王興國 徐智陽 劉淑娟 邢金良

卵巢癌是婦科三大常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)發(fā)病率居?jì)D科惡性腫瘤第三位，死亡率居第二位［1］。卵巢癌目前尚缺乏有效的早期篩查手段，且發(fā)病隱匿，早期癥狀不明顯，因此75%的患者確診時已處于晚期［2］，5年生存率僅為39%［3］。早期患者5年生存率可達(dá)71%～93%［4］。在目前的臨床實(shí)踐中，血清糖類抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）、人類附睪蛋白4（human epididymis protein，HE4）等傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物檢測對輔助卵巢癌診斷及判斷腫瘤的治療效果具有重要意義。但傳統(tǒng)標(biāo)志物在敏感度和特異度兩方面都無法滿足早期診斷的要求，因而在卵巢癌早期篩查中仍具有一定的局限性。近年來，一種利用人體體液作為標(biāo)本來源檢測獲取腫瘤相關(guān)信息的技術(shù)——液體活檢技術(shù)［5］為卵巢癌的早期診斷研究開辟了新方向。液體活檢分析的分子標(biāo)志物包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）、循環(huán)腫瘤RNA（circulating tumor RNA，ctRNA）、循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、腫瘤培養(yǎng)的血小板（tumor educated platelet，TEP）等。目前，不斷涌現(xiàn)的新型生物標(biāo)志物為卵巢癌的早期診斷檢測提供了更多檢測靶標(biāo)。本文就腫瘤標(biāo)志物在卵巢癌診斷中的研究進(jìn)展作一綜述。

1 傳統(tǒng)卵巢癌標(biāo)志物

1.1 CA125

CA125是一種由氨基酸端、結(jié)構(gòu)域和羧基端三部分構(gòu)成的表達(dá)于各類上皮細(xì)胞表面的高分子量糖蛋白［6］，全長179 kb，定位于染色體19p13.2。CA125被認(rèn)為是監(jiān)測卵巢癌最重要的生物標(biāo)志物之一，靈敏度較高，但特異度欠佳。研究顯示，血清CA125預(yù)測卵巢癌的平均靈敏度為81.4%（95%CI：74.6%～84.2%）、平 均 特 異 度 為 56.8%（95%CI：47.9%～65.4%）［7］。RADU等［8］報(bào)道CA125在卵巢癌早期檢測中敏感度較低，其中約50%的Ⅰ期患者血清CA125水平在正常范圍內(nèi)。此外，還有研究顯示，在月經(jīng)、妊娠早期或伴有子宮腺肌癥、子宮內(nèi)膜異位癥等狀態(tài)下，血清CA125水平也可能升高，因此假陽性率也較高［9］。盡管血清CA125檢測在臨床上有一定局限性，但目前CA125仍是篩查早期卵巢癌的主要血清標(biāo)志物，且許多臨床研究提出的早診檢測組合均是基于血清CA125檢測，因此血清CA125檢測仍是卵巢癌生物標(biāo)志物研究的基石。

1.2 HE4

HE4最初從人附睪上皮細(xì)胞中分離出來，是一種由WFDC2基因編碼的分泌型糖蛋白，相對分子量為25 kDa，定位于染色體20q12～13.1［10］。HE4作為一種新的生物標(biāo)志物，目前已用于卵巢癌診斷。HE4在卵巢癌組織中特異性高表達(dá)，尤其在子宮內(nèi)膜樣腺癌中100%表達(dá)，但在正常卵巢組織中不表達(dá)［11］。一項(xiàng)納入17項(xiàng)研究包含3 404例患者的薈萃分析顯示，HE4預(yù)測卵巢癌的平均靈敏度為79.4%（95%CI：74.1%～83.8%）、平均特異度為84.1%（95%CI：79.6%～87.8%），特異度顯著高于CA125［7］。此外，不同于CA125的高假陽性率，HE4因不受懷孕或月經(jīng)周期影響，在伴子宮內(nèi)膜異位癥或其他良性卵巢腫瘤患者血液中也不會升高，是絕經(jīng)前婦女較理想的生物標(biāo)志物［12］。但是，HE4并非全能。研究顯示，HE4在卵巢癌中的表達(dá)因腫瘤組織學(xué)亞型不同而相差很大，在子宮內(nèi)膜樣腺癌中100%表達(dá)，而在黏液性腺癌中不表達(dá)［13］。同時，HE4的檢測特異性同樣未達(dá)到100%，其在子宮內(nèi)膜癌中也有較高陽性率［14］。因此，HE4在卵巢癌篩查診斷中的應(yīng)用依然存在較大的局限性。

目前越來越多的學(xué)者提出，聯(lián)合其他指標(biāo)監(jiān)測可提高卵巢癌診斷的靈敏度和特異度。現(xiàn)今也已經(jīng)開發(fā)了多種基于血清CA125和（或）HE4水平并結(jié)合患者絕經(jīng)狀態(tài)等指標(biāo)預(yù)測可疑良性卵巢腫瘤患者患卵巢癌風(fēng)險的評估模型并表現(xiàn)出了良好的診斷價值，如卵巢癌風(fēng)險算法（risk of ovarian malignancy algorithm，ROMA）、惡性風(fēng)險指數(shù)（risk of malignancy index，RMI）、哥本哈根指數(shù)（Copenhagen index，CPH-I）等，尤其ROMA已被納入《卵巢惡性腫瘤診斷與治療指南》［15］。有研究報(bào)道，血清HE4、CA125和ROMA指數(shù)聯(lián)合是診斷絕經(jīng)后卵巢癌的最佳組合［16］。RMI、CPH-I與ROMA在卵巢癌診斷上具有同等的效能［17］?？傊珻A125與HE4的聯(lián)合檢測以及在此基礎(chǔ)上ROMA指數(shù)的模型計(jì)算是目前臨床上最簡單高效的卵巢癌早期篩查手段之一。

2 新型卵巢癌標(biāo)志物

2.1 CTCs

CTCs是一種從腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落后進(jìn)入外周血液循環(huán)并存活的腫瘤細(xì)胞，與腫瘤轉(zhuǎn)移和增殖密切相關(guān)［18］。CTCs有三個特點(diǎn)：一是含量低，在大多數(shù)癌癥患者中，每10 mL血液僅有1～10個CTCs；二是半衰期短，僅為 1.0～2.4 h［19］；三是腫瘤早期可檢測到，在常規(guī)臨床診斷前即可發(fā)現(xiàn)［20］。這些特點(diǎn)也決定了CTCs對富集檢測技術(shù)要求極高，且CTCs檢測結(jié)果具有較強(qiáng)的時效性和預(yù)知性。

CTCs檢測技術(shù)主要由CTCs分離富集技術(shù)和CTCs鑒定技術(shù)構(gòu)成。CTCs分離富集技術(shù)主要包括密度梯度離心和免疫磁性分離法。CTCs鑒定技術(shù)主要包括免疫組織化學(xué)技術(shù)（IHC）、實(shí)時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）、熒光原位雜交技術(shù)（FISH）［21］。PEARL等［22］通過自創(chuàng)的基于細(xì)胞黏附基質(zhì)的功能富集平臺和IHC法分析129例術(shù)前卵巢癌患者CTCs，結(jié)果CTCs檢出率為88.6%，診斷卵巢癌的靈敏度為83%、陽性預(yù)測值（positive predictive value，PPV）為97.3%，CTCs診斷Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌的靈敏度為41.2%，特異度為95.1%，PPV為77.8%。為提高CTCs對早期卵巢癌的診斷效能，ZHANG等［23］采用EpCAM、HER2和MUC1的免疫磁性分離富集方法，并結(jié)合多重RTPCR檢測109例卵巢癌患者外周血中的CTCs，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)早期（ⅠA～ⅠB期）卵巢癌患者的CTCs陽性率為93%，而CA125陽性率僅為64%。因此認(rèn)為，CTCs是卵巢癌診斷的潛在生物標(biāo)志物。

2.2 ctRNA

2.2.1 血漿及外泌體微小RNA 微小RNA（miRNA）是內(nèi)源性表達(dá)的單鏈非編碼RNA，長度為19～25 nt。研究發(fā)現(xiàn)，血清中的miRNA主要集中在外泌體中［24］。外泌體可以將mRNA、miRNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)從它們的起源細(xì)胞運(yùn)送到細(xì)胞外空間，從而參與調(diào)節(jié)其他細(xì)胞的病理生理功能，因此外泌體被認(rèn)為是細(xì)胞間通訊的一種形式。此外，miRNA還能與載體蛋白或高密度脂蛋白結(jié)合，或被包裹在外泌體中，從而免受循環(huán)中核糖核酸酶的影響，因此在體液中穩(wěn)定表達(dá)［25］。而miRNA表達(dá)的特異性及穩(wěn)定性使其具有成為卵巢癌早期診斷生物標(biāo)志物的潛力。目前已有多種外泌體miRNAs被發(fā)現(xiàn)與卵巢癌有關(guān)，如miR-200a、miR-26a可能參與卵巢癌細(xì)胞增殖，miR-21-3p、miR-125b-5p、miR-181d-5p和miR-205等能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移［21］。外泌體miR-1290在診斷卵巢癌中也表現(xiàn)了一定敏感性，特異度和靈敏度分別為85%和63%［26］。但是，由于組織學(xué)的多樣性和個體差異性，miRNAs組合往往較單一的miRNA診斷準(zhǔn)確性更高。如ZHENG等［27］發(fā)現(xiàn)miR-205和let-7f組合在上皮性卵巢癌早期診斷中具有較高的準(zhǔn)確性（AUC為0.89）。YOKOI等［28］基于 10 種 miRNAs（miR-320a、miR-665、miR-1275、miR-3184-5p、miR-3185、miR-3195、miR-4459、miR-4640-5p、miR-6076和miR-6717-5p）表達(dá)水平構(gòu)建了卵巢癌診斷模型并表現(xiàn)出了理想的靈敏度（99%）和特異度（100%）；在Ⅰ期卵巢癌患者診斷中，準(zhǔn)確率甚至高達(dá)95.1%?？梢?，miRNA及其組合在卵巢癌診斷中具有較高的靈敏度、特異度，有望應(yīng)用于卵巢癌的早期診斷。但目前有關(guān)研究大多為回顧性，因此其診斷效能仍需在大規(guī)模的前瞻性研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.2.2 長鏈非編碼RNA 長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類不具備蛋白質(zhì)編碼能力的RNA，長度大于200 nt［29］。目前已注釋的人類lncRNA近60 000個［30］。研究表明，lncRNA與包括卵巢癌在內(nèi)的多種癌癥有關(guān)［31］，表達(dá)模式往往具有高度組織特異性和疾病特異性［32］，因此具備作為卵巢癌診斷生物標(biāo)志物的潛力。CHANG等［33］研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的HOTAIR通過負(fù)性調(diào)控miR-206的表達(dá)刺激卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，進(jìn)而增強(qiáng)CCND1和CCND2的表達(dá)。lncRNA HOTAIR過表達(dá)也與卵巢癌組織學(xué)分級、FIGO分期及廣泛轉(zhuǎn)移相關(guān)，此外HOST2、TUG1、H19、SNHG12等異常高表達(dá)在卵巢癌進(jìn)展中也發(fā)揮作用［34］。lncRNA MALAT1在卵巢癌細(xì)胞中異常高表達(dá)，其通過海綿吸附miR-143-3p調(diào)控CMPK表達(dá)，促進(jìn)卵巢癌侵襲、轉(zhuǎn)移［35］。但是在卵巢癌細(xì)胞中也有部分lncRNA呈低表達(dá)，如TUBA4B、MEG3、XIST等［34］。LONG等［36］也報(bào)道lncRNA Gas5在卵巢癌組織中明顯低表達(dá)并與預(yù)后相關(guān)，且Gas5-E2F4-PARP1-MAPK軸在卵巢癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

2.2.3 環(huán)狀RNA 環(huán)狀RNA（circRNA）是一類具有共價封閉結(jié)構(gòu)的單鏈環(huán)狀非編碼RNA。與線性RNA相比，circRNA具有不含5'端和3'端的結(jié)構(gòu)特征，使其更加穩(wěn)定、保守、高豐度［37］。這些獨(dú)特的特性也使circRNAs成為研究熱點(diǎn)之一。在卵巢癌中，異常的circRNA可以在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，從而介導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、免疫逃逸和耐藥等多種惡性生物學(xué)行為［38］，有望成為卵巢癌的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。XIE等［39］報(bào)道，circEPSTI1可通過海綿吸附miR-942上調(diào)EPSTI1的表達(dá)，然后激活Wnt/β-catenin信號通路，從而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖。另有多種circRNA也在卵巢癌中展現(xiàn)了較好的診斷價 值 ，如 circ-ABCB10［40］、circMAN1A2［41］等 。 PEI等［42］也發(fā)現(xiàn)，has_circ_0013958在卵巢癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)且與FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；has_circ_0013958作為卵巢癌診斷標(biāo)志物的靈敏度為80.0%、特異度為91.1%、AUC為0.912。TENG等［43］采用高通量測序分析21例上皮性卵巢癌和21例正常卵巢組織中的circRNA表達(dá)譜，共發(fā)現(xiàn)7 333個circRNA，其中circHIPK3是含量豐度最高的分子之一，有望成為診斷卵巢癌新的生物標(biāo)志物。因此，NGS技術(shù)推動了circRNA研究進(jìn)一步發(fā)展，未來將會有越來越多的circRNA被發(fā)現(xiàn)［44］。

2.3 ctDNA

2.3.1 血漿ctDNA ctDNA是指腫瘤細(xì)胞死亡或破裂后釋放出來的遺傳物質(zhì)，主要存在于腫瘤患者的循環(huán)系統(tǒng)中［45］。1977年，研究人員首次在癌癥患者的血液中發(fā)現(xiàn)ctDNA［46］。ctDNA通常由70～200 bp的短核酸片段組成，可能攜帶與原發(fā)腫瘤相似的基因改變和突變，目前已被用于檢測腫瘤特異性突變、雜合性缺失、DNA完整性、啟動子過甲基化、微衛(wèi)星改變和表觀遺傳改變［47］。ctDNA還可以克服腫瘤的異質(zhì)性，反映人體的腫瘤負(fù)荷，及時反映患者病情，是一種很有前景的生物標(biāo)志物。LIGGETT等［48］報(bào)道，卵巢癌患者血漿中ctDNA的RASSF1A、CALCA和EP300等3個基因啟動子甲基化在鑒別卵巢癌患者與健康人群具有較高的靈敏度（90%）和特異度（86.7%）。深度測序技術(shù)為檢測血漿中少量的DNA提供了技術(shù)支持。NEBGEN等［49］通過深度測序技術(shù)檢測出等位基因頻率2%突變的靈敏度和特異度均高于97%，表明ctDNA檢測在非侵入性技術(shù)方面具有獨(dú)特優(yōu)勢。COHEN等［50］還開發(fā)了基于血液的腫瘤早篩技術(shù)CancerSEEK，其診斷卵巢癌的靈敏度和特異度分別為98%、99%。這是一種能檢測常見ctDNA突變基因和8種蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的非侵入性的血液檢測方法，但目前尚處于試驗(yàn)階段，其有效性尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。隨著技術(shù)檢測和研究方法的改進(jìn)，未來ctDNA檢測有望在卵巢癌的早期診斷中取得突破進(jìn)展。

2.3.2 血漿線粒體DNA 釋放入血的腫瘤DNA根據(jù)核基因和核外基因分為核DNA（nuclear DNA，nDNA）和線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）。其中，人類mtDNA是存在于線粒體基質(zhì)內(nèi)由11個mRNA，22個tRNA和2個rRNA（16S，12S）以及調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯的非編碼區(qū)——D環(huán)（displacement loop，D-loop）區(qū)組成的一個總長為16 569 bp的環(huán)狀雙鏈DNA分子［51］，相對于nDNA，mtDNA具有母系遺傳、基因組小、高拷貝數(shù)、高突變率等特點(diǎn)，在細(xì)胞代謝、生物合成、衰老、凋亡等過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［52］。點(diǎn)突變是腫瘤細(xì)胞中最常見的mtDNA變異，而mtDNA D-loop控制區(qū)包含mtDNA復(fù)制起始點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄啟動子，不僅是mtDNA轉(zhuǎn)錄復(fù)制的調(diào)控區(qū)，而且是mtDNA突變的熱點(diǎn)區(qū)域［53］。劉首娟等［54］在93例卵巢癌患者中發(fā)現(xiàn)60例（64.5%）D-loop區(qū)突變，其中突變位點(diǎn)73A/G和523C/del增加了卵巢癌的發(fā)病風(fēng)險，突變位點(diǎn)366G/A和411C/G也可能與卵巢癌發(fā)病密切相關(guān)，且D-loop區(qū)突變聯(lián)合CA125檢測可提高卵巢癌的早期診斷準(zhǔn)確性（靈敏度為79.49%～100.00%）。由此可見，mtDNA具有作為卵巢癌診斷標(biāo)志物的潛能。

2.3.3 宮腔灌洗液ctDNA 卵巢癌脫落細(xì)胞會聚集在宮頸處，利用巴氏試驗(yàn)獲取的宮腔灌洗樣本可檢測到足夠量的腫瘤DNA［55］。因此認(rèn)為，該法有望成為卵巢癌早期診斷的途徑。MARITSCHNEGG等［56］通過大規(guī)模平行測序分析65例患者（卵巢癌30例、良性腫瘤27例、其他惡性腫瘤8例）的宮腔灌洗樣本ctDNA，發(fā)現(xiàn)在60%卵巢癌患者樣本ctDNA中可檢測到突變，且以TP53突變?yōu)橹鳎贿M(jìn)一步利用微滴式數(shù)字PCR技術(shù)檢測，突變率提高至80%；其中在ⅠA期患者樣本ctDNA中均檢測到TP53突變，但良性腫瘤患者均未檢測到TP53突變。在液體活檢中，深度測序被認(rèn)為是檢測腫瘤低水平突變特征的首選方法［56］。其中，雙鏈測序（duplex sequencing，DS）能將錯誤率降低到十萬分之一以下，是目前測序準(zhǔn)確率最高的NGS測序方法［57］。SALK等［58］使用DS檢測宮腔灌洗液中ctDNA TP53突變，其對卵巢癌檢測的靈敏度為80%，但在健康女性樣本中也檢測到低頻的TP53突變。因此，為了避免假陽性結(jié)果，可用突變等位基因頻率閾值區(qū)分癌癥特異性變化和年齡相關(guān)突變，相信隨著技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，宮腔灌洗的分子分析將在卵巢癌早期診斷中展現(xiàn)更大的潛力。

2.4 TEP

TEP RNA譜也有望成為卵巢癌診斷的腫瘤標(biāo)志物。腫瘤細(xì)胞通過直接接觸和外泌的釋放將生物分子（如RNA）轉(zhuǎn)移到血小板，從而改變血小板前體RNA。在腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境的刺激下，血小板前體mRNA剪切成成熟的RNA并轉(zhuǎn)化為功能性蛋白以應(yīng)對外界刺激，最終形成TEP［59］。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，TEP RNA表達(dá)譜發(fā)生變化，使其具備成為腫瘤生物標(biāo)志物的潛能。而TEP作為生物標(biāo)志物具有三大優(yōu)點(diǎn)：一是血小板作為人體內(nèi)無核細(xì)胞器，不受基因組DNA干擾；二是實(shí)驗(yàn)室操作易于標(biāo)準(zhǔn)化；三是TEP RNA譜可反映腫瘤細(xì)胞的病理過程，提高腫瘤早期診斷的靈敏度［60］。PIEK 等［61］研究發(fā)現(xiàn)TEP可作為鑒別早期（Ⅰ～Ⅱ期）卵巢癌與良性卵巢腫瘤的診斷指標(biāo)，準(zhǔn)確率達(dá)80%。也有研究報(bào)道TEPs和ctDNA/CTC的組合分析是潛在的癌癥診斷方法［21］。目前以評估TEP和ctDNA鑒別卵巢腫瘤準(zhǔn)確性的臨床試驗(yàn)（NCT04022863）也正在進(jìn)行中，結(jié)果值得期待。

3 小結(jié)

腫瘤標(biāo)志物檢測是臨床上常用的早期卵巢癌篩查診斷的手段，但是單獨(dú)檢測傳統(tǒng)標(biāo)志物CA125和HE4都有一定局限性，聯(lián)合多種標(biāo)志物檢測可以提高診斷效能。近年來液體活檢技術(shù)發(fā)展迅速，在卵巢癌早期篩查診斷、動態(tài)檢測、精準(zhǔn)化治療中扮演了越來越重要的角色，展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景。相信隨著液體活檢檢測技術(shù)和研究方法的不斷改進(jìn)，未來將會挖掘更多特異度、靈敏度更高的新型腫瘤標(biāo)志物，從而助力卵巢癌早期診斷。