下移植是將體外培養(yǎng)的腫瘤細胞移植到動物身上與腫瘤原發(fā)部位不相關(guān)的部位。 由于其操作簡單方便、實驗周期短、可復制性強以及易于觀察等特點,故成為肺癌實驗研究中動物造模最常用的方法[5]。 但由于腫瘤細胞脫離了體外培養(yǎng)條件而進入體內(nèi),生長環(huán)境發(fā)生改變,加之實驗人員操作誤差、動物個體差異等因素,易導致成瘤率、腫瘤大小均不穩(wěn)定,使該造模方法的應用受到局限。 因此,找到一種優(yōu)化并穩(wěn)定該造模方法的解決方案意義重大。 研究發(fā)現(xiàn),近年來基質(zhì)膠越來越多的應用于構(gòu)建小鼠異位皮下移植瘤模型。 Matrigel 基質(zhì)膠來源于Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤的基底膜基質(zhì),其主要成分有層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白,還包含基質(zhì)金屬蛋白酶和各種細胞因子[6-7]。 這是一種4℃時呈液體狀態(tài),22 ～35℃時迅速凝膠,以固態(tài)形式存在形成交聯(lián)網(wǎng)絡,從而使細胞分散均勻,聚合形成具有生物學活性的三維基質(zhì)[8]。 基質(zhì)膠作為一種輔助物質(zhì),可為腫瘤細胞的侵襲、遷移、管腔結(jié)構(gòu)的形成及細胞的生化功能等提供有利的生存條件,更好的模擬了腫瘤細胞的體內(nèi)生長環(huán)境,從而提高了腫瘤細胞在體內(nèi)成瘤的比例和速度[9-10]。

盡管基質(zhì)膠在穩(wěn)定成瘤率及提高腫瘤生長速度方面優(yōu)勢明顯,但其應用的適宜濃度尚未明確,因此,本研究旨在探討Matrigel 濃度對小鼠Lewis 肺癌異位皮下移植瘤成瘤的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級C57BL/6J N 雄性小鼠24 只,4 周齡,體重17 ～ 19 g,購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2021-0006】;飼養(yǎng)于山東省高校中醫(yī)藥抗病毒協(xié)同創(chuàng)新中心【SYXK(魯)2017-0022】。經(jīng)適應性喂養(yǎng)3 d 后,按體重隨機分為4 組,分別為肺癌組、50%基質(zhì)膠組、75%基質(zhì)膠組、100%基質(zhì)膠組,每組各6 只。 飼養(yǎng)期間小鼠自由飲食和飲水,燈光12 h 循環(huán),室溫維持在22 ～ 25℃,濕度40% ～60%。 本實驗所有操作已通過山東中醫(yī)藥大學實驗動 物 福 利 倫 理 審 查 委 員 會 的 批 準(SDUTCM20211123001)。

1.1.2 細胞

LLC 小鼠肺癌細胞(CL-0140),購于武漢普諾賽生命科技有限公司,培養(yǎng)于山東省高校中醫(yī)藥抗病毒協(xié)同創(chuàng)新中心二級生物安全實驗室,將細胞置于含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM 完全培養(yǎng)基中,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每1 d 更換培養(yǎng)液1 次,每2 d 用0.25%胰酶消化傳代1 次。

1.1.3 主要試劑與儀器

胎牛血清(BI 公司,以色列,批號:2022057);高糖DMEM 培養(yǎng)基(Gibco 公司,美國,批號8121488);青霉素-鏈霉素溶液(Gibco 公司,美國,批號:2321127);0.25%胰蛋白酶(Gibco 公司,美國,批號:2186956);1 × PBS 緩沖液(biosharp 公司,美國,批號:71012000);Matrigel 高濃度基質(zhì)膠(BD 公司,美國,貨號:354248);氯化鈉注射液(青州堯王制藥有限公司,批號:2220030305);異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司,批號:21082101);75%乙醇消毒液(山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司,批號:210407)。

HF safe 1200LC 生物安全柜、HF-90 CO2培養(yǎng)箱(上海力申科學儀器有限公司);CKX41 倒置相差顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社);TC20 細胞計數(shù)儀(美國Bio-Rad 公司);TDZ5-WS 醫(yī)用離心機(湖南平凡科技有限公司);MP10001 型電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司);TC25H6 型獨立通氣籠IVC(蘇州市蘇杭科技器械有限公司;R550IE 小動物麻醉機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);250 μL 微量進樣器(上海高鴿工貿(mào)有限公司);寵物局部剃毛器(寧波銳雷森電器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 Matrigel 基質(zhì)膠的分裝及處理

-20℃保存的基質(zhì)膠冰浴條件下置于4℃冰箱過夜,待完全融化后將其置于超凈臺內(nèi),使用經(jīng)無菌并提前預冷的1.5 mL EP 管、1 mL 槍頭進行分裝,每個EP 管裝有基質(zhì)膠體積為1 mL,分裝后將其置于-20℃冰箱保存。 每次實驗前,將分裝凍存的Matrigel 基質(zhì)膠從-20℃冰箱取出,冰浴條件下置于4℃冰箱解凍。 待完全融化后,進行后續(xù)實驗。

1.2.2 構(gòu)建Lewis 肺癌模型

待細胞匯合率達90%以上,吸棄舊細胞培養(yǎng)基,用PBS 緩沖液洗1 遍,加1 mL 0.25%胰酶消化1 min 左右,吹打,制成單細胞懸液。 1095 r/min 離心4 min 后,棄上清,加入生理鹽水重懸細胞沉淀,使細胞充分懸浮于生理鹽水中,并進行細胞計數(shù),參照文獻[11]方法并進行調(diào)整,配制濃度為4 × 107cells/mL 的細胞懸液,備用。 用pH=7.4 的PBS 稀釋已完全解凍的基質(zhì)膠,分別配制濃度為50%、75%和100%的基質(zhì)膠溶液,將上述4 × 107cells/mL 密度的細胞懸液,與Matrigel 基質(zhì)膠溶液按體積1 ∶1混勻,各制備1 mL 的混懸液,于SPF 級實驗室備用,所有操作均在冰浴中進行。 對小鼠進行呼吸麻醉,將異氟烷麻醉劑量調(diào)為4、氧氣流速調(diào)為3,小鼠麻醉后,對其右側(cè)前肢腋下脫毛,并用75%乙醇消毒,用250 μL 無菌微量進樣器吸取上述混懸液,按照每只100 μL,即每只小鼠注射約2 × 106個活細胞,于右側(cè)前肢腋下處斜行入針,刺入皮下,形成圓形小皮丘,注射完按壓入針點,緩慢出針。

1.2.3 動物一般情況觀察

每天測量小鼠體重、飲食、飲水量,記錄一般體征,包括自主活動、對外界刺激的反應、皮毛光澤情況和精神狀態(tài)等。

1.2.4 腫瘤體積的測量

觀察腫瘤形成情況,實體瘤形成后,每天用游標卡尺讀取小鼠皮下腫瘤最大長徑a(mm)和短徑b(mm),根據(jù)瘤體體積計算公式:V(mm3)= 1/2 ab2,計算各組小鼠腫瘤體積變化。

1.2.5 腫瘤重量的記錄

造模14 d 結(jié)束后,完整剝?nèi)×鲶w,拍照并稱重,比較各組小鼠實體瘤的重量。

1.2.6 HE 染色檢測腫瘤組織病變情況

完整剝離腫瘤組織,立即切取大約5 mm 厚度的瘤塊,放入4%多聚甲醛溶液中固定,常規(guī)制備石蠟包埋塊,切片5 μm,常規(guī)HE 染色,封口片后,于光學顯微鏡下觀察腫瘤組織形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計學分析

運用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計分析,各組數(shù)據(jù)在分析前進行正態(tài)性檢驗和方差分析,正態(tài)分布數(shù)據(jù)以平均值 ± 標準差(±s)表示,多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析,以P＜ 0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤細胞生長情況

Lewis 肺癌細胞放于倒置顯微鏡下觀察,細胞形態(tài)正常,呈上皮細胞樣,貼壁生長,多數(shù)呈圓形,少數(shù)呈梭形,外形完整,大小不一,排列不規(guī)則,生長狀態(tài)良好。

2.2 一般情況檢測結(jié)果

2.2.1 一般體征

造模前7 d,小鼠活潑好動,皮毛光亮順滑,反應靈敏,精神狀態(tài)良好。 造模8 d 后,隨著腫瘤增長,部分小鼠出現(xiàn)行動遲緩,精神倦怠,皮毛失去光澤,形體消瘦,75%基質(zhì)膠組和100%基質(zhì)膠組小鼠因腫瘤體積較大,出現(xiàn)行動不便、疲乏無力等現(xiàn)象。

2.2.2 體重

肺癌組小鼠體重總體呈現(xiàn)緩慢上升趨勢。 與肺癌組相比,自造模第2 天起,75%基質(zhì)膠組小鼠體重顯著升高(P＜ 0.05 或P＜ 0.01);自造模第10天起,100%基質(zhì)膠組小鼠體重明顯上升(P＜ 0.05或P＜ 0.01);50%基質(zhì)膠組小鼠體重沒有明顯差異(P＞ 0.05)。 各組小鼠的體重變化趨勢見圖1。

2.2.3 平均日飲食量

造模前7 d,小鼠平均日飲食量維持在3 g 左右,造模第8 天后,小鼠平均日飲食量較前7 d 有所降低,與肺癌組相比,各基質(zhì)膠組小鼠平均日飲食量沒有明顯變化。 小鼠平均日飲食量變化見圖2。

2.2.4 平均日飲水量

各組小鼠平均日飲水量總體呈現(xiàn)上升趨勢,與肺癌組相比,各基質(zhì)膠組小鼠平均日飲水量無明顯差異。 各組小鼠的平均日飲水量變化見圖3。

2.3 腫瘤評價結(jié)果

2.3.1 成瘤率及腫瘤形態(tài)

與肺癌組相比,添加基質(zhì)膠組的小鼠成瘤較早。 各基質(zhì)膠組小鼠于接種腫瘤細胞第6 天、肺癌組小鼠于接種腫瘤細胞第7 天,在接種部位觸及到質(zhì)地較軟的突起,隨著時間的延長,腫塊逐漸增大,成瘤率為100%。 與肺癌組相比,75%基質(zhì)膠組和100%基質(zhì)膠組的腫瘤形狀較規(guī)則,大小較均勻。 各組小鼠腫瘤情況見圖4。

2.3.2 腫瘤體積

與肺癌組相比,添加基質(zhì)膠組的小鼠腫瘤生長速度較快。 接種腫瘤細胞第6 天,50%基質(zhì)膠組、75%基質(zhì)膠組、100%基質(zhì)膠組于接種部位可見小突起,第7 天肺癌組小鼠于右側(cè)前肢腋下可觸及較軟突起,自接種腫瘤細胞第8 天起,與肺癌組相比,75%基質(zhì)膠組和100%基質(zhì)膠組腫瘤增長迅速,體積顯著增大(P＜ 0.05,P＜ 0.01);自接種腫瘤細胞第10 ～ 13 天,與肺癌組相比,50%基質(zhì)膠組腫瘤體積明顯增大(P＜ 0.05,P＜ 0.01)。 各組小鼠腫瘤體積增長結(jié)果見圖5。

2.3.3 腫瘤重量

與肺癌組相比,添加基質(zhì)膠組的小鼠腫瘤重量均有所增大,其中,75%基質(zhì)膠組腫瘤重量最大,100%基質(zhì)膠組次之,50%基質(zhì)膠組最小;與肺癌組相比,75%基質(zhì)膠組和100%基質(zhì)膠組腫瘤重量增大具有顯著性差異(P＜ 0.05)。 75%基質(zhì)膠組小鼠的腫瘤變異系數(shù)最小,低于肺癌組,說明此基質(zhì)膠濃度下的成瘤均一性最好。 各組小鼠腫瘤重量結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠的腫瘤重量測定結(jié)果(±s,n = 6)Table 1 Tumor weight measurement results of mice in each group(±s, n = 6)

表1 各組小鼠的腫瘤重量測定結(jié)果(±s,n = 6)Table 1 Tumor weight measurement results of mice in each group(±s, n = 6)

組別Groups腫瘤重量(mg)Tumor weight(mg)離散系數(shù)(CV = images/000.png±s)Discrete coefficient(CV = images/000.png±s)肺癌組Lung cancer group 621.82 ± 181.19 0.29 50%基質(zhì)膠組50% Matrigel group 808.83 ± 393.41 0.48 75%基質(zhì)膠組75% Matrigel group 1358.88 ± 388.14* 0.28 100%基質(zhì)膠組100% Matrigel group 1142.37 ± 423.08* 0.37

2.4 腫瘤組織病理學檢查結(jié)果

腫瘤組織切片HE 染色觀察,肺癌組的腫瘤細胞形狀不規(guī)則,多呈圓形或橢圓形,細胞核大小不一,深染,異形性明顯;50%基質(zhì)膠組、75%基質(zhì)膠組、100%基質(zhì)膠組的腫瘤細胞輪廓清晰、核體積較大,分布密集,多呈現(xiàn)片狀分布,細胞生長旺盛,隨著基質(zhì)膠濃度的增大,腫瘤組織間質(zhì)中血管成分明顯增多,細胞間有結(jié)締組織浸潤。 各組小鼠腫瘤組織病理切片結(jié)果見圖6。

3 討論

肺癌動物模型是人類研究肺癌的重要手段,建立合適的動物模型對肺癌的發(fā)生機制、診斷的研究及藥物篩選具有十分重要的意義。 按照腫瘤細胞來源不同,小鼠肺癌模型主要分為自發(fā)性、誘發(fā)性、移植性和基因修飾等[12]。 其中,移植性腫瘤模型是目前應用最多的腫瘤模型。 移植性動物模型又可分為原位移植和異位移植。 異位皮下移植因其操作簡單且易于觀察成瘤情況,此建模方法已被廣泛采用。 但也存在一定的局限性,異位皮下移植脫離了其起源組織器官的腫瘤微環(huán)境,需要克服腫瘤細胞由體外培養(yǎng)條件轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)環(huán)境的不適應性而導致的成瘤率及腫瘤大小不穩(wěn)定等問題。 因此,如何實現(xiàn)腫瘤細胞從體外培養(yǎng)到體內(nèi)生長的過渡、穩(wěn)定成瘤率及腫瘤生長的均一性,是肺癌動物模型研究亟待解決的問題。

近年來,Matrigel 已廣泛應用于構(gòu)建小鼠體內(nèi)腫瘤模型。 研究發(fā)現(xiàn),Matrigel 可以促進細胞分化,提高腫瘤細胞接種后的成瘤性[13]。 Matrigel 是從小鼠腫瘤中提取出的基底膜基質(zhì),包含多種蛋白和生長因子,有利于腫瘤細胞在動物體內(nèi)的快速增殖,同時Matrigel 在生理體溫下會迅速凝結(jié)固化,有助于腫瘤細胞錨定在皮下某一固定位置,促進實體瘤的形成[14],具有促進細胞增殖分化、血管生成、組織成形等作用,對提高成瘤率、縮短成瘤時間及促進腫瘤生長具有重要作用[15-16]。 本文研究發(fā)現(xiàn),添加基質(zhì)膠對小鼠一般體征、飲食量及飲食量影響不大,對體重的影響可能是由于腫瘤本身重量增長引起,而且基質(zhì)膠的成分多來源于小鼠,相對安全可靠。

盡管Matrigel 應用廣泛,但其應用的適宜濃度尚未明確。 Matrigel 常用的種類有標準濃度Matrigel(蛋白濃度范圍:8 ～ 12 mg/mL)和高濃度Matrigel(蛋白濃度范圍:18 ～ 22 mg/mL)兩種,標準型Matrigel 融化后為澄清液體,蛋白濃度越高,融化后的液體越粘稠。 對于小鼠體內(nèi)的成瘤實驗,應選用高濃度Matrigel,高蛋白濃度不僅增加腫瘤的生長,還能保證注射后的細胞的定位及腫瘤的完整性[17]。但高濃度的Matrigel 在使用時也存在一定的問題,不僅液體流動性差,且較易凝固成膠,給注射操作帶來一定的困難。 對于Matrigel 基質(zhì)膠的應用濃度,文獻方法多以基質(zhì)膠原始濃度與細胞懸液按照等體積1 ∶1 稀釋[18-19]。 是否蛋白濃度越高越有利于腫瘤的生長,尚待進一步研究。

找到Matrigel 應用的最佳濃度以進一步突出該建模方法的優(yōu)勢,對后續(xù)實驗的理論及實踐基礎的建立具有重要意義。 本研究在已有研究的基礎上,用pH=7.4 的PBS 配置了50%、75%、100% 3 種濃度的基質(zhì)膠,再將不同濃度的基質(zhì)膠與細胞懸液按照等體積1 ∶1 稀釋,按照每只100 μL 給小鼠注射。探討不同濃度的Matrigel 對小鼠Lewis 肺癌異位皮下移植瘤成瘤的影響。 結(jié)果顯示,75%濃度的基質(zhì)膠組小鼠腫瘤體積增長最快,腫瘤最大,且形狀規(guī)則、大小均勻;100%濃度的基質(zhì)膠組腫瘤體積增長和腫瘤重量次之;50%濃度的基質(zhì)膠組腫瘤體積增長最慢,腫瘤最小。 表明75%濃度的基質(zhì)膠是小鼠皮下腫瘤生長的適宜濃度條件,可為后期基質(zhì)膠應用于小鼠皮下移植瘤模型的建立提供理論參考。

參 考 文 獻(References)

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