張堯雨，楊淑琳(綜述)，魏 林，宋小天(審校)

(河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

原發(fā)性肝癌(primary liver cancer，PLC)是世界范圍內(nèi)發(fā)病率排名第六，病死率排名第三的惡性腫瘤。肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是原發(fā)性肝癌最常見的類型，占75%～85%[1-2]。近年來，分子靶向藥物和免疫療法在肝癌治療上取得了快速進(jìn)展，但由于復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及對抗腫瘤藥物的耐藥性，肝癌患者的五年總生存率仍不容樂觀[3]。外泌體作為細(xì)胞間信息交流的重要媒介，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及耐藥性密切相關(guān)?，F(xiàn)就外泌體在肝癌耐藥中的作用方式進(jìn)行闡述，以深入探討肝癌耐藥的相關(guān)機(jī)制，對指導(dǎo)臨床合理用藥及尋找新的干預(yù)措施具有重要的指導(dǎo)意義。

1 外泌體的發(fā)現(xiàn)

外泌體是由細(xì)胞通過多囊泡體與細(xì)胞膜融合而分泌的40～200 nm的膜包裹囊泡，最初在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，后來被命名為外泌體。外泌體來源于幾乎所有類型的細(xì)胞，并存在于各種體液中，其功能也依賴于來源的細(xì)胞類型。TSG101、分化抗原(cluster of differentiation，CD)81、CD63、CD9是其表面的特異性標(biāo)記物[4-5]。近年來由于其在細(xì)胞間信息交流、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫調(diào)節(jié)和藥物傳遞等方面的作用而備受關(guān)注[6]。目前，外泌體的分離方法有差速超速離心法、磁珠分離法、微流體法、超濾法、尺寸排阻色譜法、聚合物沉淀法等。差速超速離心法是外泌體分離方法的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但該方法需要昂貴的儀器，且獲得的外泌體濃度和純度較低。外泌體含有多種生物活性分子，包括核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等，這些信息物質(zhì)可以包裹在外泌體中被細(xì)胞分泌到微環(huán)境中。受體細(xì)胞可以通過直接融合、內(nèi)吞或直接與其表面標(biāo)志物融合攝取外泌體，通過其攜帶的信息物質(zhì)調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生物學(xué)活性，從而參與機(jī)體免疫應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤侵襲和藥物傳遞等生物學(xué)過程[7]。

2 外泌體與肝癌的發(fā)生發(fā)展

從“種子與土壤”假說到今天，人們對腫瘤的研究不僅局限于腫瘤細(xì)胞本身，而是更加關(guān)注于腫瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)是高度異質(zhì)性的，在功能失調(diào)的環(huán)境(缺氧等條件)下，可導(dǎo)致血管網(wǎng)絡(luò)和信號通路異常，TME中的細(xì)胞通過細(xì)胞間連接、自分泌和旁分泌相互作用進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥[8]。其中，旁分泌因子包括細(xì)胞因子(cytokines，CK)、趨化因子(chemokines)和外泌體，現(xiàn)在被認(rèn)為是占主導(dǎo)地位的生物因子。近年來，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)外泌體在促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[9]。研究表明，許多的外泌體非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)參與了肝癌進(jìn)展過程，非編碼RNA是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA，如微小核糖核酸(microRNA，miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)、環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)等。比如肝癌細(xì)胞分泌的miR-103可以靶向多個(gè)內(nèi)皮連接蛋白，增加血管通透性，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[10]。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞外泌體miR-320a的缺失與肝癌的增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11]。高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞分泌外泌體miR-1247-3p，直接靶向B4GALT3蛋白，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞中整合素β1-NF-κB信號通路激活，激活的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞通過分泌白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素8(interleukin-8，IL-8)等促炎細(xì)胞因子，促進(jìn)肝癌進(jìn)展及轉(zhuǎn)移[12]。外泌體是上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的重要介質(zhì)，可將癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為更具侵襲性的表型。肝癌細(xì)胞來源的外泌體miR92a-3p通過抑制人第10號染色體缺失的磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)和激活A(yù)kt/Snail信號通路在促進(jìn)EMT進(jìn)展和肝癌轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用[13]。外泌體也可通過介導(dǎo)免疫抑制環(huán)境來促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。例如肝癌細(xì)胞分泌外泌體賴氨酰氧化酶樣蛋白4(recombinant lysyl oxidase like protein 4，LOXL4)，一方面可以招募更多的浸潤的巨噬細(xì)胞，另一方面，可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞呈遞抑制性檢查點(diǎn)分子細(xì)胞程序性死亡-配體1(programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1)，削弱細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)介導(dǎo)的免疫監(jiān)視，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃避，導(dǎo)致肝癌的發(fā)生[14]。

3 外泌體與肝癌耐藥

傳統(tǒng)上，腫瘤耐藥機(jī)制包括腫瘤細(xì)胞中抗凋亡蛋白的過度表達(dá)、藥物外排泵的過度表達(dá)、藥物作用靶點(diǎn)的突變、信號通路改變等。肝癌是實(shí)體瘤中最典型的耐藥腫瘤，可過表達(dá)二氫嘧啶脫氫酶、P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)和多藥耐藥(multiple drug resistance，MDR)基因。除了這些已被充分研究的機(jī)制外，外泌體誘導(dǎo)的腫瘤耐藥已成為一種新的機(jī)制被研究者們廣泛關(guān)注[15]。大量研究表明，外泌體可抵抗許多分子靶向藥物和免疫治療方案，包括索拉非尼，免疫檢查點(diǎn)抑制劑、免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合靶向治療等。索拉非尼是美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food And Drug Administration,FDA)批準(zhǔn)的第一個(gè)用于治療晚期肝癌的一線藥物，是一種作用于絲氨酸/蘇氨酸激酶和受體酪氨酸激酶的多激酶抑制劑。免疫檢查點(diǎn)抑制劑是免疫療法中應(yīng)用最為廣泛的方法，主要分為兩大類，一類是以程序性死亡受體1(programmed cell death protein1，PD-1)為代表的抑制劑，另一類是激活劑，激活劑目前還處于臨床研究階段。

外泌體中藥物外排泵的存在與耐藥密切相關(guān)，可能是外泌體中存在的P-gp和ATP結(jié)合盒蛋白(ATP-binding cassette protein，ABC protein)轉(zhuǎn)運(yùn)體家族成員介導(dǎo)藥物在這些小泡中主動(dòng)隔離。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體家族成員的過度表達(dá)曾被廣泛認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的重要因素，其介導(dǎo)的藥物外排泵作用是腫瘤發(fā)生耐藥的重要原因之一。有人認(rèn)為，藥物刺激可促進(jìn)外泌體的產(chǎn)生從而加速藥物外排，或許會(huì)成為一種新的耐藥機(jī)制。外泌體可能通過調(diào)節(jié)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體家族成員的表達(dá)而促進(jìn)肝癌耐藥。研究表明，在索拉非尼、喜樹堿和阿霉素等抗腫瘤藥物作用下，肝癌細(xì)胞來源的外泌體高表達(dá)lnc-VLDLR，顯著上調(diào)ABCG2(ATP結(jié)合盒、G亞家族成員2)的表達(dá)，從而加快藥物外排、消除肝癌細(xì)胞的藥物反應(yīng)和敏感性導(dǎo)致耐藥[16]。另外，耐藥細(xì)胞中的某些物質(zhì)可通過外泌體轉(zhuǎn)移至藥物敏感(受體)細(xì)胞，使其獲得多藥耐藥的表型。例如外泌體circRNA-SORE和肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)。研究認(rèn)為circRNA-SORE通過外泌體促進(jìn)肝癌細(xì)胞對索拉非尼耐藥[17]。circRNA-SORE在索拉非尼耐藥肝癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，藥物敏感細(xì)胞在過表達(dá)circRNA-SORE后也獲得了耐藥性。沉默circRNA-SORE則可以顯著增強(qiáng)藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡。另一項(xiàng)研究顯示，高度侵襲性肝癌細(xì)胞來源的外泌體可誘導(dǎo)其他肝癌細(xì)胞產(chǎn)生索拉非尼耐藥性[18]。其機(jī)制是外泌體中HGF增多，通過激活HGF/c-Met/Akt途徑抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤生長，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞對索拉非尼耐藥。

雖然EMT被公認(rèn)為是癌癥轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵介質(zhì)，但最近的研究顯示，其對于腫瘤的治療耐藥性也是至關(guān)重要的。目前EMT促進(jìn)耐藥性的詳細(xì)機(jī)制尚不清楚，但可能歸因于間充質(zhì)狀態(tài)、特定轉(zhuǎn)錄因子和相關(guān)信號級聯(lián)的失調(diào)等。對于耐藥性的影響，最近的一項(xiàng)研究表明，耐藥肝癌細(xì)胞分泌的外泌體以EMT依賴的方式“培養(yǎng)”敏感細(xì)胞成為多藥耐藥細(xì)胞[19]。來自耐藥肝癌細(xì)胞的外泌體可以將致癌的miR-32-5p轉(zhuǎn)移至藥物敏感細(xì)胞，導(dǎo)致藥物敏感細(xì)胞中PTEN水平顯著降低，從而觸發(fā)PI3K/Akt/mTOR通路的激活，并通過調(diào)節(jié)血管生成和EMT誘導(dǎo)多藥耐藥(5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、吉西他濱和索拉非尼)的發(fā)生。然而，持續(xù)使用外泌體分泌抑制劑GW4869，導(dǎo)致外泌體miR-32-5p減少，EMT逆轉(zhuǎn)，最終抑制了5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、吉西他濱和索拉非尼的耐藥性。此進(jìn)一步確定了肝癌組織中外泌體miR-32-5p水平與EMT發(fā)生耐藥的相關(guān)性。

腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell，CSC)是肝癌細(xì)胞的一個(gè)亞群，具有很強(qiáng)的自我更新、分化和成瘤能力。越來越多的證據(jù)表明，干細(xì)胞對肝癌的許多治療手段都具有抗性。干細(xì)胞的干性相關(guān)基因，包括上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)、CD133、CD90等在耐藥肝癌細(xì)胞中高度表達(dá)。因此，干細(xì)胞被認(rèn)為是促成肝癌耐藥性的關(guān)鍵因素?；诖耍琓ME中的外泌體內(nèi)容物可以通過引發(fā)干細(xì)胞特性來參與治療耐藥。對于肝細(xì)胞癌，索拉非尼治療的肝癌細(xì)胞和轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)均可以富集外泌體lnc-ROR，一方面通過抑制抑癌基因p53依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)耐藥，另一方面通過擴(kuò)增CD133+干細(xì)胞群減少索拉非尼誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞死亡。進(jìn)一步敲低lnc-ROR則可增強(qiáng)索拉非尼誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞死亡，同時(shí)減少了 CD133+的干細(xì)胞，這些結(jié)果表明外泌體lnc-ROR是驅(qū)動(dòng)肝癌干細(xì)胞誘導(dǎo)治療耐藥性的基礎(chǔ)[20]。

免疫治療被認(rèn)為是晚期肝癌的一種有前途的治療方法，但仍有相當(dāng)比例肝癌患者無反應(yīng)甚至出現(xiàn)耐藥。外泌體除了在肝癌的靶向藥物治療中參與耐藥的發(fā)生，其在免疫治療中也存在著促進(jìn)耐藥的現(xiàn)象。最近一項(xiàng)研究表明外泌體circUHRF1可促進(jìn)肝癌的免疫逃逸(immune evasion)，阻斷PD-1抗體治療[21]。其原因可能是肝癌細(xì)胞來源的外泌體circUHRF1抑制了自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)細(xì)胞來源的干擾素γ(interferon-gamma，IFN-γ)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)的分泌。此外，circUHRF1也可通過降解miR-449c-5p上調(diào)T淋巴細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3，TIM-3)的表達(dá)，抑制NK的殺傷功能，從而促進(jìn)肝癌的免疫逃逸和對PD-1抗體治療的抵抗。因此，抑制circUHRF1有可能成為肝癌患者的治療靶點(diǎn)。

4 外泌體在肝癌耐藥治療中的作用

目前，常用的藥物遞送系統(tǒng)有脂質(zhì)體和聚合物納米顆粒(nanoparticles，NPs)。這兩種給藥系統(tǒng)已被用于遞送不同類型的藥物分子，包括抗癌藥物、抗真菌藥物和鎮(zhèn)痛藥等。然而，脂質(zhì)體制劑因無法承受剪切壓力、溫度、酸堿度或稀釋劑濃度的變化，且無法精確地輸送到體內(nèi)的特定位置限制了它的使用[22]。聚合物納米顆粒比脂質(zhì)體系統(tǒng)具有更好的穩(wěn)定性，但它們的生物相容性和潛在的安全性仍有待進(jìn)一步研究。隨著外泌體的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)外泌體或外泌體模擬物擁有高效的貨物運(yùn)輸功能，具有理想藥物傳遞系統(tǒng)的許多特征，如循環(huán)半衰期長、靶向組織能力強(qiáng)、生物相容性好，沒有內(nèi)在毒性等。這似乎是一種更好的選擇，能克服大多數(shù)脂質(zhì)體或聚合物藥物傳遞系統(tǒng)的局限性。許多文獻(xiàn)表明，外泌體給藥系統(tǒng)可以應(yīng)用到腫瘤的治療中[23-24]。

眾所周知，干細(xì)胞療法已用于治療或預(yù)防疾病多年。在已上市的干細(xì)胞產(chǎn)品中應(yīng)用最多的就是間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)。并且在已知的產(chǎn)生外泌體的細(xì)胞類型中，人類間充質(zhì)干細(xì)胞是產(chǎn)量最高的細(xì)胞。最近一項(xiàng)研究表明將miR-122包裹到脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體中，通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯有效地增強(qiáng)了肝癌的治療敏感性[25]。此外，瘤內(nèi)注射外泌體miR-122可顯著增強(qiáng)索拉非尼對肝癌的體內(nèi)抗腫瘤作用，這為肝癌患者的治療提供了新的策略。同樣，siGRP78修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體能敏化索拉非尼耐藥的肝癌細(xì)胞，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解，進(jìn)而抑制腫瘤的進(jìn)展，并逆轉(zhuǎn)其耐藥性。并且外泌體siGRP78在體內(nèi)外均可以抑制肝癌生長和侵襲[26]。也有越來越多的證據(jù)表明，外泌性miRNA參與肝癌耐藥治療。如Wang等[27]用富含miR-744的外泌體處理肝癌細(xì)胞，通過抑制PAX2蛋白的表達(dá)抑制了肝癌細(xì)胞的增殖，并增強(qiáng)了肝癌細(xì)胞對索拉非尼治療的敏感性。Semaan等[28]用富含miR-214的人腦內(nèi)皮細(xì)胞衍生的外泌體聯(lián)合抗癌劑(奧沙利鉑或索拉非尼)治療肝癌，與單獨(dú)使用抗癌劑相比，顯著降低了肝癌細(xì)胞的生存力和侵襲力，其機(jī)制是miR-214降低了肝癌細(xì)胞P-gp蛋白和SF3B3蛋白的表達(dá)，P-gp和SF3B3是廣為人知的可以促進(jìn)肝癌化療耐藥性和癌細(xì)胞增殖的兩種蛋白。該聯(lián)合治療對肝癌細(xì)胞具有靶向性，機(jī)體內(nèi)正常組織和細(xì)胞不受影響。之前的研究報(bào)道過，索拉非尼誘導(dǎo)耐藥是通過增強(qiáng)PD-L1的表達(dá)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory cells，Tregs)的比例，進(jìn)一步在原位肝癌模型中誘導(dǎo)了免疫抑制。最近有研究表示外泌體聯(lián)合免疫療法可以增強(qiáng)索拉非尼的療效。這是由于外泌體減少了Tregs的數(shù)量，增加了CTL細(xì)胞的數(shù)量，但單獨(dú)使用外泌體或PD-1抗體則效果不明顯[29]。

由于外泌體介導(dǎo)了肝癌治療耐藥，因此可能會(huì)成為預(yù)測肝癌耐藥的一種潛在的非侵入性生物標(biāo)志物。肝癌患者血清中存在著許多外泌體miRNA、lncRNA、circRNA，可通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)或酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)進(jìn)行定量檢測，對治療反應(yīng)較差的肝癌患者有較好的臨床應(yīng)用前景。通過抑制外泌體的生物發(fā)生或抑制外泌體輸出抗藥性物質(zhì)是可行的。盡管外泌體在肝癌方面的相關(guān)工作較少，但已經(jīng)在其他腫瘤開展了下一步的研究。靶向外泌體極有可能是逆轉(zhuǎn)肝癌耐藥性的一項(xiàng)候選策略。

5 展 望

隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，肝癌的治療取得了巨大的進(jìn)步，分子靶向藥物及免疫療法作為中晚期肝癌的主要治療手段，其發(fā)生耐藥的機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。外泌體作為細(xì)胞間信息交流媒介，不僅可以促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展及耐藥，也可以作為很好的藥物遞送系統(tǒng)以治療肝癌。同時(shí)外泌體也可以作為肝癌診斷，預(yù)后及耐藥的生物標(biāo)志物指導(dǎo)臨床治療疾病。然而，機(jī)體內(nèi)腫瘤微環(huán)境是一個(gè)非常復(fù)雜的體系，對肝癌微環(huán)境外泌體的深入研究，必將進(jìn)一步拓展人們對肝癌進(jìn)展及耐藥的認(rèn)識，加深人們對肝癌微環(huán)境中外泌體功能理解，以期為肝癌的治療提供新靶點(diǎn)、新策略。