王娟，王廷華，白雪

1 西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 四川瀘州 646000 2 四川大學(xué)華西醫(yī)院 四川成都 610041

腦卒中是世界上最普遍的血管疾病，具有較高的發(fā)病率、致殘率、病死率，給社會(huì)、政府及家庭帶來(lái)了巨大的負(fù)擔(dān)。腦卒中分為出血性腦卒中和缺血性腦卒中，前者是由大腦內(nèi)部血管破裂引起的，缺血性中風(fēng)是由血管堵塞引起的，這兩種情況都會(huì)導(dǎo)致大腦局部組織缺氧。雖然這兩種中風(fēng)都很嚴(yán)重，很普遍，但研究表明，缺血性中風(fēng)更常見(jiàn)，占中風(fēng)總數(shù)的87%[1]。血腦屏障（blood brain barrier，BBB）是大腦和外周循環(huán)之間的重要屏障，通過(guò)嚴(yán)密調(diào)節(jié)物質(zhì)交換在維持中樞系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）可引起B(yǎng)BB損傷及破壞，進(jìn)一步促進(jìn)缺血性腦損傷的發(fā)展[2-3]。研究表明，缺血性腦卒中患者血腦屏障的破壞可能與TJ蛋白破壞、MMPs、AQP-4 基因和蛋白、VEGF的表達(dá)上調(diào)、免疫炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活，大量炎性細(xì)胞因子和趨化因子釋放，破壞血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞，導(dǎo)致血腦屏障的損傷[4]。

缺血性腦卒中屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，總結(jié)中風(fēng)發(fā)病機(jī)理，不外乎氣機(jī)逆亂、腦脈痹阻、絡(luò)破血溢、損脈及腦[5]。金代醫(yī)家劉完素提出“腦之玄府理論”，劉完素認(rèn)為五官、四肢百骸、意識(shí)等功能的正常皆依賴于玄府開通、氣機(jī)升降出入的通利，若玄府密閉則會(huì)導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生，腦之玄府閉塞是缺血性中風(fēng)的發(fā)病關(guān)鍵，故治療中風(fēng)注重宣通玄府[6]。現(xiàn)代研究表明玄府理論與血腦屏障 （bIood brain barrier，BBB）在結(jié)構(gòu)和功能方面存在著許多共性內(nèi)涵。三化湯主要由大黃、厚樸、羌活、枳實(shí)四味藥物組成，是開通玄府治療中風(fēng)病之名方，具有宣行氣血、通腑開結(jié)、調(diào)暢氣機(jī)、開通玄府的作用[7]。本文主要通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的知識(shí)，探究三化湯開通玄府法調(diào)節(jié)血腦屏障治療缺血性腦卒中的作用機(jī)制。

材料與方法

1 三化湯活性成分和成分靶點(diǎn)的收集、轉(zhuǎn)換

在傳統(tǒng)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology：TCMSP）（https：//tcmspw.com/index.php）以“大黃、厚樸、羌活、枳實(shí)”成分為關(guān)鍵詞搜索各成分的所有化學(xué)成分，以吸收、分布、代謝、排泄（ADME）參數(shù)中的OB≥30%、DL≥0.18、BBB≥0.3及BBB＜0.3為篩選條件，得到三化湯主要作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及外周的化學(xué)活性成分。并應(yīng)用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)檢索三化湯各單味藥化學(xué)成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)并加以整合、去重、取并集后，即為各成分靶點(diǎn)庫(kù)。

2 成分靶點(diǎn)蛋白轉(zhuǎn)化為基因名稱

在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/）將搜詢得到的靶點(diǎn)蛋白名稱按順序逐一鍵入搜索框中搜索得到其對(duì)應(yīng)基因名稱（Gene names）。

3 缺血性腦卒中靶點(diǎn)獲取

應(yīng)用GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org）與 DisGeNET（https：//www.disgenet.org/），在 搜索框中輸入關(guān)鍵詞：“ischemic stroke、 Cerebral arterial thrombosis、 Cerebral arterial thrombosis、 stroke 、cerebral infarction ”進(jìn)行搜索，挖掘缺血性腦卒中相關(guān)靶點(diǎn)。

4 “活性成分·潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

按照BBB≥0.3及BBB＜0.3將篩選出的三化湯化學(xué)活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)應(yīng)用Venny2.1數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），得出交集靶點(diǎn)。

5 關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將共同潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入 STRING11.0 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）構(gòu)建 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（設(shè)置條件：蛋白質(zhì)種類 “homo sapiens（人類）”，作用閾值 “medium confidence（0.400）”）。通過(guò)Cytoscape（Version 3.7.1）軟件，進(jìn)行可視化網(wǎng)絡(luò)處理，得到三化湯活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。以同樣的方法得到缺血性腦卒中的疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。應(yīng)用Cytoscape（Version 3.7.1）軟件中的merge設(shè)置，將三化湯治療缺血性腦卒中疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)可視圖像，對(duì)這些重要靶點(diǎn)進(jìn)行分析。

6 GO分析和KEGG通路分析

通過(guò) Metascape（http：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)靶點(diǎn)生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）進(jìn)行GO富集分析和KEGG代謝通路富集分析，并采用線上繪圖工具Omic Share Tool（https：//www.omicshare.com/tools/index.php/）將富集結(jié)果可視化。

7 分子對(duì)接驗(yàn)證

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得三化湯中活性成分的PubChem號(hào)，輸入PubChem在線數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索出各活性成分小分子配體3D結(jié)構(gòu)，并使用Openbable軟件將格式轉(zhuǎn)化為Mol2格式，導(dǎo)入AutoDock tools（1.5.6）進(jìn)行加氫離子，計(jì)算電荷數(shù)目，合并非極性氫后保存為pdbqt格式；在PDB在線數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)（https：//www1.rcsb.org/）中搜索出藥物核心靶點(diǎn)蛋白受體，通過(guò)Pymol軟件去除蛋白受體結(jié)構(gòu)的溶劑和水分子，將其導(dǎo)入Auto Dock Tools 1.5.6軟件進(jìn)行同樣的處理，根據(jù)每個(gè)受體蛋白結(jié)構(gòu)的不同，定義不同的Grid Box盒子；運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)，對(duì)其活性成分的受體與配體進(jìn)行匹配，分析其結(jié)合能力，選取每個(gè)藥物配體結(jié)合能最低的結(jié)合能，保存文件，將其導(dǎo)入Pymol軟件進(jìn)行對(duì)接結(jié)構(gòu)可視化。

結(jié)果

1 三化湯成分的篩選及其成分靶點(diǎn)

OB≥30%、DL≥0.18、BBB≥0.3的藥物成分共12種（見(jiàn)表1），其中大黃3種，厚樸1種，羌活8種，枳實(shí)2種；其對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)共131個(gè)，其中大黃43個(gè)，厚樸26個(gè)，羌活46個(gè)，枳實(shí)17個(gè)，通過(guò)Unipot數(shù)據(jù)庫(kù)和perl軟件對(duì)蛋白名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)注釋化并刪除重復(fù)靶點(diǎn)，篩選得到的靶點(diǎn)共59個(gè)。

表1 三化湯主要的潛在活性成分（BBB≥0.3）

OB≥30%、DL≥0.18、BBB＜0.3的化學(xué)成分30種（見(jiàn)表2），其中大黃7種，厚樸1種，羌活5種，枳實(shí)17種；其對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)共185個(gè)，其中大黃41個(gè)，厚樸7個(gè)，羌活17個(gè)，枳實(shí)120個(gè)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)后最終得到134個(gè)靶點(diǎn)。其中大黃的Mutatochrome（β胡蘿卜素氧化物）、Sennoside E（番瀉苷E）、Sennoside D（番瀉苷D），羌活的coumarin，glycoside（香豆素糖苷），枳實(shí)的Obacunone（黃柏酮）無(wú)法在SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)查詢到對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，這些成分查閱文獻(xiàn)單獨(dú)分析：β胡蘿卜素是一種重要的天然色素，對(duì)人體健康十分有益。它廣泛存在于蔬菜和水果中。三種主要功能是抗氧化作用、細(xì)胞間隙連接相關(guān)功能和免疫相關(guān)功能。由于它的多種功能，β -胡蘿卜素被認(rèn)為可以預(yù)防和治療許多慢性病。胃癌是其可治療的重要疾病之一[8]。番瀉苷（sennoside）包括番瀉苷 A、B、C、D、E、F、G 等，具有瀉下、抗菌活性、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等功能，對(duì)大黃進(jìn)行炮制的過(guò)程中無(wú)論是清蒸、酒蒸還是酒炙，番瀉苷含量均有所下降，番瀉苷D、E含量更少，且研究甚少[9]。香豆素糖苷是合成香料、醫(yī)藥、染料及 農(nóng)藥的重要中間體，香豆素還具有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)，光敏，抗菌、抗病毒，松弛平滑肌，抗血凝等生物活性[10]。黃柏酮具有多種藥理作用，其中對(duì)腫瘤的治療作用倍受關(guān)注，研究表明，黃柏酮在乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等多種癌癥中具有抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，但它對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移的影響仍不清楚[11]。

表2 三化湯主要的潛在活性成分（BBB＜0.3）

利用 Cytoscape3.7.2繪 制“藥 物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖（圖1），其中BBB≥0.3共有75 個(gè)節(jié)點(diǎn)、154 條邊（圖左），根據(jù)Degree值及靶點(diǎn)數(shù)前三的化合 物 分 別 是beta-sitosterol（degree=40）、Eucalyptol（degree=27）、及Ammidin（degree=18）。BBB＜0.3共有167 個(gè)節(jié)點(diǎn)、409 條邊（圖右），根據(jù)Degree值及靶點(diǎn)數(shù)前三的化合物分別是luteolin（degree=58）、naringenin（degree=38）、及nobiletin（degree=37）。（節(jié)點(diǎn)代表作用靶點(diǎn)；邊表示靶點(diǎn)之間的聯(lián)系強(qiáng)度）。

圖1 藥物-活性成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（BBB≥0.3（圖左）、BBB＜0.3（圖右））

2 三化湯與缺血性腦卒中共同潛在靶點(diǎn)的篩選

疾病與藥物交集靶點(diǎn)（圖2）。結(jié)果顯示，“三化湯-缺血性腦卒中”共同靶點(diǎn)有72個(gè)，其中易透過(guò)血腦屏障與缺血性腦卒中共26個(gè)，不易透過(guò)血腦屏障與缺血性腦卒中共同潛在靶點(diǎn)63個(gè)。

圖2 疾病與藥物交集靶點(diǎn)

3 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選核心靶點(diǎn)

將三化湯與缺血性腦卒中共同潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得靶蛋白之間的相互作用關(guān)系，再將靶蛋白相互作用信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中（圖3）。

圖3 蛋白互作圖：BBB≥0.3（圖左）、BBB＜0.3（圖右）

利用“Analyze Network”功能對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯?jì)算出各節(jié)點(diǎn)的度值degree；當(dāng)BBB≥0.3，共有26個(gè)節(jié)點(diǎn)，64條邊，平均自由度為4.92，篩選出符合degree≥4.92共有13個(gè)，即為三化湯易透過(guò)血腦屏障成份治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵靶點(diǎn)（見(jiàn)表3），將前3個(gè)靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)，即CASP3、PTGS2和JUN。BBB＜0.3，共有63個(gè)節(jié)點(diǎn)，823條邊，degree的中位數(shù)為26.12，篩選出符合degree≥26.12共有33個(gè)，即為三化湯不易透過(guò)血腦屏障成份治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵靶點(diǎn)（見(jiàn)表4），按照度值對(duì)關(guān)鍵靶蛋白進(jìn)行排序，將前3個(gè)靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)，即TNF、IL6和VEGFA。

表3 三化湯治療缺血性腦卒中關(guān)鍵靶點(diǎn)（BBB≥0.3）

表4 三化湯治療缺血性腦卒中關(guān)鍵靶點(diǎn)（BBB＜0.3）

4 GO富集分析及KEGG富集分析

為了闡明三化湯治療缺血性腦卒中的作用機(jī)制，我們對(duì)三化湯治療缺血性腦卒中關(guān)鍵靶基因進(jìn)行GO功能及KEGG通路富集分析。

結(jié)果表明，BBB≥0.3，在生物過(guò)程方面，主要涉及：細(xì)胞對(duì)有機(jī)環(huán)化合物的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)、血液循環(huán)、對(duì)異源生物刺激的反應(yīng)、血管發(fā)育、細(xì)胞分泌等；在細(xì)胞組分方面，主要涉及膜筏、突觸前膜、小窩、血液微粒、黏著斑等；在分子功能方面，主要涉及凋亡、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、肽酶活性、核受體活性、蛋白質(zhì)同二聚活性、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、血紅素結(jié)合、絲氨酸水解酶活性、磷酸酯水解酶活性等。以q值為篩選依據(jù)，繪制 GO Biological process（BP） 、GO Cellular component（CC） 及 GO Mo-lecular function（MF） 氣泡圖（見(jiàn)圖 6）。

圖4 BBB≥0.3 BP 、 CC、MF氣泡圖

圖5 BBB＜0.3 BP、CC、MF氣泡圖

圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖

BBB＜0.3時(shí)，在生物過(guò)程方面，主要涉及：對(duì)脂多糖的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、凋亡信號(hào)通路、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、肌肉細(xì)胞增殖、對(duì)多肽的反應(yīng)等；在細(xì)胞組分方面，主要涉及膜筏、細(xì)胞外基質(zhì)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、谷氨酸能突觸等；在分子功能方面主要涉及：細(xì)胞因子受體結(jié)合、RNA聚合酶II特異性dna結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、MAP激酶活性、血紅素結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、多肽結(jié)合、內(nèi)肽酶活力等。以q值為篩選依據(jù)，繪制 GO Biological process（BP） 、GO Cellular component（CC） 及 GO Mo-lecular function（MF） 氣泡圖（見(jiàn)圖7）。

圖7 KEGG通路富集分析氣泡圖

BBB≥0.3，KEGG通路分析主要涉及：與鈣離子相關(guān)通路、cAMP信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、膽堿能突觸通路、5-羥色胺通路等；以q值為篩選依據(jù)，繪制KEGG氣泡圖（見(jiàn)圖8）。

BBB＜0.3時(shí)，KEGG通路分析主要涉及：IL-17 信號(hào)通路、動(dòng)脈粥樣硬化、PI3K-Akt信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、炎癥介質(zhì)對(duì)TRP通道的調(diào)節(jié)；以q值為篩選依據(jù)，繪制KEGG氣泡圖（見(jiàn)圖9）。

5 分子對(duì)接結(jié)果

一般認(rèn)為，當(dāng)結(jié)合能＜0kcal·mol-1時(shí)，認(rèn)為分子蛋白質(zhì)自發(fā)結(jié)合并相互作用，而且結(jié)合能越低，分子構(gòu)象越穩(wěn)定。若結(jié)合力＜-5.0 kcal·mol-1，表明兩者具有較好的結(jié)合性，結(jié)合力結(jié)果見(jiàn)表5。

BBB≥0.3，經(jīng)篩選，靶點(diǎn)數(shù)前三的主要活性成分是：植物固醇（beta-sitosterol）、歐前胡素（Ammidin）、 桉樹腦（Eucalyptol），degree 值前三的靶點(diǎn)是CASP3、PTGS2和JUN，從上述化合物與交集靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果（見(jiàn)表5）中不難發(fā)現(xiàn)，植物固醇與PTGS2（PDB ID：5F19）、歐前胡素與CASP3（PDB ID：1NME）、桉樹腦與 PTGS2（5F19）均具有良好的結(jié)合活性。植物固醇可與活性位點(diǎn)附近的 ASN-537、VAL-228、GLY-533 三種氨基酸形成氫鍵結(jié)合到PTGS2、 歐前胡素可與 MET-44、GLY-45、GLU-84 三種氨基酸形成氫鍵結(jié)合到 CASP3、桉樹腦可與 ARG-44、HIS-39L兩種氨基酸形成氫鍵結(jié)合到PTGS2上（見(jiàn)圖 10）。

BBB＜0.3，靶點(diǎn)數(shù)前三的主要活性成分是：木犀草素（Luteolin）、柚皮素（naringenin）、川陳皮素（nobiletin），degree 值前三的靶點(diǎn)是TNF、IL6和VEGFA，從上述化合物與交集靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果（見(jiàn)表5）中不難發(fā)現(xiàn)，木犀草素與IL6（PDB ID：1ALU）、柚皮素與TNF（PDB ID：2AZ5）、川陳皮素與VEGFA（1MKK）均具有良好的結(jié)合活性。木犀草素可與活性位點(diǎn)附近 的 LYS-86、LYS-66、GLU-93、LEU-62、ASN-61四種氨基酸形成氫鍵結(jié)合到IL6、柚皮素可與 GLN-125、ASN-92兩種氨基酸形成氫鍵結(jié)合到TNF、川陳皮素可與 CYS-102、CYS-104兩種氨基酸形成氫鍵結(jié)合到VEGFA上（見(jiàn)圖11）。

討論

目前，缺血性腦卒中的發(fā)生主要是由各種原因引起的腦組織血流供應(yīng)驟減，腦組織缺血、缺氧、壞死，引起的一系列神經(jīng)功能障礙、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡或壞死，腦血管結(jié)構(gòu)改變，血腦屏障功能破壞[12-13]。涉及機(jī)制主要有：興奮性氨基酸損傷學(xué)說(shuō)、炎癥反應(yīng)學(xué)說(shuō)、氧自由基學(xué)說(shuō)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡學(xué)說(shuō)、血流動(dòng)力學(xué)改變學(xué)說(shuō)[14]。血腦屏障的損傷是腦缺血再灌注損傷的病理生理基礎(chǔ)，缺血性腦中風(fēng)發(fā)病后，血腦屏障（bloodbrain barrier，BBB）的完整性受到破壞，通透性改變；研究表明，急性低壓低氧可導(dǎo)致大鼠腦組織細(xì)胞空泡化增多、水腫明顯，膠質(zhì)細(xì)胞增生顯著，影響了AQP4、Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)，增加低壓低氧下血腦屏障的通透性[15]。故保護(hù)血腦屏障完整性是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮生理功能的重要保證。

《素問(wèn)·水熱穴論》曰：“所謂玄府者，汗孔也”。劉完素認(rèn)為：“玄府：無(wú)物不有，乃氣升降出入運(yùn)行之道路門戶也，廣泛存在于機(jī)體五官九竅、臟腑內(nèi)外的微觀、玄妙孔竅，與經(jīng)絡(luò)、腠理、三焦、臟腑等共同構(gòu)成運(yùn)行機(jī)體精、氣、血、津、液等的循環(huán)通道，強(qiáng)調(diào)了玄府的“廣泛性、微觀性、開闔性和通利性”，它與血腦屏障在結(jié)構(gòu)和生理上具有高度相似之處[16]。血腦屏障與玄府皆為人體結(jié)構(gòu)層次及功能系統(tǒng)中最為細(xì)小的單位，肉眼不可見(jiàn)，分布廣泛。血腦屏障人體血液與腦組織液進(jìn)行物質(zhì)交換的重要保護(hù)屏障系統(tǒng)，是各種離子通道及水通道蛋白的整合體，調(diào)控氣血周流，與玄府流通氣液、滲灌氣血的作用相似。在病理狀態(tài)下，玄府閉塞，氣血、津液出入門戶不通，氣機(jī)阻滯，風(fēng)、火、痰濁、淤血、濕邪等邪實(shí)阻滯與腦，神機(jī)實(shí)用，則產(chǎn)生意識(shí)功能障礙；腦血管疾病下?lián)p害血腦屏障，物質(zhì)交換屏障功能受損，有害物質(zhì)進(jìn)入大腦，引起腦水腫或腦腫脹。研究表明，開通玄府法可改善大鼠卒中后腦水腫及改善神經(jīng)功能，調(diào)節(jié)缺血再灌注損傷時(shí)AQP4 mRNA的異常表達(dá)[17]。

“玄府閉塞”是中風(fēng)病關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制，中風(fēng)病病位在腦，高巔之上，唯風(fēng)可到，三化湯方用羌活以化風(fēng)，厚樸、大黃以化滯，枳實(shí)以化痰，故曰三化，活用小承氣通腑瀉熱，巧用羌活解風(fēng)邪阻絡(luò)之標(biāo)，使內(nèi)外相合，升降并濟(jì)，以解中風(fēng)病玄府閉塞之要[18-20]。

利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出歐前胡素、木犀草素、柚皮素、川陳皮素等 42 個(gè)主要活性成分，可通過(guò)抗炎、抗細(xì)胞凋亡、保護(hù)血管內(nèi)皮等作用抑制 IS 的發(fā)生發(fā)展。CASP3、PTGS2、JUN、TNF、IL6和VEGFA作為核心靶點(diǎn)。Caspase-3是神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵介質(zhì)[21]，缺血性腦卒中可激活caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡[22]，研究表明，急性缺血性腦卒中患者血清caspase-3的表達(dá)水平顯著增高，神經(jīng)功能發(fā)生障礙[23]。受多種炎性細(xì)胞調(diào)節(jié)而高度表達(dá)，可抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB通路，進(jìn)一步抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移[24-25]。JNK是絲裂原活化蛋白激酶（mitogenac tivated-proteinkinase，MAPK）家族成員，參與了細(xì)胞生長(zhǎng)、增值、凋亡等過(guò)程，腦損傷前期，大腦釋放IL6、TNF等炎性因子，JNK的激活與炎癥因子密切相光，從而引發(fā)下游蛋白c-JNK磷酸化，促進(jìn)凋亡，同時(shí)可啟動(dòng)Caspase-3，進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡；研究表明Jun還可以促進(jìn)了大鼠CNS神經(jīng)元和小鼠DRG神經(jīng)元的突起生長(zhǎng)[26-27]。IL6、TNF是一種促炎因子，研究表明，急性缺血性腦卒中患者的IL6、TNF的表達(dá)顯著增高，介導(dǎo)白細(xì)胞浸潤(rùn)為主的急性炎性反應(yīng)，與內(nèi)皮細(xì)胞損害、血腦屏障通透性改變、動(dòng)脈粥樣硬化、血管閉塞等多種損害有關(guān)[28-29]。VEGFA作為一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖、遷移以及促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)變性、增加血管通透性，還具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)、抗凋亡等作用。研究表明，VEGFA表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（BMECs）的存活和血管生成[30-32]。

CAMP相關(guān)信號(hào)通路廣泛參與神經(jīng)元的存活、生長(zhǎng)及神經(jīng)元突觸相關(guān)物質(zhì)的合成、傳遞等環(huán)節(jié)，能抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)海馬神經(jīng)元再生。研究表明，血管性癡呆大鼠模型中，海馬cAMP含量、PKA、pCREB蛋白顯著下調(diào)，給予藥物干預(yù)后均可提高cAMP含 量[33-36]。缺血性腦卒中的發(fā)生引起興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的過(guò)度釋放，使突觸后膜處于持續(xù)性去極化狀態(tài)，造成大量Ca2+內(nèi)流，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的生化反應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子紊亂，線粒體內(nèi)Ca2+超載時(shí)，線粒體腫脹、結(jié)構(gòu)裂解，同時(shí)激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡[37-38]。在腦缺血缺氧性疾病中VEGF可通過(guò)調(diào)節(jié) CBF、促進(jìn)血管新生、建立側(cè)支循環(huán)，發(fā)揮改善腦灌注的積極效應(yīng)；但同時(shí)另一方面病理性升高的 VEGF 水平會(huì)增強(qiáng)血管通透性和滲漏，并破壞血腦屏障的完整性，促進(jìn)血腦屏障泄露；VEGF 促進(jìn)血管新生的同時(shí)，其介導(dǎo)的血腦屏障損傷機(jī)制，可能是其直接活化 Src，或通過(guò) AKT/eNOS 生成 NO 依賴性介導(dǎo)的亞硝基化，兩種途徑均激活了 caveolin-1，抑制了 eNOS 活性，在 VEGF/eNOS 途徑中形成eNOS/NO/Src/caveolin-1 的負(fù)反饋[39-42]。

白介素-17 是一種促炎細(xì)胞因子，研究表明，它可以促進(jìn)細(xì)胞增值，分化、凋亡，調(diào)控PI3K/AKT/FAS/FASL信號(hào)通路抑制Hep-2細(xì)胞凋亡，能調(diào)控JAK/STAT3信號(hào)通路，在喉癌的血管生成中起到重 要[43-44]。IL-17在腦病理狀態(tài)下，表達(dá)含量明細(xì)增高，研究表明，會(huì)激活NF-κB、JAKs/STATs等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，介導(dǎo)一系列炎癥反應(yīng)，使血腦屏障通透性增高[45]。PI3K和AKT具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抗凋亡的作用[46]，PI3K-Akt信號(hào)通路可以介導(dǎo)的PPAR γ表達(dá)雙向調(diào)節(jié)3T3 - L1細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，同時(shí)AKT可特異性磷酸化內(nèi)皮一氧化氮氧合酶（endothial nitric oxide synapse，eNOS，介導(dǎo)血管新生與內(nèi)皮細(xì)胞功 能[47-48]?；罨腁kt可通過(guò)磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白，促使核因子NF-κB發(fā)生核轉(zhuǎn)位，NF-κB可調(diào)控多種炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α等炎癥因子，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[49]?；钚匝酰≧OS ）參與了腦卒中的發(fā)病，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs ）是ROS起作用的重要靶點(diǎn)，激活PPAR δ清除ROS發(fā)揮抗氧化作用，保護(hù)神經(jīng)功能[50]。從分子對(duì)接的結(jié)果來(lái)看，除歐前胡素與JUN的結(jié)合效果稍差外，其余各成分與核心靶點(diǎn)都具有良好的結(jié)合活性。

本研究通過(guò)利用數(shù)據(jù)挖掘、生信分析等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)三化湯可通過(guò) CASP3、PTGS2、JUN、TNF、IL6和VEGFA 等靶點(diǎn)作用于 與鈣離子相關(guān)通路、cAMP信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、膽堿能突觸通路、5-羥色胺通路、IL-17 信號(hào)通路、動(dòng)脈粥樣硬化、PI3K-Akt信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路等 等多條信號(hào)通路，在改善血腦屏障通透性、抗炎、抗氧化、促進(jìn)血管生成、抑制細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)功能的作用，具有多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。但研究也存在不足，如可能遺漏部分生物利用度差但發(fā)揮良好作用的活性成分、對(duì)接成分偏少等，后期仍需進(jìn)一步開展細(xì)胞、動(dòng)物等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。