鄭煬凡, 陳藝煊，陳 娟，趙嘉雯，余慧琳，趙 燕，李泓浩，朱加進(jìn)

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院 杭州 310058）

南極大磷蝦（Euphausia superba）是南大洋生物圈里一種非常關(guān)鍵的物種[1-2]，目前是世界上生物資源量最大的單種生物之一[3]，其蛋白質(zhì)含量高（16.31%），脂肪含量低（1.3%）且礦物質(zhì)含量豐富，因此可以利用其開發(fā)活性蛋白肽、磷蝦油、蝦青素和甲殼素等高附加值海洋系列產(chǎn)品。其中，磷蝦油因脂質(zhì)組成比較特殊，以及諸多的功能而受到較高的關(guān)注[4]。磷蝦油中含有磷脂以及脂肪酸這些脂類[5-6]【尤其富含二十碳五烯酸（C20 ∶5，EPA）和二十二碳六烯酸（C22∶6，DHA）這2 種n-3 多不飽和脂肪酸[7-9]】、蝦青素、維生素、類黃酮和礦物質(zhì)等。Miki 等[10]的研究表明，在抗氧化性能方面，蝦青素的效果是β-胡蘿卜素的10 倍，與α-生育酚對比更明顯，高達(dá)100 倍。此外，磷蝦油對改善非酒精性脂肪肝、心血管疾病[11]、三高[12-13]、結(jié)腸癌[14-16]、經(jīng)前綜合癥[17]、代謝綜合征、炎癥[18-22]，提高學(xué)習(xí)及記憶能力，注意缺陷多動障礙和保護(hù)眼睛[23-24]等都有積極作用。然而，在水中的難溶性限制了磷蝦油在食品中的應(yīng)用，目前往往以膠囊的形式在市場上銷售[25]。而DHA、EPA 和蝦青素的高不飽和特性使它們在外界一些條件下易于發(fā)生降解，產(chǎn)生不好的感官影響，尤其是磷蝦油中的蝦青素，具有水溶性差、熔點高、化學(xué)不穩(wěn)定性和低生物利用率的特點，因此強(qiáng)化其利用率具有重大意義。

殼聚糖（CS 或CHI）是一種高分子多糖，具有生物相容性、生物降解性、pH 敏感性、粘膜黏附性等有利特性，經(jīng)常被用作一些藥物的載體，以達(dá)到控制其釋放，增強(qiáng)療效和減少不良反應(yīng)等作用。在生物醫(yī)學(xué)和化學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用非常廣泛[25]。與其它聚合物相比，殼聚糖分子的修飾因功能性氨基和羥基的豐富而相對容易實現(xiàn)。Ryu 等[26]制備了殼聚糖-鄰苯二酚和其它相關(guān)的兒茶酚聚合物作為一種有前途的生物醫(yī)學(xué)用黏合劑聚合物，其在pH=7 的水溶液中的溶解度從0 mg/mL 顯著提高至近60 mg/mL。Mazloomi 等[27]在探究殼聚糖包被的橙種子蛋白水解物納米脂質(zhì)體的物理、化學(xué)性質(zhì)時，發(fā)現(xiàn)用殼聚糖包被可以增加脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，降低肽的釋放速率，此外，包衣脂質(zhì)體還有保護(hù)、控制釋放和維持肽的抗氧化活性方面的功效。甚至還有研究果膠和殼聚糖共同偶聯(lián)體，對新橙皮苷納米脂質(zhì)體在遞送釋放過程中的作用，其緩釋效果優(yōu)于殼聚糖單獨偶聯(lián)[28]。顯然，基于殼聚糖的結(jié)合物已成為一類新的生物材料，在多學(xué)科領(lǐng)域的各種應(yīng)用中具有廣闊前景。

丙烯酰胺（Acrylamide，AA）是一種水溶性的有毒物質(zhì)，被證明是動物物種中的神經(jīng)和生殖毒物及致癌物。Lindeman 等[29]的研究表明AA 是一種已知的人類神經(jīng)毒劑，可以通過胎盤轉(zhuǎn)移和母乳到達(dá)發(fā)育中的胎兒。雖然在嚙齒類動物出生前，暴露于AA 后已觀察到不利的神經(jīng)發(fā)育作用，但迄今為止尚未在人體中研究AA 對發(fā)育中的大腦的不利作用。斑馬魚作為一種脊椎動物模式生物在近20年被廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)、毒理學(xué)以及人類疾病模型構(gòu)建等研究領(lǐng)域。其胚胎發(fā)育周期短、體積小、通體透明并易于觀察等都是作為動物模型的優(yōu)勢。

本文首先對殼聚糖-磷蝦油納米脂質(zhì)體的工藝條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，針對優(yōu)化后的產(chǎn)物，通過建立丙烯酰胺誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎氧化應(yīng)激模型，觀察脂質(zhì)體對斑馬魚胚胎生長發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物 雌雄斑馬魚，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共平臺。

1.1.2 試劑 磷蝦油 （約含磷脂52.64%、DHA 14.8%、EPA 22.5%、250 mg/kg 蝦青素，其中30%～65%的脂肪酸是磷脂結(jié)合型，蝦青素構(gòu)成：20%游離蝦青素、34%蝦青素單酯、46%蝦青素雙酯），山東科芮爾生物技術(shù)公司；卵磷脂 （來自大豆，＞90%），上海麥克林生化科技有限公司；殼聚糖，北京華威銳科化工有限公司；膽固醇，上海達(dá)瑞精細(xì)化學(xué)品有限公司；無水乙醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；pH=7.4 的磷酸鹽緩沖液（由磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀配制而成），以上緩沖液配制試劑均來自阿拉丁生化科技有限公司；無水硫酸鈉、甲醇、甲苯、石油醚、異丙醇、硫酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；正己烷【純度≥99%，用于氣相色譜（GC）檢測】，上海麥克林生化科技有限公司；超濾離心管（30 ku），浙江同力信息科技有限公司；丙烯酰胺（AA），上海阿拉丁試劑公司；斑馬魚胚胎培養(yǎng)液 （0.05%海鹽和0.002%亞甲基藍(lán)）由純凈水、海鹽與亞甲基藍(lán)制備而成，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共平臺。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204 型電子天平 （0.1 mg），梅特勒-托利（Metter Toledo）公司；磁力攪拌器、超聲細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司；BECKMAN 冷凍離心機(jī)，美國貝克曼公司；Zetasizer Nano ZS90 納米粒度儀，英國Malven 公司；pH 計，瑞士mettlertoledo 托利多公司；7890A 型氣相色譜儀（附氫火焰離子化檢測器），美國Agilent 公司；Zetasizer Nano ZS90 納米粒度儀，英國Malven 公司。

1.3 脂質(zhì)體制備工藝

采用薄膜分散-超聲法制備磷蝦油納米脂質(zhì)體。稱取一定質(zhì)量的磷蝦油、卵磷脂、膽固醇加入燒杯中，加入40 mL 無水乙醇，用磁力攪拌器渦旋混勻15～30 min，直至混合均勻，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀55℃恒溫水浴中旋蒸至乙醇蒸發(fā)完畢，使燒瓶底部形成一層脂質(zhì)膜。用一定量pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液水合，渦旋混勻30 min，再留30 min 靜置，形成脂質(zhì)體。然后用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)在冰浴中超聲8 min （超聲功率為全超聲功率的70%～80%），形成納米脂質(zhì)體。

把1%的殼聚糖溶液稀釋成所需要的濃度后，將前面制備好的納米脂質(zhì)體以1∶6 的體積比滴加到稀釋好的殼聚糖溶液中，渦旋混勻，靜置30 min，使其充分結(jié)合，用1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至5.5，然后用超聲細(xì)胞粉碎機(jī)超聲2 min（60%超聲功率）。

1.4 響應(yīng)面優(yōu)化脂質(zhì)體制備工藝

運用Design Expert 設(shè)計BBD 試驗。取卵磷脂與膽固醇質(zhì)量之比（X1）、卵磷脂與磷蝦油質(zhì)量之比（X2）、殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X3）為3 個因素，以脂質(zhì)體粒徑和包封率為響應(yīng)值。通過前期的單因素實驗已經(jīng)確定了3 個因素比較適宜的比例分別為卵磷脂∶膽固醇=4∶1，卵磷脂∶磷蝦油=20 ∶1，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)=0.1%，然后在單因素實驗的基礎(chǔ)上決定X1的3 個水平為3∶1，4∶1，5∶1，X2的3 個水平為18 ∶1，20 ∶1，22 ∶1，X3的3 個水平為0.1%，0.2%，0.3%，用（-1，0，1）編碼，對應(yīng)實際值如表1所示，BBD 試驗設(shè)計及結(jié)果如表2所示。對結(jié)果進(jìn)行方差分析后，再對數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，采用式（1）二次多項式描述響應(yīng)量同自變量關(guān)系的經(jīng)驗?zāi)Ｐ汀?/p>

表1 BBD 試驗設(shè)計因素水平及編碼Table 1 Factor levels and coding of BBD experimental

表2 BBD 試驗設(shè)計及其結(jié)果Table 2 Design and results of BBD experimental

式中，Y——預(yù)測響應(yīng)值；β0——常數(shù)項；βi——一次項系數(shù)；βii和βij——二次項系數(shù)。

1.5 丙烯酰胺誘導(dǎo)的斑馬魚氧化應(yīng)激模型建立

為了得到適宜斑馬魚胚胎生存的脂質(zhì)體樣品稀釋倍數(shù)，將殼聚糖-磷蝦油納米脂質(zhì)體共軛物溶液按照0 （不含樣品），1 ∶100，1 ∶125，1 ∶150，1 ∶200，1∶250，1∶300，1∶350，1∶400，1∶450（與胚胎水的體積比） 比例稀釋分組。當(dāng)胚胎孵育時間到達(dá)7～9 hpf 時，將其隨機(jī)分成10 組，每組60 個胚胎，轉(zhuǎn)移到96 孔板中，1 孔1 個胚胎并加入適量胚胎水（250 μL），從24 hpf 開始每隔1 d 記錄各組胚胎的存活率，來確定樣品的最佳稀釋倍數(shù)。把準(zhǔn)備好的斑馬魚胚胎分為對照組（只加胚胎培養(yǎng)液）、丙烯酰胺組以及低、中、高3 個稀釋倍數(shù)的脂質(zhì)體處理組共5 組，每組設(shè)定3 個平行，每個平行50枚胚胎。

每組前期先經(jīng)過一段時間暴露處理，其中空白對照組一直在胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)，AA 組和實驗組的胚胎在培養(yǎng)7～9 hpf 時，將培養(yǎng)液換成3 mmol/L 的丙烯酰胺溶液。干預(yù)1 h 后，丙烯酰胺組胚胎保持不變，實驗組3 組的培養(yǎng)液都換成同時有3 mmol/L 丙烯酰胺溶液相應(yīng)脂質(zhì)體稀釋倍數(shù)（0，1∶400，1∶350，1∶300） 的胚胎培養(yǎng)液中，直到24 hpf。將除對照組外4 組中的胚胎取出，漂洗2～3 次，然后把培養(yǎng)液換回胚胎水一直培養(yǎng)到72 hpf。

1.6 生長發(fā)育相關(guān)指標(biāo)測定

從24 h 開始陸續(xù)觀察自主運動、心率、畸形率、孵化率和第5 天體長等生長發(fā)育相關(guān)指標(biāo)。

1.6.1 自主運動 自24 h 開始，每組取24 枚胚胎，在體式顯微鏡下觀測各組胚胎在30 s 內(nèi)自主運動的次數(shù)，每24 h 觀察記錄1 次，觀察至72 h。

1.6.2 心率 自48 h 開始，每組取30 枚胚胎，在體式顯微鏡下觀測胚胎15 s 內(nèi)的心率 （心跳次數(shù)），然后在72 h 再觀察1 次。

1.6.3 致畸率 自24 h 開始，觀察和記錄每組斑馬魚胚胎畸形情況，每24 h 記錄1 次直到72 h，再對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.6.4 孵化率 自24 h 開始，觀察和記錄每組斑馬魚胚胎的孵化數(shù)量，每24 h 記錄1 次直到72 h，再對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.6.5 第5 天體長 斑馬魚孵化至第5 天時，用合適濃度的麻醉劑將斑馬魚胚胎麻醉后在體式顯微鏡下觀測體長并拍照，之后利用測量軟件記錄體長（mm）。不同濃度組和對照組還有丙烯酰胺組各測量18 條幼魚的體長作為平行，取平均值作為每組第5 天的體長。

1.7 統(tǒng)計分析

用SPSS 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.1.1 以粒徑為響應(yīng)值的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果 脂質(zhì)體粒徑系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果顯示，該模型非常顯著（P＜0.01）。失擬項（P=0.0722）不顯著，表明模型與試驗結(jié)果的擬合度比較好。相關(guān)系數(shù)R2=0.9913，說明試驗結(jié)果中99.13%的實際值與模型中的預(yù)測值對應(yīng)，關(guān)聯(lián)度很高，校正系數(shù)RAdj2=0.9758，表明有2.42%的變異是不能用該模型去解釋的。運用方差分析對模型方程的適用性進(jìn)行評估，結(jié)果證明該模型擬合較好，預(yù)測脂質(zhì)體粒徑是適合的。C.V.（變異系數(shù)）=4.52%，該值越低表明試驗的結(jié)果越可靠。

經(jīng)過該模型的方程回歸系數(shù)顯著性檢驗，卵磷脂磷蝦油比（X2）和殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X3）對脂質(zhì)體粒徑的線性效應(yīng)較顯著（P＜0.01），而卵磷脂膽固醇比（X1）對脂質(zhì)體粒徑的線性效應(yīng)不顯著；卵磷脂膽固醇比（X1）、卵磷脂磷蝦油比（X2）和殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X3）的二次項的P 值都小于0.05，其中殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X3）的二次項P 值小于0.01，說明對響應(yīng)值的曲面效應(yīng)較顯著。制備過程表明，粒徑與內(nèi)部配方比例相關(guān)聯(lián)，因此不同配比會在一定程度上影響粒徑的大小。磷脂膽固醇比、磷脂磷蝦油比和殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)能夠?qū)α酱笮≡斐芍苯佑绊憽ぞ厶琴|(zhì)量分?jǐn)?shù)（X3）的一次項回歸系數(shù)（43.05）在3 個因素的一次項回歸系數(shù)中最高，表明在試驗范圍內(nèi)，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X3）對響應(yīng)值的影響最大。

表3 殼聚糖-磷蝦油納米脂質(zhì)體共軛物粒徑響應(yīng)面二次系數(shù)顯著性分析Table 3 Response surface fitting quadratic coefficient significance test of the size of chitosan-krill oil nanoliposomes conjugate

表4 殼聚糖-磷蝦油納米脂質(zhì)體共軛物粒徑響應(yīng)面二次模型方差分析Table 4 Analysis of variance of quadratic model of response surface experiment for the size of chitosan-krill oil nanoliposomes conjugate

單因素之間的交互作用也會對試驗結(jié)果（脂質(zhì)體粒徑）產(chǎn)生影響，從結(jié)果可以看到X1X2、X1X3和X2X3都滿足P＜0.05，且X1X2和X1X3的P＜0.01，表明三者之間兩兩交互對殼聚糖-磷蝦油納米脂質(zhì)體共軛物粒徑都有顯著影響，且磷脂膽固醇比（PPL ∶CL）與磷脂磷蝦油比（PPL ∶KO）、磷脂膽固醇比（PPL ∶CL）與殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（CH%）的交互作用對脂質(zhì)體粒徑相對來說影響更加顯著。如圖1a，在一定范圍內(nèi)，當(dāng)PPL∶CL 和PPL∶KO 向最優(yōu)點增加時，脂質(zhì)體的粒徑明顯變小，而當(dāng)PPL ∶CL和PPL∶KO 通過最優(yōu)點后繼續(xù)增加，脂質(zhì)體粒徑則明顯變大，因素X1X3和X2X3的交互關(guān)系對粒徑的影響同X1X2。

圖1 交互作用對脂質(zhì)體粒徑影響的三維曲面圖Fig.1 3D surface plots and contour plots of interaction effect on the size of chitosan-krill oil nanoliposomes conjugate

2.1.2 以包封率為響應(yīng)值的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果 脂質(zhì)體包封率系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果顯示，該模型P＜0.01，說明非常顯著。失擬項不顯著（P=0.9096），表明模型與試驗結(jié)果的擬合度比較好。相關(guān)系數(shù)R2=0.9534，說明試驗結(jié)果中95.34%的實際值與模型中的預(yù)測值一致，關(guān)聯(lián)度很高，校正系數(shù)RAdj2=0.8694，表明13.06%的變異不能用該模型去解釋。運用方差分析對方程適用性進(jìn)行評估，結(jié)果證明該模型擬合較好，預(yù)測脂質(zhì)體包封率是適合的。C.V.（變異系數(shù)）=0.47%，該值越低表明試驗的結(jié)果越可靠性。

經(jīng)過該模型的方程回歸系數(shù)顯著性檢驗，卵磷脂膽固醇比（X1）、卵磷脂磷蝦油比（X2）和殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X3）對脂質(zhì)體包封率的線性效應(yīng)都不顯著；X12和X22皆P＜0.01，表明對響應(yīng)結(jié)果的曲面效應(yīng)很顯著，而殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X3）的二次項對響應(yīng)值的曲面效應(yīng)不顯著。制備過程表明，包封率是與內(nèi)部配方比例相關(guān)聯(lián)的，因此不同的配比也會在一定程度上影響包封率的高低。磷脂膽固醇比、磷脂磷蝦油比和殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)能夠?qū)Π饴实母叩驮斐芍苯佑绊?。殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X3）的一次項回歸系數(shù)（0.39）在3 個因素的一次項回歸系數(shù)中最高，表明在試驗范圍內(nèi)，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X3）對響應(yīng)值的影響最大。

表5 殼聚糖-磷蝦油納米脂質(zhì)體共軛物包封率響應(yīng)面二次系數(shù)顯著性分析Table 5 Response surface fitting quadratic coefficient significance test of the encapsulation efficiency of chitosan-krill oil nanoliposomes conjugate

單因素之間的交互作用也會對試驗結(jié)果（包封率）產(chǎn)生影響，X2X3的結(jié)果說明卵磷脂磷蝦油比和殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)兩兩交互對殼聚糖-磷蝦油納米脂質(zhì)體共軛物包封率有顯著影響 （P＜0.01），而交互項X1X2和X1X3對響應(yīng)值無顯著影響。如圖2a 所示，在試驗條件范圍內(nèi)，當(dāng)卵磷脂磷蝦油比和殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)向最優(yōu)點增加時，脂質(zhì)體包封率顯著升高，而當(dāng)卵磷脂磷蝦油比和殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)通過最優(yōu)點后繼續(xù)增加，脂質(zhì)體包封率則顯著降低。

圖2 交互作用對脂質(zhì)體包封率影響的三維曲面圖Fig.2 3D surface plots and contour plots of interaction effect on the encapsulation efficiency of chitosan-krill oil nanoliposomes conjugate

表6 殼聚糖-磷蝦油納米脂質(zhì)體共軛物包封率響應(yīng)面二次模型方差分析Table 6 Analysis of variance of quadratic model of response surface experiment for the encapsulation efficiency of chitosan-krill oil nanoliposomes conjugate

2.1.3 響應(yīng)面模型驗證 通過軟件分析，制備殼聚糖-磷蝦油納米脂質(zhì)體的最佳工藝條件為：卵磷脂∶膽固醇=5 ∶1，卵磷脂∶磷蝦油=19.6 ∶1，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)=0.146%，在此條件下粒徑為145 nm，包封率為98.1%。為了驗證優(yōu)化工藝參數(shù)的可靠性，結(jié)合實際操作的方便性，將工藝參數(shù)調(diào)整為卵磷脂∶膽固醇=5∶1，卵磷脂∶磷蝦油=20 ∶1，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%的條件下進(jìn)行3 次平行試驗，得到脂質(zhì)體粒徑為146.3 nm，包封率為97.2%，與該模型的理論值誤差小于2%，說明由響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳工藝條件具有高度的可靠性。

2.2 脂質(zhì)體濃度對斑馬魚胚胎存活率影響

在前文方法中設(shè)計了10 組殼聚糖-磷蝦油納米脂質(zhì)體共軛物濃度組，然而由于1∶100～1∶200間的濃度組120 h 后的存活率為0，因此未在表7中進(jìn)行統(tǒng)計分析。

表7 不同稀釋倍數(shù)殼聚糖-磷蝦油納米脂質(zhì)體共軛物處理后斑馬魚胚胎存活百分比（%）Table 7 The survival rate of zebrafish embryos at after fertilization in different dilution ratio of chitosan-krill oil nanoliposomes conjugate （%）

由表7可知，當(dāng)殼聚糖-磷蝦油納米脂質(zhì)體共軛物稀釋倍數(shù)在300～450 倍之間時，斑馬魚胚胎的存活率都比較高，而當(dāng)稀釋倍數(shù)為250 時，存活率與對照組相比顯著下降（P＜0.01）。因此，最終選擇稀釋400 倍、350 倍、300 倍的殼聚糖-磷蝦油納米脂質(zhì)體共軛物溶液進(jìn)行下一步試驗。

2.3 脂質(zhì)體濃度對斑馬魚胚胎氧化應(yīng)激模型生長發(fā)育的影響

2.3.1 斑馬魚胚胎自主運動 如圖3所示，在胚胎發(fā)育過程中，單獨暴露于3 mmol/L AA 組的斑馬魚胚胎自主運動明顯受到抑制，而經(jīng)過脂質(zhì)體處理組對AA 組造成的自主運動抑制都有一定程度的改善，且呈劑量依賴性。其中高濃度組有顯著的改善（24，48 h，P＜0.05，72 h，P＜0.01），斑馬魚胚胎從24 h 到72 h 的自主運動整體呈下降趨勢，這可能是因為斑馬魚胚胎在不斷孵化所致。

圖3 脂質(zhì)體對暴露在丙烯酰胺中斑馬魚胚胎自主運動情況的影響Fig.3 The effect of chitosan-krill oil nanoliposomes conjugate on autokinetic movement in zebrafish embryos exposed to AA

2.3.2 斑馬魚胚胎心率 如圖4所示，在胚胎發(fā)育的過程中，單獨暴露于3 mmol/L AA 組的斑馬魚胚胎心率明顯受到抑制，而經(jīng)過脂質(zhì)體處理組對AA 組造成的心率降低都有顯著的改善（P＜0.05或0.01 或0.001），且呈劑量依賴性。其中稀釋350倍組和稀釋300 倍組均有顯著的改善（48 h，P＜0.001，72 h，P＜0.01），然而整體還是稀釋300 倍的濃度組改善效果最好。

圖4 脂質(zhì)體對丙烯酰胺作用下斑馬魚胚胎心率的影響Fig.4 Effect of chitosan-krill oil nanoliposomes conjugate on heart rate in zebrafish embryos exposed to AA

2.3.3 斑馬魚胚胎畸形率 如圖5所示，在胚胎發(fā)育過程中，將對照組作為參照，AA 組的單獨作用對斑馬魚胚胎有顯著性致畸作用 （P＜0.01 或0.001），斑馬魚胚胎生長發(fā)育過程中產(chǎn)生的畸形體現(xiàn)在心包水腫、充血和脊柱彎曲，然而一般不致死。觀察記錄斑馬魚胚胎的畸形情況累積至72 h，可以看到經(jīng)過脂質(zhì)體處理組對AA 組造成的畸形有明顯的改善，且呈劑量依賴性。其中稀釋300 倍組在72 h 時有顯著的改善作用（P＜0.01）。

圖5 脂質(zhì)體對丙烯酰胺作用下斑馬魚胚胎畸形率的影響Fig.5 Effect of chitosan-krill oil nanoliposomes conjugate on malformation rate in zebrafish embryos exposed to AA

2.3.4 斑馬魚胚胎孵化率 如圖6所示，在胚胎發(fā)育過程中，與對照組相比，AA 組的單獨作用對斑馬魚胚胎的孵化有促進(jìn)作用，這與Huang 等[30]的結(jié)果一致，而經(jīng)過AA 和脂質(zhì)體共同處理的組別對斑馬魚胚胎的孵化率有協(xié)同促進(jìn)的效果，且都比AA 組孵化率高。到72 h 斑馬魚胚胎基本孵化完畢，因此組間無明顯差別。

圖6 脂質(zhì)體對丙烯酰胺作用下斑馬魚胚胎孵化率的影響Fig.6 Effect of chitosan-krill oil nanoliposomes conjugate on hatching rate in zebrafish embryos exposed to AA

2.3.5 斑馬魚胚胎第5 天體長 如圖7所示，在胚胎發(fā)育過程中，與對照組相比，AA 組的單獨作用對斑馬魚胚胎的體長有顯著的抑制作用（P＜0.001），而脂質(zhì)體的處理有助于改善這種情況，且呈劑量依賴性，與AA 組相比，高濃度組（稀釋300倍）對斑馬魚體長有顯著的改善作用（P＜0.01）。

圖7 脂質(zhì)體對丙烯酰胺作用下斑馬魚胚胎第5 天體長的影響Fig.7 Effect of chitosan-krill oil nanoliposomes conjugate on body length （day 5） in zebrafish embryos exposed to AA

3 結(jié)論

經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化，在卵磷脂∶膽固醇為5∶1，卵磷脂∶磷蝦油為19.6∶1，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.146%條件下，制備的脂質(zhì)體粒徑適中，包封率較高，且經(jīng)過驗證也說明該模型的可靠性。由此條件制備的殼聚糖-磷蝦油納米脂質(zhì)體共軛物，對由氧化應(yīng)激損傷造成的生長發(fā)育受到抑制的斑馬魚模型，具有明顯的改善作用，可改善氧化應(yīng)激斑馬魚的自主運動、胎心率、體長，以及抑制畸形率等作用，且在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性。本研究為之后在食品中的應(yīng)用提供了一定的參考。