郭東梅，邱靜，錢永忠，徐麗紅,*，徐明

1. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究所，杭州 310021 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京100081 3. 北京市化工職業(yè)病防治院，北京 100093

在自然界的水生態(tài)系統(tǒng)中，殘留在水體中的化學(xué)污染物，并非以單一的形式存在水環(huán)境中，它們通常是以復(fù)合污染物的形式殘存于環(huán)境中[1-3]。然而當(dāng)前的水生態(tài)系統(tǒng)的風(fēng)險評估研究大多數(shù)集中在單一污染物的研究上，而關(guān)于復(fù)合污染物對水生生物的毒理效應(yīng)的研究相對較少[4-6]。因此，迫切需要開展農(nóng)藥混合污染物對水生生物的毒理效應(yīng)研究，來評估混合污染狀態(tài)下的潛在風(fēng)險。

氰菊酯作為擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的一種，在農(nóng)業(yè)和一些衛(wèi)生害蟲防治中被普遍應(yīng)用[7]。盡管氯氰菊酯農(nóng)藥在土壤環(huán)境中不易遷移但是它極易通過徑流的方式進入水生生態(tài)系統(tǒng)污染水環(huán)境[8]。氯氰菊酯農(nóng)藥在水體中被頻繁檢出，如在巴西的潘塔納爾盆地的水體中有0.01～9.8 mg·L-1的殘留[9-10]。馬拉硫磷在全球是一種被廣泛應(yīng)用的農(nóng)藥，低毒且具有較好的殺蟲和殺螨效果，防治范圍廣[11-12]。氯氰菊酯和馬拉硫磷的殘留物經(jīng)常在水體中被發(fā)現(xiàn)，它們可能共同存在于水生態(tài)系統(tǒng)中，并對水生生物造成嚴(yán)重威脅。

斑馬魚的個體比較小，養(yǎng)殖方便，而且生育周期不長，且產(chǎn)卵量高，目前被國內(nèi)外作為研究內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的模型毒理學(xué)生物[13]。在所有的脊椎動物魚類中，它的繁殖是由下丘腦-垂體-性腺軸（HPG）來調(diào)控的。目前國內(nèi)研究雌激素內(nèi)分泌干擾效應(yīng)主要通過檢測HPG軸相關(guān)的雌激素基因。

筆者研究了農(nóng)藥（氯氰菊酯、馬拉硫磷及其二元混合物）對模型生物斑馬魚胚胎的雌激素作用軸相關(guān)基因的聯(lián)合效應(yīng)，以期為農(nóng)藥復(fù)合污染物對水生態(tài)系統(tǒng)的毒理學(xué)限量標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 實驗材料

將野生AB系斑馬魚飼養(yǎng)在具有活性炭過濾的水循環(huán)系統(tǒng)中，水溫度保持恒溫（26±1） ℃，pH=8.34，總硬度為28～32度，光/暗周期14 h/10 h。斑馬魚每早、中和晚喂食剛孵化的豐年蝦3次。挑選成年斑馬魚雄雌魚比為1∶2，放入底部具有隔層的孵化池，然后待斑馬魚孵化。收集的胚胎，用暴氧水進行反復(fù)清洗，用于胚胎染毒試驗。

1.2 試劑

氯氰菊酯原藥（95%乳油）和馬拉硫磷原藥（95%乳油）均購自山東中石藥業(yè)有限公司；上海生工生物技術(shù)有限公司合成引物；美國Invitrogen公司提供熒光定量SYBR Premix、PCR染料和Trizol提取液；北京全式金生物技術(shù)有限公司提供反轉(zhuǎn)錄試劑盒。

1.3 實驗方法

1.3.1 農(nóng)藥對斑馬魚胚胎急性毒性試驗

氯氰菊酯和馬拉硫磷農(nóng)藥是用丙酮稀釋成100 00 mg·L-1貯備液。采用實驗室的暴氧水對農(nóng)藥貯備液進行稀釋，配制成1.5倍濃度梯度的一系列測試液，配制的測試液中二甲基亞砜（DMSO）終濃度<0.05%。選用24孔細胞培養(yǎng)板進行試驗，農(nóng)藥測試時向培養(yǎng)板的每個孔先加入2.5 mL測試液，然后再用移液管向每個孔移進斑馬魚胚胎。每張24孔細胞板作為一個濃度，每一個測試液濃度設(shè)置16個孔，空白對照設(shè)置4個孔，另外設(shè)置4孔作為溶劑的對照組。每個農(nóng)藥測試濃度設(shè)置3次實驗重復(fù)，用封口膜將測試培養(yǎng)板進行封閉，防止溶液揮發(fā)。將斑馬魚胚胎放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，設(shè)置溫度為（26±1） ℃，光照/黑暗周期為14 h/10 h。為了保證測試藥液的濃度，測試期間每隔24 h更換暴露藥液一次。每24 h調(diào)查斑馬魚胚胎的死亡數(shù)。

1.3.2 農(nóng)藥對斑馬魚胚胎亞慢性暴露試驗

在農(nóng)藥對斑馬魚仔魚急性毒性試驗基礎(chǔ)上，基于單一農(nóng)藥LC50值，測試液最高濃度不超過1/20 LC50值，設(shè)計了氯氰菊酯（1、2和4 μg·L-1）、馬拉硫磷（250、500和1 000 μg·L-1）和氯氰菊酯+馬拉硫磷聯(lián)合暴露組（4 μg·L-1氯氰菊酯+1 000 μg·L-1馬拉硫磷、2 μg·L-1氯氰菊酯+500 μg·L-1馬拉硫磷和1 μg·L-1氯氰菊酯+250 μg·L-1馬拉硫磷）對斑馬魚胚胎的6 d暴露試驗。將配制的農(nóng)藥放入燒杯中，然后再移入100個斑馬魚胚胎于燒杯中，配制的每個農(nóng)藥濃度設(shè)置3次實驗重復(fù)。燒杯放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度（26±1） ℃、光照/黑暗周期14 h/10 h。暴露試驗開始后，每隔24 h用相同濃度新鮮的農(nóng)藥藥液更換，確保暴露試驗藥液的濃度保持不變，每天都對處理樣品進行觀察，及時剔除死亡的胚胎。在斑馬魚的胚胎孵化6 d后，開始每天定時喂2次雞蛋黃。在暴露5 d和10 d后，從每個農(nóng)藥濃度的暴露處理組中挑取20條存活的仔魚，立即放置到EP管中，每個暴露濃度處理組分別收集3管處理樣品。將處理樣品放置-80 ℃冰箱中保存，用于后期的總RNA提取。

1.3.3 總RNA提取和實時熒光定量PCR

RNA的提取和cDNA反轉(zhuǎn)錄按照試劑盒的說明書步驟進行操作。采用Quawell超微量分光光度計測定RNA的質(zhì)量和濃度，測定A260/A280比值在1.8～2.0之間，說明提取的RNA無蛋白質(zhì)和DNA污染，符合實驗要求。實時定量PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min預(yù)變性后，95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s；40 cycles。所有檢測的目標(biāo)基因引物序列如表1所示。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)用統(tǒng)計分析SPSS 16.0軟件進行整理和分析，將濃度的對數(shù)值設(shè)置為自變量（x），斑馬魚的死亡率設(shè)置為因變量（y），建立“劑量-效應(yīng)”線性方程，計算農(nóng)藥的LC50和95%置信區(qū)間。

實時熒光定量PCR結(jié)果的計算，釆用參照基因的ΔCt法計算目標(biāo)基因的表達量，并進行對數(shù)轉(zhuǎn)換。以18SrRNA作為內(nèi)參基因，根據(jù)目標(biāo)基因和18SrRNA的Ct釆用2-ΔΔCt方法計算各個目標(biāo)基因的mRNA相對表達量。

利用SPSS16.0軟件對計算的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVO）法，并用LSD（least significant difference）法進行檢驗，比較不同農(nóng)藥濃度處理組之間的差異顯著性（P<0.05為差異顯著，用小寫字母表示）。

2 結(jié)果（Results）

2.1 氯氰菊酯和馬拉硫磷對斑馬魚仔魚急性毒性

采用急性毒性試驗，測定了氯氰菊酯和馬拉硫磷對斑馬魚胚胎在不同暴露時間的LC50值（表2）。試驗結(jié)果表明，2種農(nóng)藥對斑馬魚胚胎的毒殺作用在所有暴露時間24、48、72和96 h存在一定的時間-劑量效應(yīng)關(guān)系，并且農(nóng)藥對斑馬魚胚胎的LC50隨著暴露時間的延長而逐漸降低。馬拉硫磷對斑馬魚胚胎的96 h-LC50值為17.88 mg·L-1。在暴露96 h時，氯氰菊酯對斑馬魚的胚胎LC50值為0.12 mg·L-1，而且其對胚胎的毒性是馬拉硫磷對仔魚毒性的149倍。

2.2 單一農(nóng)藥氯氰菊酯和馬拉硫磷對斑馬魚胚胎慢性毒性

在急性毒性試驗的基礎(chǔ)上，研究了氯氰菊酯和馬拉硫磷藥劑分別處理斑馬魚胚胎10 d后，對HPG軸雌激素基因（ERα、ERβ1、ERβ2、VTG1、CYP19b、CYP19a和VTG2）表達量的影響（圖1和圖2）。研究結(jié)果表明，氯氰菊酯藥劑（1、2和4 μg·L-1）對斑馬魚胚胎處理10 d，斑馬魚體內(nèi)的CYP19a基因表達和空白對照組的表達相比，表達量明顯被抑制。馬拉硫磷（250 μg·L-1和500 μg·L-1）對斑馬魚體處理后，能顯著增加體內(nèi)的VTG1和VTG2的基因表達量。馬拉硫磷（250、500和1 000 μg·L-1）對斑馬魚體內(nèi)的CYP19a基因顯著抑制。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences of the fluorescence quantitative PCR

表2 單一農(nóng)藥對斑馬魚仔魚半數(shù)致死濃度（LC50）Table 2 The median lethal concentration （LC50） of zebrafish larvae exposed to various concentrations of single pesticide

圖1 氯氰菊酯、馬拉硫磷和氯氰菊酯+馬拉硫磷聯(lián)合暴露對斑馬魚幼魚下丘腦-垂體-性腺軸基因表達量的影響注：CPM為氯氰菊酯，MAL為馬拉硫磷，CPM+MAL為氯氰菊酯+馬拉硫磷；ERα、ERβ1和ERβ2為雌激素受體基因，VTG1為卵黃蛋白基因。Fig. 1 Effects of exposure to cypermethrin, malathion and cypermethrin+malathion on gene expression in hypothalamic-pituitary-gonad axis in juvenile zebrafishNote: CPM is cypermethrin, MAL is malathion, and CPM+MAL is cypermethrin+malathion; ERα, ERβ1 and ERβ2 are estrogen receptor genes, and VTG1 is vitelloprotein gene.

2.3 氯氰菊酯和馬拉硫磷復(fù)合污染對斑馬魚胚胎慢性毒性

在研究了氯氰菊酯和馬拉硫磷單一農(nóng)藥對斑馬魚胚胎的雌激素效應(yīng)的基礎(chǔ)上，也進行了氯氰菊酯和馬拉硫磷的混合污染對斑馬魚胚胎的雌激素聯(lián)合效應(yīng)研究。1 μg·L-1氯氰菊酯+250 μg·L-1馬拉硫磷對斑馬魚胚胎暴露10 d，斑馬魚體內(nèi)的HGP軸ERβ1基因的表達和空白對照組表達相比，表達量被顯著增加。4 μg·L-1氯氰菊酯+1 000 μg·L-1馬拉硫磷對斑馬魚胚胎暴露10 d，斑馬魚體內(nèi)的HPG軸VTG1基因表達和空白對照組表達相比，表達量被顯著增加。1 μg·L-1氯氰菊酯+250 μg·L-1馬拉硫磷、2 μg·L-1氯氰菊酯+500 μg·L-1馬拉硫磷和4 μg·L-1氯氰菊酯+1 000 μg·L-1馬拉硫磷對斑馬魚胚胎暴露10 d，斑馬魚體內(nèi)的HPG軸CYP19b基因表達和空白對照組表達相比，表達量被顯著增加。2 μg·L-1氯氰菊酯+500 μg·L-1馬拉硫磷和4 μg·L-1氯氰菊酯+1 000 μg·L-1馬拉硫磷對斑馬魚胚胎暴露10 d，斑馬魚體內(nèi)的HPG軸CYP19a基因表達和單一農(nóng)藥處理組表達相比，表達量呈顯著上調(diào)。氯氰菊酯和馬拉硫磷聯(lián)合暴露組，在不同聯(lián)合暴露濃度下可以與不同的雌激素受體結(jié)合，增強雌激素效應(yīng)。

圖2 氯氰菊酯、馬拉硫磷和氯氰菊酯+馬拉硫磷聯(lián)合暴露對斑馬魚幼魚下丘腦-垂體-性腺軸基因表達量的影響注：CPM為氯氰菊酯，MAL為馬拉硫磷，CPM+MAL為氯氰菊酯+馬拉硫磷；VTG2為卵黃蛋白基因，CYP19a和CYP19b為芳香化酶基因。Fig. 2 Effects of exposure to cypermethrin, malathion and cypermethrin+malathion on gene expression in hypothalamic-pituitary-gonad axis in juvenile zebrafishNote: CPM is cypermethrin, MAL is malathion, and CPM+MAL is cypermethrin+malathion; VTG2 is vitelloprotein gene, and CYP19a and CYP19b are aromatase genes.

3 討論（Discussion）

斑馬魚對外源污染物有較高的敏感性，在本研究中，氯氰菊酯和馬拉硫磷2種農(nóng)藥對斑馬魚仔魚毒性分別屬于高等毒性和低等毒性。在以往的報道中，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥（氯氰菊酯）對魚類（鯉魚、尼羅羅非魚、虹鱒和褐鱒魚）的毒性均屬于高等毒性[14]，這類農(nóng)藥對魚類具有高等毒性的原因是魚鰓對農(nóng)藥水解率相對比較緩慢，但卻對農(nóng)藥有較高的吸收率，且魚類神經(jīng)系統(tǒng)對菊酯類農(nóng)藥敏感性較強[15-16]。

斑馬魚在無外源污染物的暴露下，幼魚體內(nèi)VTG基因的含量較低，但當(dāng)斑馬魚幼魚受到其他環(huán)境雌激素污染物誘導(dǎo)時，采用分子生物學(xué)手段就能檢測到魚體肝臟內(nèi)的VTG基因。目前斑馬魚體內(nèi)VTG基因已作為評價雌激素內(nèi)分泌干擾物敏感的特定生物標(biāo)志物[17]。雌激素的生理作用是通過靶細胞特異性的受體介導(dǎo)的，在硬骨魚類中雌激素受體基因主要有3種，為ERα、ERβ1和ERβ2[18]。雌激素的合成是通過芳香化酶（CYP19）催化雄激素（如睪酮和雄烯二酮）轉(zhuǎn)化成雌激素（如雌二醇）[18-19]。在本研究中斑馬魚體內(nèi)的HPG軸的VTG1和VTG2基因能被一定濃度的馬拉硫磷顯著誘導(dǎo)，表明了馬拉硫磷對斑馬魚具有雌激素內(nèi)分泌干擾活性。以往研究也表明，馬拉硫磷對MVLN細胞和中國倉鼠卵巢細胞（CHO）具有弱的雌激素效應(yīng)[20-21]。在本研究中，馬拉硫磷對斑馬魚胚胎具有一定的雌激素效應(yīng)，它可能通過介導(dǎo)雌激素受體和改變芳香化酶活性來實現(xiàn)雌激素效應(yīng)。

在天然的水生態(tài)系統(tǒng)中，污染物并非以單體形式單獨存在，而是往往以復(fù)雜污染物的形式存在，因此目前關(guān)于復(fù)合污染物的混合效應(yīng)研究受到了更大的關(guān)注。二元農(nóng)藥氯氰菊酯和馬拉硫磷復(fù)合污染對斑馬魚胚胎暴露研究表明，在一定時間和劑量下二元農(nóng)藥混合物能顯著增加斑馬魚體內(nèi)的HPG軸VTG1的基因表達量，這表明2種農(nóng)藥聯(lián)合顯著增強雌激素效應(yīng)，并能顯著改變雌激素受體和芳香化酶的活性來增加雌激素效應(yīng)。Wang等[22]研究了4種農(nóng)藥（辛硫磷、氯氟氰菊酯、毒死蜱和乙草胺）的二元、三元、四元和多元混合污染對模式生物體蚯蚓的聯(lián)合毒性效應(yīng)，結(jié)果表明，多種農(nóng)藥混合時（三元和四元農(nóng)藥）對蚯蚓的聯(lián)合毒性作用均表現(xiàn)協(xié)同作用。當(dāng)多種農(nóng)藥殘留污染共存時，對水生生物體可能產(chǎn)生復(fù)雜的混合毒性污染效應(yīng)。因此，在未來研究中有必要更多關(guān)注混合污染物的復(fù)合毒理效應(yīng)及其復(fù)合污染的風(fēng)險評估。