胡佳瑤，王悟敏，匡雪韶，劉文勝

(中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410004)

錳(manganese，簡稱Mn)是植物正常生長發(fā)育必不可少的微量元素，直接參與植物光合作用，對葉綠體膜正常結(jié)構(gòu)的維持具有重要意義[1].過量錳則會對植物產(chǎn)生毒害作用，甚至能通過食物鏈危害人類健康[2].錳礦開采帶來經(jīng)濟效益的同時，也造成了大面積的錳污染，嚴重影響了人們正常的生產(chǎn)生活[3].因而，治理錳礦區(qū)污染已刻不容緩.植物修復(fù)技術(shù)有著成本低、適應(yīng)范圍廣、環(huán)境擾動小以及治理效果持久等優(yōu)點而受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注，篩選耐錳性較強的植物是利用該技術(shù)的關(guān)鍵之一[4].

種子萌發(fā)和幼苗生長是植物生長發(fā)育過程中最脆弱的時期，該階段最能夠體現(xiàn)植物對逆境的耐受性.植物在受到重金屬脅迫時，體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸)和抗氧化酶活性(過氧化物酶(peroxidase，簡稱POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，簡稱SOD)和過氧化氫酶(catalase，簡稱CAT))等都會發(fā)生一系列變化來緩解脅迫所帶來的毒害，而丙二醛(malondialdehyde，簡稱MDA)是植物細胞膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，其含量的高低可用來反映植物被毒害的程度[5].因而，脅迫條件下，植物種子萌發(fā)、幼苗生長以及生理生化特征的變化是植物適應(yīng)環(huán)境的重要機制.例如，王波等[6]研究發(fā)現(xiàn)，南荻(Triarrhenalutarioriparia)的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均隨鉛、鎘濃度的增加而下降.曹婧等[7]研究發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿(Medicagosativa)的株高、生物量和抗氧化酶活性均隨著錳脅迫的增加而先升后降，MDA含量則持續(xù)上升.

大葉胡枝子(Lespedezadavidii)為豆科(Fabaceae)胡枝子屬(Lespedeza)的一種直立灌木，廣泛分布于我國南方地區(qū).該植物抗逆性強，可在多種生境中生長，能生物固氮，是逆境生物治理的重要選擇[8-9].筆者對湖南湘潭錳礦廢棄地調(diào)查顯示，大葉胡枝子在該區(qū)域生長良好，能夠正常開花結(jié)實，這說明它具有較強的錳污染耐受能力.因而，該植物是錳尾礦區(qū)一種可選擇的重要修復(fù)植物.目前，大葉胡枝子的相關(guān)研究主要集中于其藥用價值方面[10-11]，關(guān)于錳脅迫下該植物適應(yīng)性機制尚未系統(tǒng)研究，這限制了該植物的進一步應(yīng)用.

筆者以大葉胡枝子為對象，在不同濃度錳脅迫下開展種子萌發(fā)及幼苗生長實驗，研究該植物種子的萌發(fā)特性以及不同時期幼苗的生理生化特征，探究其在錳脅迫下的生理耐受機制，以期為錳污染區(qū)的植物修復(fù)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大葉胡枝子種子于2019年11月采于湖南湘潭錳礦區(qū)(28°03′E，112°55′N).現(xiàn)場調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該植物可在礦區(qū)土壤錳含量達52 319.25 mg·kg-1的土壤中自然生長，其高度達1.7 m，且能夠正常開花結(jié)實.選擇其中50株長勢良好的大葉胡枝子，采集其果實并裝入布袋帶回實驗室，于室溫保存?zhèn)溆?，稱量結(jié)果顯示該植物種子千粒重為9.39 g.

1.2 實驗方法

1.2.1 種子萌發(fā)實驗

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果及馬彥軍等[12]的研究，為提高種子萌發(fā)率，挑選大小一致、顆粒飽滿的種子采用濃硫酸浸泡法處理種子，即用濃硫酸浸泡種子10 min，破除其硬實性.根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果并參考潘高等[13]的方法，設(shè)置錳脅迫濃度為5 000，15 000 μmol·L-1.由于錳為植物生長的必需元素，其5 μmol·L-1是植物正常生長需要的微量元素水平[14]，參照梁文斌、豆長明、吳惠芳等[15-17]的研究，設(shè)置錳濃度5 μmol·L-1為對照.利用MnCl2·4H2O設(shè)置5(對照)、5 000和15 000 μmol·L-13個錳處理開展相關(guān)實驗.萌發(fā)實驗在溫度為(26±0.5)℃，12 h光照/12 h黑暗的人工氣候培養(yǎng)箱中進行.萌發(fā)時，種子放入裝有兩層濾紙、直徑為90 mm的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿放置25粒種子，每個濃度設(shè)有5個重復(fù)，共計放置15個培養(yǎng)皿375粒種子.萌發(fā)實驗開始后，每24 h換1次錳溶液和濾紙，以保持脅迫濃度恒定.每天定時記錄種子萌發(fā)情況.胚根突破種皮1/2視為種子萌發(fā)，連續(xù)3 d無新種子萌發(fā)即為結(jié)束.實驗結(jié)束后測定大葉胡枝子幼苗的生物量，計算種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)與根冠比.

1.2.2 幼苗生長實驗

將處理后的種子放入裝有150 mL基質(zhì)(V(沙)∶V(珍珠巖)=1∶1)的塑料杯中，然后放入人工培養(yǎng)箱中(與萌發(fā)實驗相同條件)，每天適量澆水，當子葉展開后用1/2 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)幼苗.待幼苗長出5～6片真葉時，加入與萌發(fā)試驗相同的錳濃度處理，繼續(xù)培養(yǎng)，期間每3 d澆1次Hoagland營養(yǎng)液，分別在脅迫第7，15，30天時對幼苗葉片進行生理生化指標測定.

1.3 測定項目和方法

1.3.1 種子萌發(fā)指標測定

參照文獻[13]測定：發(fā)芽率=10 d正常發(fā)芽種子數(shù)/總種子數(shù)×100%，發(fā)芽勢=4 d正常發(fā)芽種子數(shù)/總種子數(shù)×100%，發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)，活力指數(shù)(VI)=GI×h，其中：Gt為在t日的發(fā)芽種子數(shù)，Dt為發(fā)芽天數(shù)，h為幼苗高度.

1.3.2 幼苗生物量指標測定

萌發(fā)結(jié)束后，每個處理隨機采集10棵幼苗，用游標卡尺(0.1 mm)測量其芽長和根長.用解剖刀將其分為地上和地下兩部分，稱量鮮重后裝入信封，放進烘箱中烘至恒重(先105 ℃殺青5 min，然后70 ℃繼續(xù)烘至恒重).根冠比=地下部分干重/地上部分干重[18].

1.3.3 生理生化指標測定

脅迫后每個處理取鮮樣0.1 g，每個處理3個重復(fù)，生理生化指標用以下方法測定：丙酮浸提法測定大葉胡枝子葉片中光合色素含量；氮藍四唑法測定葉片中SOD活性；愈創(chuàng)木酚法測定葉片中POD活性(以每分鐘OD值變化0.01為1個酶活性單位)；紫外吸收法測定葉片中CAT活性(以每分鐘OD值變化0.01為1個酶活性單位)；蒽酮比色法測定葉片中可溶性糖含量；考馬斯亮藍法測定葉片中可溶性蛋白含量；酸性茚三酮顯色法測定葉片中游離脯氨酸含量；硫代巴比妥酸法測定葉片中MDA含量[19].

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0進行LSD(p<0.05)多重比較分析.利用Sigma Plot 12.5進行繪圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 萌發(fā)及幼苗生長

如表1所示，大葉胡枝子種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)都隨錳濃度的升高而顯著降低(p<0.05)，錳脅迫為15 000 μmol·L-1時，其發(fā)芽勢低于26.00%，相對于對照減少了34.69%；發(fā)芽指數(shù)低于21.00，相對于對照減少了17.77%；活力指數(shù)低于1.00，相對于對照減少了25.20%.錳脅迫對該植物的種子發(fā)芽率無明顯影響(p>0.05)，均在98%左右.

表1 錳脅迫對大葉胡枝子種子萌發(fā)的影響

如表2所示，大葉胡枝子幼苗的根長、芽干重、根干重、總干重和根冠比均隨錳濃度的升高而先增加后減少，5 000 μmol·L-1處理的錳對該植物幼苗的根長、干重和根冠比有明顯的促進作用，其根干重和對照相比差異顯著(p<0.05)，芽長差異則不顯著(p>0.05).錳濃度為15 000 μmol·L-1時，該植物幼苗的芽長、根長和干重相比對照均顯著下降(p<0.05)，分別減少了24.90%，56.19%，32.52%.

表2 錳脅迫對大葉胡枝子幼苗生長的影響

2.2 光合色素含量

如表3所示，錳處理的不同時間和不同錳濃度對葉綠素a和類胡蘿卜素含量有顯著影響(p<0.001)，且他們的交互作用顯著(p<0.001).不同錳濃度對葉綠素b含量有顯著影響(p<0.001)，不同時間則對其影響不顯著(p>0.05)，他們的交互作用顯著(p<0.05).錳脅迫7 d時，大葉胡枝子幼苗葉片內(nèi)葉綠素a含量隨錳濃度增加而顯著下降(p<0.05)，分別比對照減少了13.46%和10.20%，葉綠素b含量先減少后增加，類胡蘿卜素含量先增加后減少；錳脅迫15 d時，葉綠素a、葉綠素b含量隨錳濃度增加而顯著下降(p<0.05)，類胡蘿卜素則先上升后下降；錳脅迫30 d時，葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素隨錳濃度增加而顯著下降(p<0.05)，且均在15 000 μmol·L-1錳處理達到最低值，比對照分別減少了25.13%，15.38%，21.21%.

表3 錳脅迫對大葉胡枝子幼苗光合色素含量的影響

2.3 抗氧化酶活性

測定錳處理的不同時間和不同錳濃度時大葉胡枝子幼苗葉片中相應(yīng)抗氧化酶的活性，結(jié)果如圖1所示.

圖柱上不同小寫字母表示同一時間內(nèi)不同濃度間的比較差異顯著(p<0.05).Ft代表處理時間的F值；Fc代表錳濃度的F值；Ft×c代表處理時間與錳濃度交互作用的F值；*代表0.05水平下影響顯著，***代表0.001水平下影響極顯著.

由圖1可知，不同處理時間、不同錳濃度對SOD，POD，CAT活性有顯著影響(p<0.001)，且他們的交互作用顯著(p<0.001).

大葉胡枝子幼苗葉片中SOD活性隨時間的推移而升高，且在3個時間段均隨錳濃度的增大而顯著上升(p<0.05)，在15 000 μmol·L-1錳處理15 d時達到最大值.30 d時，5 000 μmol·L-1和15 000 μmol·L-1錳處理的SOD活性相比于15 d的有所減少，分別減少了12.32%和16.99%.

POD活性隨時間的推移而逐漸降低，處理7 d時隨錳濃度的增加而顯著上升(p<0.05)，處理15 d和30 d時則隨錳濃度的增大而顯著降低(p<0.05)，在30 d時15 000 μmol·L-1錳處理處達到最低值.30 d時，5 000 μmol·L-1和15 000 μmol·L-1錳處理的POD活性相比于對照有所減少，分別減少了21.52%和49.32%.

CAT活性隨時間的推移而先上升后下降，在處理7 d和15 d時隨錳濃度的增大而顯著上升(p<0.05)；在處理30 d時則隨錳濃度的增大而先上升后下降，15 000 μmol·L-1錳處理30 d時達到最低值；5 000 μmol·L-1和15 000 μmol·L-1錳處理30 d時的CAT活性相比于15 d時的有所減少，分別減少了9.46%和57.10%.

2.4 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量

測定處理不同時間和不同錳濃度時大葉胡枝子幼苗葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，結(jié)果如圖2所示.

圖柱上不同小寫字母表示同一時間內(nèi)不同濃度間的比較差異顯著(p<0.05).Ft代表處理時間的F值；Fc代表錳濃度的F值；Ft×c代表處理時間與錳濃度交互作用的F值；*代表0.05水平下影響顯著，***代表0.001水平下影響極顯著.

由圖2可知，不同時間和不同錳濃度處理對可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸含量有顯著影響(p<0.001)，且他們的交互作用顯著(p<0.001).大葉胡枝子幼苗葉片可溶性糖隨錳脅迫時間的推移而不斷升高，隨錳濃度的升高而增加，且在處理15 d和30 d時差異顯著(p<0.05).在15 000 μmol·L-1錳處理30 d時可溶性糖含量達到了最大值，相比于對照增加了127.00%.

可溶性蛋白含量隨錳處理時間的推移而逐漸升高，隨錳濃度的升高而增加，且在處理7 d和15 d時差異顯著(p<0.05).在15 000 μmol·L-1錳處理30 d時可溶性蛋白含量達到最大值，相比于對照增加了310.34%.

游離脯氨酸含量隨錳處理時間的推移而先升高后降低，隨錳濃度的升高而增加，且在處理7 d和15 d時差異顯著(p<0.05).15 000 μmol·L-1錳處理幼苗葉片的游離脯氨酸含量在處理7 d時達到最大值，相比于對照增加了325.62%，處理30 d時達到最低值，相比于處理7 d減少了43.29%.

2.5 MDA含量

測定處理不同時間和不同錳濃度時大葉胡枝子幼苗葉片中MDA的含量，結(jié)果如圖3所示.

圖柱上不同小寫字母表示同一時間內(nèi)不同濃度間的比較差異顯著(p<0.05).Ft代表處理時間的F值；Fc代表錳濃度的F值；Ft×c代表處理時間與錳濃度交互作用的F值；*代表0.05水平下影響顯著，***代表0.001水平下影響極顯著.

如圖3所示，不同處理時間和錳濃度對MDA含量有顯著影響(p<0.001)，且他們的交互作用顯著(p<0.001).大葉胡枝子幼苗葉片中MDA含量隨錳處理時間的推移而逐漸升高，隨錳濃度的升高而增加，且在處理15 d和30 d時差異顯著(p<0.05).30 d時15 000 μmol·L-1錳處理的MDA含量達到了最大值，為61 nmol·g-1，比對照增加了226.20%.

3 討 論

3.1 種子萌發(fā)及幼苗生長

種子萌發(fā)和幼苗生長是植物對逆境最敏感的階段，脅迫條件下的發(fā)芽和生長能力可體現(xiàn)該植物的耐受性.該研究中，錳脅迫對大葉胡枝子種子發(fā)芽率無明顯影響，與張龍沖等[20]對鉻脅迫下虎耳草(Saxifragastolonifera)的研究結(jié)果一致.說明大葉胡枝子對錳有一定的耐受能力，能在錳含量相對較高的環(huán)境下萌發(fā).其原因可能是大葉胡枝子的種子較大，相對于小種子其耐錳能力和發(fā)芽能力更強[21].隨錳濃度的升高，該植物種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均降低，與鄒璐璐等[22]對鎘脅迫下河岸帶草本植物的研究結(jié)果一致.說明高濃度的錳脅迫對大葉胡枝子種子萌發(fā)速度有影響.

研究顯示，大葉胡枝子幼苗的生物量隨錳濃度的升高而先增加后減少，與陳麗麗等[23]在鋅脅迫下稗草(Echinochloacrusgali)幼苗的研究結(jié)果一致.說明低濃度的錳能使植物的生物量增加.其原因可能是低濃度的錳促進了植物光合作用，使營養(yǎng)物質(zhì)生產(chǎn)加快，植物生物量增加.隨著錳濃度的增加，該植物幼苗的根受到的抑制作用比芽大.這與肖厚軍等[24]對油菜(Brassicarapavar.oleifera)的研究結(jié)果一致.其原因可能是根作為植物吸收重金屬的主要器官，它與錳溶液直接接觸，受到的錳毒害程度大于芽.

3.2 幼苗光合色素含量

葉綠素含量是衡量植物光合作用強弱的重要生理參數(shù)，能夠體現(xiàn)植物對逆境的耐受性[25].在該研究中，隨著錳濃度的增加，大葉胡枝子幼苗葉片內(nèi)葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量不斷降低，且在錳最高濃度15 000 μmol·L-1處理時達到最低值，與張寶成等[26]對錳脅迫下小飛蓬(Erigeroncanadensis)和汪結(jié)明等[27]對3種蕨類的研究結(jié)果一致，說明錳濃度過高時，超出了植物所能耐受的范圍，植物細胞中的葉綠體則會受到毒害，光合能力減弱.其原因是錳是組成葉綠體的必需元素，直接參與植物的光合放氧過程，當錳濃度較高時，植物受到了毒害，抑制了葉綠素的合成和相關(guān)酶活性，葉綠素分解的速度加快，葉綠素含量降低.

3.3 抗氧化酶活性

SOD，POD和CAT共同構(gòu)成了植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)，具有清除植物體內(nèi)活性氧、減輕逆境毒害的重要作用.SOD是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，SOD活性越高表明植物的抗逆性越強.該研究中，大葉胡枝子幼苗葉片中SOD活性隨錳濃度的增高而上升，與Li等[28]對鎘脅迫下葦狀羊茅(Festucaarundinacea)和李強等[29]對錳脅迫下三色堇(Violatricolor)的研究結(jié)果一致.其原因可能是隨著錳濃度的升高，植物為應(yīng)對高錳毒害，SOD活性不斷增強以減緩錳脅迫導(dǎo)致的氧化傷害；但隨著時間的推移，高濃度的錳脅迫超出了植物所能承受范圍，植物內(nèi)環(huán)境紊亂，SOD最適環(huán)境遭到破壞，其活性降低.

POD活性隨著時間的推移而逐漸降低，在處理7 d時隨錳濃度的增大顯著上升，在處理15 d和處理30 d時則隨錳濃度的增大而降低.這與徐玲玲等[30]在鎘脅迫下3種草本植物研究結(jié)果一致.其原因可能是在錳含量較高的情況下，隨著脅迫時間的增加，植物產(chǎn)生活性氧的速度加快，從而導(dǎo)致植物細胞受到毒害程度加大，POD活性降低.CAT活性隨時間的推移先上升后下降，在處理7 d和15 d時隨錳濃度的增加而顯著上升，在處理30 d時則隨錳濃度的增加先上升后下降.這與石貴玉等[31]對鎘脅迫下紅樹(Rhizophoraapiculata)幼苗的研究結(jié)果一致.其原因可能是在低濃度錳脅迫下，植物體內(nèi)活性氧增加，細胞的防御反應(yīng)開始啟動，激活了CAT活性，從而減輕活性氧對植物造成的傷害.隨著脅迫時間的增加，高濃度錳所帶來的毒害超出了植物所能承受范圍，CAT適應(yīng)環(huán)境遭到破壞，導(dǎo)致其活性降低.

3.4 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量

植物受到脅迫時會產(chǎn)生并積累可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，它們能保持植物細胞正常的含水率與膨壓，從而對抗外界的不利條件；其含量越多表明植物的抗逆性越強[32].該研究中，大葉胡枝子幼苗葉片可溶性糖和可溶性蛋白含量在3個不同時間段都隨錳濃度的升高而增加，與Dong等[33]對錳脅迫下藍莓(Vacciniumuliginosum)和Huang等[34]對錳脅迫下構(gòu)樹(Broussonetiapapyrifera)的研究結(jié)果一致，說明植物在面對逆境時能夠通過提高體內(nèi)的可溶性糖和可溶性蛋白含量來緩解逆境所帶來的毒害.其原因可能是可溶性糖是合成有機溶質(zhì)的碳架和能量來源，而可溶性蛋白具較強的親水性，可提高細胞保水性能，使植物對錳的耐受能力增強.

研究中，游離脯氨酸含量在3個時間段都隨錳濃度的升高呈現(xiàn)增加的趨勢，在處理30 d時15 000 μmol·L-1錳處理組相對于前2個時間段游離脯氨酸含量減少.這與鮮靖蘋[35]對鹽及重金屬脅迫下龜背竹(Monsteradeliciosa)的研究結(jié)果一致，說明大葉胡枝子幼苗能通過增加游離脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量來減輕逆境所產(chǎn)生的毒害作用.其原因可能是錳能加快植物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的生產(chǎn)，使植物幼苗能正常生長.隨著脅迫時間的推移，錳破壞了植物體內(nèi)的平衡機制，植物受毒害程度增大，游離脯氨酸含量則會相應(yīng)地減少.

3.5 MDA含量

MDA是植物細胞膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，在植物受毒害情況下，植物體中活性氧的產(chǎn)生與清除的平衡會被破壞，自由基會大量積累從而造成細胞膜脂過氧化，MDA含量也會隨著增加，因而其含量的高低多少代表著植物受毒害強弱以及對脅迫的耐受能力.筆者的研究結(jié)果顯示，大葉胡枝子幼苗葉片中MDA含量隨錳脅迫時間的推移而逐漸升高，隨錳濃度的升高而增加.這與李欣航等[36]對錳脅迫下雞眼草(Kummerowiastriata)和查應(yīng)琴等[37]對鎘脅迫下雞冠花(Celosiacristata)的研究結(jié)果一致，說明在錳含量較高的情況下，隨著脅迫時間的推移，植物幼苗葉片的MDA含量會隨之增加.其原因可能是錳含量過高，導(dǎo)致大葉胡枝子幼苗葉片細胞膜脂過氧化，使細胞受到了破壞，從而加大了植物受毒害的程度.

4 結(jié)束語

錳脅迫對大葉胡枝子種子發(fā)芽率無明顯影響，其幼苗生物量則均表現(xiàn)出“低促高抑”現(xiàn)象，且根受到的抑制作用比芽大.隨著錳濃度的增加，大葉胡枝子葉片葉綠素a和葉綠素b含量降低；SOD活性隨錳濃度的增加和脅迫時間的延長而逐漸升高，POD活性在處理15d和30 d時隨錳濃度的增加而逐漸降低，CAT活性在處理7 d和15 d時隨錳濃度的增加而升高，處理30 d時則是先上升后下降.可溶性糖和可溶性蛋白含量隨錳濃度的升高和脅迫時間的延長而增加，游離脯氨酸含量隨錳脅迫時間先升高后降低，隨錳濃度的升高而增加.MDA含量隨錳脅迫強度增加、時間延長而逐漸升高.大葉胡枝子能在錳含量較高的環(huán)境萌發(fā)生長，它主要通過調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和抗氧化酶活性來減輕外界脅迫所帶來的毒害，其耐錳能力較強，可作為礦區(qū)污染修復(fù)的候選植物.