蔡蕭君，李 宇，王 欽，吳圓圓，胡 楊，頡彥鵬

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036）

肺纖維化是一種嚴(yán)重的纖維化間質(zhì)性肺疾病。盡管疾病發(fā)展模式不盡相同，但癥狀出現(xiàn)后生存期一般為3～5年［1-3］。患者多數(shù)表現(xiàn)出非特定的癥狀和體征，如勞累時(shí)呼吸困難、吸氣性爆裂音和無(wú)痰干咳等［4-5］。60歲以上有吸煙史的男性，患肺纖維化的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，但確切機(jī)制仍不清楚［6-7］。目前認(rèn)為，異常的肺泡上皮傷口愈合和促纖維化通路激活是肺纖維化的主導(dǎo)誘因［8］。此外，肌成纖維細(xì)胞的積聚和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生導(dǎo)致肺組織瘢痕化，致使肺功能喪失［9-12］。臨床診斷方法多以支氣管鏡和肺活檢等侵入性方法為主，給患者及家庭帶來(lái)極大的痛苦和負(fù)擔(dān)，因此亟待發(fā)現(xiàn)靶向性的肺纖維化臨床生物標(biāo)志物。

臨床上，肺纖維化細(xì)胞樣本容易獲得，且針對(duì)性強(qiáng)，這為肺纖維化的臨床研究提供了合適的研究對(duì)象。隨著組學(xué)技術(shù)及質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展，采用超高效液相色譜和高分辨率質(zhì)譜聯(lián)用（UHPLC-MS）的非靶向代謝譜分析為發(fā)現(xiàn)病理調(diào)控分子提供了可能。這些分子為發(fā)現(xiàn)新的診斷或預(yù)后生物標(biāo)志物提供了機(jī)會(huì)。

丹貝益肺方由黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院江柏華教授依據(jù)多年的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而成，臨床療效顯著［13-17］。本研究在前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上采用代謝組學(xué)技術(shù)研究人胚肺成纖維細(xì)胞（MRC-5）的代謝情況，并以丹貝益肺方加以干預(yù)，從代謝通路及關(guān)鍵代謝酶角度揭示丹貝益肺方治療肺纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

MRC-5購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。人胚肺正常細(xì)胞購(gòu)自凱基生物有限公司中心。2-甲氧基乙氧基甲基氯/厄爾平衡鹽溶液（MEM/EBSS）培養(yǎng)基購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。四甲基噻唑藍(lán)（MTT，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)20200615）；磷酸鹽緩沖液（PBS，北京索寶來(lái)有限公司，批號(hào)P1022）；胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技有限公司）；青霉素-鏈霉素混合溶液（美國(guó)HyClone公司，批號(hào)SV30009）；超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨（UHPLC-Q-Exactive）質(zhì)譜系統(tǒng)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；酶標(biāo)液M15（上海纖檢儀器有限公司）；XPR205D5/AC分析天平（梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易上海有限公司）；ZJHK-40L超純水機(jī)（天津卓精虹科儀器設(shè)備技術(shù)有限公司）。

丹參、平貝母、桃仁、地龍、川芎、桔梗、黃芪、黨參、補(bǔ)骨脂、麥冬、五味子均購(gòu)自哈爾濱世一堂有限公司，經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院主任藥師杜虹韋鑒定為正品。

1.2 丹貝益肺方提取物及PBS、MTT溶液制備

丹貝益肺方的組成：丹參、黃芪各30 g，平貝母、黨參、麥冬、桔梗各20 g，川芎、桃仁、五味子、補(bǔ)骨脂、地龍各15 g。以上藥物按照傳統(tǒng)工藝［17］，由黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院藥劑科監(jiān)制，蒸餾水稀釋成1 mg/mL的丹貝益肺方提取物。

將PBS緩慢加入三蒸水，完全溶解后裝入100 mL玻璃小瓶中，用塞子塞緊后用紗布包嚴(yán)，用棉線扎緊，高壓蒸汽滅菌后4℃保存，即為PBS溶液。

稱取0.085 g的MTT粉末加入17 mL的PBS溶液中，以0.22 μm一次性過(guò)濾器過(guò)濾除菌，置-20℃保存，即為MTT溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與處理

將經(jīng)丹貝益肺方提取物預(yù)處理24 h的MRC-5設(shè)為給藥組，棄去預(yù)處理液，加入細(xì)胞維持液，在37℃、5%CO2的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后收獲上清液；另取未經(jīng)丹貝益肺方提取物干預(yù)的MRC-5為模型組，未經(jīng)丹貝益肺方提取物干預(yù)的人胚肺正常細(xì)胞為空白組，兩組其他處理與給藥組一致。收集三組上清液標(biāo)本后置-80℃保存，用于代謝組學(xué)分析。

1.4 樣本處理

取各組樣本，0℃水浴解凍100 μL，按1∶4比例加入純甲醇400 μL，渦旋震蕩10 min，靜置60 min，14 000 r/min離心15 min，離心半徑為16 cm。取上清液用于代謝組學(xué)檢測(cè)。

1.5 各組細(xì)胞代謝組學(xué)測(cè)定

采用UHPLC-Q-Exactive質(zhì)譜系統(tǒng)，色譜柱為Accucore RP-MS Column（100×2.1 mm，2.6 μm）；柱溫：30℃；流速：0.3 mL/min。流動(dòng)相A為0.1%甲酸水、B為0.1%甲酸乙腈。梯度洗脫條件：0～4 min，99%A；4～5 min，99%A→25%A；5～6 min，25%A→15%A；6～9 min，15%A→1%A；9～10 min，1%A→99%A。

質(zhì)譜采集模式首先分別以正負(fù)離子模式下的全掃模式對(duì)所有樣本進(jìn)行采集，掃描范圍50～1200 m/z，其中，正離子電壓噴霧電壓3500 V、負(fù)離子電壓噴霧電壓2500 V、鞘氣流量40 Arb、輔助氣流量6 Arb、反吹氣流量0 Arb、離子傳輸管溫度350℃。批量掃描后，將各組樣本各自混合，再運(yùn)用Acequire X模式的數(shù)據(jù)依賴性掃描進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)數(shù)據(jù)的精準(zhǔn)定性采集。

1.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率

活細(xì)胞線粒體內(nèi)膜呼吸鏈中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為不溶于水的深紫色甲臜結(jié)晶狀顆粒并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。甲顆粒能被二甲基亞砜（DMSO）溶解，在一定細(xì)胞數(shù)量范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶量與細(xì)胞數(shù)成正比，在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定，可反映活細(xì)胞的數(shù)量。給藥組給予50 μg/mL的丹貝益肺方提取物，再向各組加入含有10%FBS的MEM/EBSS培養(yǎng)液，置于37℃、5%的CO2飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。在避光條件下加入20 μL的MTT（5 mg/mL），置于37℃、5%CO2的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，取上清液加入150 μL的DMSO溶液，搖勻置于酶標(biāo)儀，490 nm讀取吸光度（OD）值。設(shè)置無(wú)細(xì)胞只加空白培養(yǎng)基為調(diào)零組，每組設(shè)6個(gè)平行孔。利用OD值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，設(shè)OD值為A，細(xì)胞增殖抑制率=（給藥組A-調(diào)零組A）/（模型組A-調(diào)零組A）×100%。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Compound Discoverer 3.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)采集的全掃數(shù)據(jù)及包含一級(jí)、二級(jí)碎片信息的Acequire X定性數(shù)據(jù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理及模式識(shí)別分析。通過(guò)無(wú)監(jiān)督的主成分分析方法（PCA）對(duì)所有樣本進(jìn)行多維數(shù)據(jù)的組間評(píng)價(jià)。PCA能客觀反映各組樣本的組間差異和總體趨勢(shì)，對(duì)模型評(píng)價(jià)及藥物干預(yù)作用有客觀及全面的指導(dǎo)意義。進(jìn)一步通過(guò)t檢驗(yàn)及偏最小二乘判別分析（PLS-DA）篩選空白組和模型組間的差異離子信息，結(jié)合火山圖信息，通過(guò)Fold Change及P值的大小確定差異離子，并通過(guò)mzCloud及mzVault構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鑒定。最后通過(guò)Metaboanalyst 4.0在線工具對(duì)差異離子進(jìn)行富集分析，聚焦肺纖維化的發(fā)病機(jī)制及丹貝益肺方可能的干預(yù)機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制情況比較

與空白組比較，模型組細(xì)胞OD值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，給藥組細(xì)胞OD值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。給藥組細(xì)胞增殖抑制率為94%，明顯高于模型組。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞增殖抑制情況比較（n=6）

2.2 代謝組學(xué)結(jié)果

整體代謝輪廓如圖1所示（以正離子模式數(shù)據(jù)為例）?？瞻捉M、模型組和給藥組聚類明顯，給藥組與空白組呈部分重合狀態(tài)，證明丹貝益肺方對(duì)MRC-5有顯著的干預(yù)作用。模型組整體與空白組及給藥組差距較大，證明MRC-5與人胚肺正常細(xì)胞的代謝有明顯差異。

圖1 各組樣本主成分分析得分圖

進(jìn)一步采用PLS-DA對(duì)空白組和模型組間進(jìn)行對(duì)比篩選，選擇Fold Change大于1且P＜0.05的成分作為差異離子，并以可視化形式將兩種數(shù)據(jù)以火山圖橫縱坐標(biāo)形式進(jìn)行整合，見(jiàn)圖2。結(jié)合PLS-DA火山圖，選擇遠(yuǎn)離原點(diǎn)的數(shù)據(jù)作為判定依據(jù)進(jìn)行篩選，見(jiàn)圖3。

圖2 空白組和模型組的火山圖

圖3 空白組和模型組偏最小二乘判別分析圖

生物標(biāo)志物鑒定是代謝組學(xué)的難點(diǎn)和重點(diǎn)，為達(dá)到對(duì)差異成分的精準(zhǔn)鑒定，本部分采用一級(jí)母離子數(shù)據(jù)和二級(jí)碎片信息數(shù)據(jù)相結(jié)合的方法對(duì)代謝物質(zhì)譜信息進(jìn)行解析，同時(shí)比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫(kù)信息進(jìn)行鑒定，最終得到6個(gè)差異代謝物，分別為溶血磷脂酰膽堿（LPC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、左旋肉堿、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺。見(jiàn)表2和圖4。鑒定過(guò)程以PE、左旋肉堿、谷氨酰胺及谷氨酸為例。見(jiàn)圖5。

圖4 人胚肺成纖維細(xì)胞生物標(biāo)志物含量箱型圖

圖5 差異代謝物二級(jí)鑒定過(guò)程

表2 人胚肺成纖維細(xì)胞生物標(biāo)志物詳表

為明確MRC-5代謝異常的通路及代謝過(guò)程，將上述結(jié)果帶入在線數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行通路富集分析，結(jié)果見(jiàn)圖6。主要涉及精氨酸生物合成、天冬氨酸和谷氨酸代謝、D-谷氨酰胺代謝等。將相關(guān)代謝物及代謝通路匯總繪制肺纖維化細(xì)胞代謝通路示意圖，見(jiàn)圖7。

圖6 人胚肺成纖維細(xì)胞代謝通路富集分析

圖7 人胚肺成纖維細(xì)胞代謝通路圖

3 討論

近年來(lái)，受環(huán)境變化的影響，肺纖維化患者逐年增加，但臨床上有效且不良反應(yīng)小的藥物尚未被發(fā)現(xiàn)。丹貝益肺方是黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院江柏華教授依據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而成，療效顯著，但其存在組方復(fù)雜、成分頗多、作用靶標(biāo)不明確等問(wèn)題，嚴(yán)重制約了本方的推廣。

目前，隨著儀器和分析技術(shù)的飛速發(fā)展，組學(xué)技術(shù)正逐漸成為解決生命科學(xué)問(wèn)題的主力手段，其中代謝組學(xué)是在基因組、蛋白組、轉(zhuǎn)錄組之后新興的組學(xué)技術(shù)。不同于以往常規(guī)的檢測(cè)方法，代謝組學(xué)采取高通量的檢測(cè)手段對(duì)生物體宏觀代謝進(jìn)行綜合考察。因此，本課題基于細(xì)胞代謝組學(xué)，采用UHPLCQ-Exactive質(zhì)譜技術(shù)對(duì)丹貝益肺方作用靶標(biāo)進(jìn)行研究，為丹貝益肺方治療肺纖維化提供可靠數(shù)據(jù)支撐，以期發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物用于臨床診斷和處方指導(dǎo)。

本研究共得到6個(gè)差異代謝物，分別為L(zhǎng)PC、PEs、左旋肉堿、天冬氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺。LPC可調(diào)節(jié)許多直接參與肺纖維化的基因表達(dá)，如一氧化氮合酶、生長(zhǎng)因子（如表皮生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子和黏附分子），還可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和遷移［16］。Mizobuchi等［18］發(fā)現(xiàn)磷脂酶A2可將磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)PC，參與溶血磷脂酸生成，抑制自交軸蛋白表達(dá)，降低肺纖維化患病概率。本研究發(fā)現(xiàn)，給與丹貝益肺方提取物干預(yù)后，LPC水平表現(xiàn)出回調(diào)趨勢(shì)，表明LPC可能對(duì)肺纖維化有抑制作用。

PE是生物膜中含量第二豐富的磷脂，與LPC一起構(gòu)成了大多數(shù)真核細(xì)胞膜的骨架。PE對(duì)細(xì)胞分裂至關(guān)重要，但PE缺乏時(shí)，細(xì)胞線粒體因形態(tài)異常無(wú)法完成細(xì)胞分裂和分離。有研究表明，細(xì)胞中PE的增加會(huì)提高氧化能力，而脂質(zhì)氧化的增加是神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一個(gè)共同特征［19-20］。此外，有研究認(rèn)為PE水平的升高可以作為肺癌的診斷標(biāo)志［21］。本研究中，給與丹貝益肺方提取物干預(yù)后，PE表現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì)，表明PE升高可能對(duì)肺纖維化有抑制作用。

有研究表明，肺組織中的游離肉堿水平可能與進(jìn)行性肺氣腫有關(guān)，而三羧酸（TCA）循環(huán)的上調(diào)導(dǎo)致腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）生成增加，氣道腔中細(xì)胞外ATP水平的增加通過(guò)炎癥細(xì)胞的募集和激活，加速炎癥和組織降解，與肺纖維化發(fā)病機(jī)制相關(guān)［22］。本研究中，模型組細(xì)胞中左旋肉堿含量呈升高趨勢(shì)，給藥組左旋肉堿含量下調(diào)，表明丹貝益肺方提取物干預(yù)可以有效抑制肺纖維化。

谷氨酰胺是細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)的代謝產(chǎn)物之一，經(jīng)谷氨酰胺酶脫氨基生成谷氨酸，谷氨酸脫氫生成α-酮戊二酸進(jìn)入TCA循環(huán)為細(xì)胞氧化供能。研究表明，轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）可增強(qiáng)谷氨酰胺酶1的表達(dá)，從而增強(qiáng)肌成纖維細(xì)胞中的谷氨酰胺分解；阻斷谷氨酰胺分解或沉默谷氨酰胺酶1，可減少TGF-β1誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞分化［23］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)丹貝益肺方提取物干預(yù)后，谷氨酰胺呈下調(diào)趨勢(shì)，且基本達(dá)到正常水平，提示其可能參與抑制肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化過(guò)程。

既往肺纖維化生物標(biāo)志物研究中未發(fā)現(xiàn)天冬氨酸、谷氨酸，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)丹貝益肺方干預(yù)后二者均呈上調(diào)趨勢(shì)，但其明確的分子機(jī)制還需進(jìn)一步深入探究。目前已有研究報(bào)道，抗氧化多肽的抗纖維化活性與殘基天冬氨酸、組氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺密切相關(guān)［24］，表明天冬氨酸與肺纖維化存在相關(guān)性。

本研究旨在直觀分析MRC-5的代謝表達(dá)譜，為確定肺纖維化診斷和治療的代謝標(biāo)志物提供可靠依據(jù)。結(jié)果表明，肺纖維化的形成機(jī)制較為復(fù)雜，涉及精氨酸生物合成、天冬氨酸和谷氨酸代謝及D-谷氨酰胺代謝等通路。這些代謝物的變化與肺纖維化及其他肺部疾病密切相關(guān)，可作為預(yù)測(cè)肺纖維化發(fā)展的群體標(biāo)志物，代謝調(diào)節(jié)可能是肺纖維化新療法發(fā)展的一個(gè)目標(biāo)。