◇海南熱帶海洋學(xué)院生態(tài)環(huán)境學(xué)院 劉書(shū)偉 王 燕 張?zhí)锾?/p>

為探索海綿動(dòng)物天然產(chǎn)物的抑菌效果，以70%乙醇為提取溶劑，使用熱回流法提取海綿乙醇總浸膏，以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇為萃取液依次萃取總浸膏，采用KB法開(kāi)展萃取物抑菌試驗(yàn)。結(jié)果顯示，乙醇總浸膏提取率為5.3545%±0.4702%，各萃取物的質(zhì)量不同，其大小順序?yàn)槭兔眩径燃淄椋疽宜嵋阴ィ菊〈?。不同的萃取物?duì)3種菌的抑制效果不同，石油醚萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果較好，5個(gè)濃度均達(dá)到中敏狀態(tài)，最大抑菌直徑為12.22mm±0.52mm；二氯甲烷和乙酸乙酯萃取物對(duì)枯草芽孢桿菌抑制效果較好，其中乙酸乙酯萃取物對(duì)枯草芽孢桿菌抑制效果更為突出，5個(gè)濃度均達(dá)到中敏狀態(tài)以上，且在40、50mg/mL濃度時(shí)，達(dá)到了高敏狀態(tài)，最大抑菌直徑為17.35mm±0.54mm；正丁醇萃取物對(duì)3種菌不敏感。該實(shí)驗(yàn)可為海綿動(dòng)物天然產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)提供理論支撐。

海洋是生命的搖籃，也是巨大藥物寶庫(kù)，海洋生物因其生存在高鹽、高壓、缺氧、低溫、低營(yíng)養(yǎng)、無(wú)光照以及局部高溫等特殊生態(tài)環(huán)境中，促使其在生長(zhǎng)和代謝過(guò)程中，產(chǎn)生并積累了大量具有特殊化學(xué)結(jié)構(gòu)并具有特殊生理活性及功能的物質(zhì)，為海洋藥物研究和開(kāi)發(fā)提供大量的新材料[1]。海綿動(dòng)物是僅次于珊瑚的第二大海洋底棲生物，具有豐富的生物多樣性，被認(rèn)為是天然產(chǎn)物的重要來(lái)源[2]，據(jù)報(bào)道，從海洋無(wú)脊椎動(dòng)物中分離出1.5萬(wàn)多種海洋天然產(chǎn)物中30%以上來(lái)自海綿[3]，尤其是具有細(xì)胞毒性的化合物超過(guò)10%，顯著高于其他海洋動(dòng)物、陸生植物和微生物[4]，為新藥研制提供了大量高活性的先導(dǎo)化合物，目前海綿已成為海洋生物中研究最積極的領(lǐng)域之一[5]。海綿天然產(chǎn)物主要包括生物堿、聚酮類(lèi)化合物、萜類(lèi)化合物、肽類(lèi)、芳烴類(lèi)、類(lèi)萜類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、類(lèi)固醇類(lèi)和鹵代化合物[6-8]等物質(zhì)，該類(lèi)物質(zhì)表現(xiàn)出豐富的化學(xué)多樣性，并且顯示了較好的生物活性，如抗菌活性、抗癌活性、抗病毒活性、抗炎活性、防污活性和抗氧化活性[9-10]等。海綿動(dòng)物的抑菌活性是海綿天然產(chǎn)物的一個(gè)重要研究領(lǐng)域，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)海綿動(dòng)物天然產(chǎn)物的提取和萃取，進(jìn)一步探索海綿動(dòng)物天然產(chǎn)物的抑菌活性，為抑菌藥物的開(kāi)發(fā)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

海綿動(dòng)物材料采自海南省陵水黎族自治縣新村潟湖及其新城鎮(zhèn)附近海域。石油醚（AR）、二氯甲烷（AR）、乙酸乙酯（AR）和無(wú)水乙醇（AR）購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

（1）海綿動(dòng)物乙醇提取物的制備、萃取及抑菌液配制。取100g左右干燥海綿動(dòng)物，剪成小塊，用70%的乙醇熱回流提取。乙醇提取物依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行萃取，得到相應(yīng)的萃取物。將4種萃取物與無(wú)菌水分別配置成濃度為10、20、30、40、50mg/mL的溶液，將陽(yáng)性對(duì)照四環(huán)素配制成10mg/mL的溶液，以上溶液均采用0.22μm的除菌過(guò)濾膜過(guò)濾，用于抑菌實(shí)驗(yàn)。

（2）菌液制備。將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌活化并在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將細(xì)菌離心沉淀后用無(wú)菌PBS稀釋至濃度為1×108CFU/mL，備用。

（3）抑菌圈直徑測(cè)定。采用Sofyanita E N[11]的方法并稍作修改，即紙片擴(kuò)散法（K-B法），無(wú)菌條件下向直徑為9cm的培養(yǎng)皿中加入 25mLLB瓊脂培養(yǎng)基，冷卻凝固后把100μL菌液均勻涂抹在培養(yǎng)基表面待用。將直徑為6mm的濾紙片滅菌烘干后，采用十字交叉法放置于培養(yǎng)基上，輕壓濾紙片使其與培養(yǎng)基完全接觸。然后將2μL萃取物溶液滴加到濾紙片上，置于37℃環(huán)境下培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑。

（4）數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。利用SPSS19.0軟件和Microsoft Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 海綿動(dòng)物乙醇提取物的萃取量分析

表1顯示，海綿動(dòng)物的乙醇提取物（總浸膏）的提取量較低，每100g樣品中獲取總浸膏為5.3765g±0.4730g，占樣品質(zhì)量的5.3545%±0.4702%；采用4種溶劑對(duì)乙醇總浸膏的萃取量也較低，萃取量最大的為石油醚層萃取物，占總浸膏質(zhì)量的5.8569%±0.2271%，最低的為正丁醇萃取物，占總浸膏質(zhì)量的0.6566%±0.0668%，萃取量大小順序?yàn)槭兔眩径燃淄椋疽宜嵋阴ィ菊〈迹辉谳腿∵^(guò)程中的損失量占總浸膏的0.0044%±0.0009%。

表1 各提取物的質(zhì)量及其百分比

2.2 海綿動(dòng)物總浸膏的萃取物的抑菌活性分析

（1）石油醚萃取物抑菌活性。抑菌圈直徑大小反映出提取物抑菌的活性狀況，抑菌圈直徑越大，抑菌效果越明顯，本試驗(yàn)采用抑菌圈直徑大小判斷抑菌強(qiáng)度[12]：極敏狀態(tài)，Φ≥20mm；高敏狀態(tài)20＞Φ≥15mm；中敏狀態(tài)15＞Φ≥9mm；低敏狀態(tài)9＞Φ≥7mm；不敏感，Φ＜7mm。表2顯示，在試驗(yàn)所采用的3種菌中，石油醚萃取物抑菌效果最好的菌種為金黃色葡萄球菌，在濃度為10mg/mL時(shí)已達(dá)到中敏狀態(tài)；其次是枯草芽孢桿菌，在濃度為10mg/mL時(shí)為低敏狀態(tài)，濃度大于20mg/mL時(shí)均達(dá)到中敏狀態(tài)；對(duì)大腸桿菌的抑制效果最差，濃度在30、40、50mg/mL才達(dá)到低敏狀態(tài)。在每個(gè)濃度中，對(duì)3種菌的抑菌效果差異性均達(dá)到顯著水平（p＜0.05），在濃度為10mg/mL時(shí)差異性達(dá)到極顯著水平（p＜0.01）。此外，抑菌效果均低于陽(yáng)性對(duì)照。

表2 不同濃度石油醚萃取物的抑菌圈直徑（mm）

（2）二氯甲烷層萃取物抑菌活性。表3顯示，在試驗(yàn)所采用的3種菌中，二氯甲烷萃取物抑菌效果最佳的菌種為枯草芽孢桿菌，僅在10mg/mL濃度時(shí)為不敏感，在20mg/mL濃度時(shí)為低敏狀態(tài)，其他濃度均為中敏狀態(tài)；其次是金黃色葡萄球菌，10mg/mL濃度不敏感，其他濃度均為低敏狀態(tài)；5個(gè)濃度水平對(duì)大腸桿菌均不敏感。二氯甲烷萃取物對(duì)三種菌的抑菌效果差異性方面，在30、40、50mg/mL濃度時(shí)，差異性均達(dá)到極顯著水平（p＜0.01），在10mg/mL濃度時(shí)，差異性不顯著水平（p＜0.05）。二氯甲烷萃取物抑菌效果整體低于石油醚萃取物，且均低于陽(yáng)性對(duì)照。

表3 不同濃度二氯甲烷萃取物的抑菌圈直徑（mm）

（3）乙酸乙酯層萃取物抑菌活性。表4顯示，在試驗(yàn)所采用的3種菌中，乙酸乙酯萃取物抑菌效果最佳的菌種為枯草芽孢桿菌，5個(gè)濃度抑菌效果均達(dá)到中敏狀態(tài)以上，在40、50mg/mL濃度時(shí)，均達(dá)到了高敏狀態(tài)；其次是大腸桿菌，在30、40、50mg/mL濃度時(shí)達(dá)到中敏狀態(tài)，在20mg/mL濃度時(shí)為低敏狀態(tài)，僅在10mg/mL濃度時(shí)不敏感；效果最差的是金黃色葡萄球菌，5個(gè)濃度對(duì)該菌均不敏感。乙酸乙酯萃取物對(duì)三種菌的抑菌效果差異性方面，枯草芽孢桿菌與其他兩種菌相比，抑菌效果差異均顯著（p＜0.05），且均達(dá)到極顯著水平（p＜0.01）。盡管乙酸乙酯萃取物對(duì)枯草芽孢桿菌抑制效果很不錯(cuò)，但也低于陽(yáng)性對(duì)照。

表4 不同濃度乙酸乙酯萃取物的抑菌圈直徑（mm）

（4）正丁醇層萃取物抑菌活性。表5顯示，在試驗(yàn)所采用的3種菌中，正丁醇萃取物抑菌效果均不理想，5個(gè)濃度抑菌效果均為不敏感，且抑菌效果差異均不顯著（p＞0.05），所以，海綿動(dòng)物乙醇提取物的各層萃取物對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌效果較差，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表5 不同濃度正丁醇萃取物的抑菌圈直徑（mm）

3 結(jié)論

（1）乙醇總浸膏占樣本質(zhì)量的百分比較低，僅為（5.3545±0.4702）%；乙醇總浸膏的萃取物質(zhì)量差異較大，其大小順序?yàn)槭兔眩径燃淄椋疽宜嵋阴ィ菊〈肌?/p>

（2）石油醚萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果優(yōu)于其他3種萃取物對(duì)該菌的抑制效果，5個(gè)濃度均達(dá)到中敏狀態(tài)；二氯甲烷和乙酸乙酯萃取物對(duì)枯草芽孢桿菌抑制效果優(yōu)于對(duì)其他兩種菌的抑制效果，且乙酸乙酯萃取物抑制效果更突出；正丁醇萃取物對(duì)三種菌抑制效果都很差，都屬于不敏感的范疇。

（3）4種萃取物對(duì)3種菌的抑制效果表現(xiàn)最突出的是乙酸乙酯萃取物對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果，5個(gè)濃度均達(dá)到中敏狀態(tài)以上，其中在40、50mg/mL濃度時(shí)，達(dá)到了高敏狀態(tài)。