樊慧明 汪斌如 陳始明

惡性腫瘤仍是當(dāng)今難以治愈的疾病之一，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。2020年全球累計新發(fā)癌癥病例數(shù)1 930萬例，其中新發(fā)死亡病例數(shù)近1 000萬例，且大多數(shù)癌種的死亡率居高不下［1］。目前，除了傳統(tǒng)的手術(shù)、放療及化療外，腫瘤的靶向治療和免疫治療發(fā)展迅速，并取得了令人鼓舞的效果。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）是一類具有強大負(fù)性免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群［2］，1995年Sakaguchi首次發(fā)現(xiàn)并將其命名為 Treg［3］，該細(xì)胞具有拮抗效應(yīng)T細(xì)胞（effector T cell，Teff）及維持自身免疫穩(wěn)態(tài)作用［4］。然而，近年來大量研究表明Treg細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中可抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)并促進腫瘤生長。當(dāng)Treg細(xì)胞在腫瘤組織中異常表達時，能抑制正?？鼓[瘤免疫反應(yīng)并促進腫瘤生長［5］。因此，Treg細(xì)胞在腫瘤的免疫治療和靶向治療中具有巨大的應(yīng)用前景。本文就Treg細(xì)胞的腫瘤靶向治療研究進展作一綜述。

1 Treg細(xì)胞與TME

Treg細(xì)胞首先通過趨化作用在腫瘤組織中募集，作為正常機體中本就存在的T細(xì)胞，Treg細(xì)胞表面表達的趨化因子受體CCR4會選擇性地與趨化因子配體CCL22結(jié)合，而CCL22正好高表達于各類腫瘤組織中。諸多研究表明，TME中的CCR4/CCL22信號通路是Treg細(xì)胞向腫瘤組織趨化的主要源動力［6-9］。除了CCR4/CCL22通路外，CCR4/CCL17、CCR5/CCL5和CXCR4/CXCL12等趨化通路也參與其中。然后，Treg細(xì)胞在腫瘤組織中浸潤后，會通過以下方式破壞Teff細(xì)胞的抗腫瘤免疫活性：⑴Treg細(xì)胞表達免疫抑制因子IL-10和IL-35，干擾淋巴細(xì)胞終末分化軸BLIMP1并啟動 Teff凋亡信號，耗竭Teff［10］。⑵Treg細(xì)胞分泌TGF-β，而TGF-β不僅對Teff有抑制作用，還能作用于巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞而使其偏向抑制性表型［11-12］。⑶Treg細(xì)胞在TME中分泌顆粒酶B并以穿孔素依賴的方式直接殺傷Teff［13］。⑷Treg細(xì)胞在其表面表達一些特定分子如IL-2受體CD25、胞外核酸酶CD39/73、免疫檢查點CTLA-4、PD-1、LAG-3、TIGIT 、TIM-3及共刺激分子GITR、OX40等，通過多種途徑發(fā)揮免疫抑制作用。因此，未來通過靶向Treg細(xì)胞在TME中的趨化途徑及各個免疫抑制環(huán)節(jié)，有望抑制其在抗腫瘤反應(yīng)中的作用，從而達到治療腫瘤的目的。

2 Treg細(xì)胞的靶向治療

2.1 靶向趨化因子通路

Treg細(xì)胞向腫瘤組織浸潤時需要特定的趨化通路進行介導(dǎo)，如 CCR4/CCL22、CCR4/CCL17、CCR5/CCL5或CXCR4/CXCL12等，因此當(dāng)利用藥物阻斷以上通路時，可以有效切斷Treg細(xì)胞趨化途徑，減少腫瘤組織內(nèi)的Treg細(xì)胞數(shù)量，從而增強抗腫瘤免疫反應(yīng)。

Mogamulizumab（KW-0761）是一種Fc區(qū)去糖基化的人源性抗CCR4單抗，主要用于治療復(fù)發(fā)/難治性成人T細(xì)胞白血?。?4］。該單抗與效應(yīng)細(xì)胞上的Fcγ受體具有較高的親和力，也有強大的抗體依賴的細(xì)胞毒作用，因此還可以靶向CCR4/CCL22而用于治療Treg細(xì)胞浸潤性腫瘤［15］。一項Ⅰ期臨床試驗采用Mogamulizumab治療肺癌及食管癌患者，其中40%的患者在治療過程中病情穩(wěn)定且生存期延長，即使用最小劑量也能使患者外周血中的Treg細(xì)胞數(shù)量顯著下降，證實了Mogamulizumab對Treg細(xì)胞耗竭的敏感性和高效性［16］。SUN等［17］也發(fā)現(xiàn)，Mogamulizumab能減少頭頸部鱗狀細(xì)胞癌小鼠的浸潤性Treg細(xì)胞數(shù)量，并使IFN-γ、TNF-α和IL-2等細(xì)胞因子表達水平上調(diào)，說明抗CCR4療法不僅能增強機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，還可以抑制頭頸部鱗狀細(xì)胞癌生長。此外，在犬尿路上皮癌研究中發(fā)現(xiàn)，BRAF突變可刺激CCL17高表達并促進CCR4+Treg細(xì)胞向腫瘤組織浸潤，而BRAF抑制劑達拉非尼可減少CCL17的產(chǎn)生，并阻斷Treg細(xì)胞向癌灶募集趨化［18］。

除了CCR4/CCL22和CCR4/CCL17趨化通路外，CCR5/CCL5等趨化通路也在Treg細(xì)胞趨化浸潤中發(fā)揮作用。TAN等［19］報道，在乳腺癌患者及相應(yīng)的小鼠模型中，Treg細(xì)胞高表達CCR5而腫瘤細(xì)胞高表達其配體CCL5，應(yīng)用CCR5抑制劑TAK-779后，Treg細(xì)胞向癌灶的遷移能力明顯受阻，瘤體也顯著縮小。目前，靶向CCR5/CCL5的藥物Maraviroc、Leronlimab已應(yīng)用于乳腺癌和結(jié)腸癌的臨床試驗中，靶向CXCR4的拮抗劑BL-8040也被報道可用于治療胰腺導(dǎo)管癌［20-21］。然而，趨化因子受體-配體軸較復(fù)雜，因此靶向這些通路的藥物的療效仍不確定，其中有可能影響其他淋巴細(xì)胞功能。如有研究報道，Mogamulizumab的過度使用會使Treg細(xì)胞大幅減少而細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞功能失控，導(dǎo)致嚴(yán)重的中毒性表皮壞死松解癥［22］。因此，應(yīng)用趨化通路抑制劑時需要嚴(yán)格掌握用藥時機和劑量。

2.2 靶向胞外分子及通路

2.2.1 靶向CD25 Treg細(xì)胞經(jīng)趨化作用浸潤到TME后，通過一系列機制抑制了抗腫瘤免疫反應(yīng)，其中Treg細(xì)胞表面特異性分子CD25因為可以高親和度結(jié)合IL-2而發(fā)揮重要抑制作用。IL-2是免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞生長因子，能活化Teff細(xì)胞，刺激NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞，促進B細(xì)胞增殖及分泌抗體，甚至還能促進Foxp3表達和Treg細(xì)胞分化。當(dāng)TME中的Treg細(xì)胞通過CD25優(yōu)先結(jié)合有限的IL-2后，其他免疫細(xì)胞則失去了IL-2的正?；罨饔?，從而使抗腫瘤免疫反應(yīng)減弱［23］。因此，今后或可通過藥物阻斷CD25+Treg細(xì)胞與IL-2的結(jié)合作用，從而恢復(fù)正常的抗腫瘤反應(yīng)。目前靶向CD25的藥物主要有兩種，即抗CD25免疫毒素和抗CD25單抗。

抗CD25免疫毒素Denileukin diftitox（DAB-IL-2，Ontak）最早用于治療T細(xì)胞淋巴瘤，但其因?qū)е轮旅暂斞磻?yīng)、毛細(xì)血管滲漏綜合征等而退市。隨后，ROGERS等［24］開發(fā)了一種新型融合蛋白IL2-R336A，其可選擇性靶向結(jié)合CD25，在靶細(xì)胞膜上形成低聚孔并殺死荷瘤小鼠體內(nèi)的Treg細(xì)胞，不僅增強了抗腫瘤免疫反應(yīng)，還可作為抗腫瘤疫苗的佐劑使用，且較Ontak更安全、有效。ONDA等［25］制備了一種新型重組免疫毒素2E4-PE38，也可使乳腺癌、間皮細(xì)胞癌和結(jié)腸癌小鼠的病灶縮小。此外，還有研究證實，第二代靶向CD25的白喉融合毒素s-DAB-IL-2（V6A）能顯著減少黑色素瘤小鼠體內(nèi)的Treg細(xì)胞數(shù)量并抑制腫瘤生長，血管滲漏綜合征發(fā)生率也明顯減少［26］。盡管新型抗CD25免疫毒素在動物實驗中獲得了良好療效，但是其臨床應(yīng)用尚很少見，因此其制備技術(shù)及對人體的用藥安全性仍有待進一步研究。

人源化抗CD25單抗Daclizumab于2016年在歐盟和美國用于治療復(fù)發(fā)性多發(fā)性硬化癥，后因阻斷IL-2/IL-2R信號導(dǎo)致靶向性差且毒副反應(yīng)多而退市。7D4為一種結(jié)合CD25而不阻斷IL-2/IL-2R信號的IgM，經(jīng)其制備的抗CD25抗體RG6292與Daclizumab相比，不僅能同等水平耗竭人源性腫瘤組織內(nèi)的Treg細(xì)胞，而且不影響Teff細(xì)胞的免疫功能，因此認(rèn)為RG6292可作為新一代抗CD25抗體用于靶向Treg細(xì)胞的腫瘤免疫治療［27］。

近紅外光免疫療法是一種利用抗體-光吸收劑復(fù)合物和紅外線的新型免疫療法，具有高度選擇性，短時間內(nèi)即可殺死腫瘤細(xì)胞而不損傷鄰近正常組織。有研究利用靶向CD25的抗體-光吸收劑復(fù)合物成功選擇性地消除了小鼠腫瘤模型中的瘤內(nèi)Treg細(xì)胞［28］，提示該方法或可應(yīng)用于靶向Treg細(xì)胞的腫瘤治療，值得進一步深入研究。

2.2.2 靶向CD39/73 Treg細(xì)胞的胞外核酸酶CD39/73可將ATP轉(zhuǎn)化為腺苷。當(dāng)腺苷與Teff細(xì)胞表面的A2AR腺苷受體結(jié)合后，會激活其胞內(nèi)的腺苷酸環(huán)化酶，上調(diào)cAMP，然后通過下游PKA及EPAC通路使Teff細(xì)胞失活，進而減弱抗腫瘤免疫反應(yīng)［29］。近期開發(fā)的新藥NE-siRNA CD73R可通過關(guān)閉CD73/腺苷通路增強Teff細(xì)胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而明顯抑制大鼠膠質(zhì)瘤的生長［30］。

2.2.3 靶向免疫檢查點 免疫檢查點是指在免疫細(xì)胞上表達并調(diào)節(jié)免疫激活程度的一類共抑制分子，主要抑制過度的異常免疫反應(yīng)，起到“免疫剎車”作用。在TME中，Treg細(xì)胞表面的多種免疫檢查點如CTLA-4可與TME中的抗原提呈細(xì)胞（antigen-presenting cells，APC）相結(jié)合，并負(fù)性調(diào)節(jié)APC的免疫功能，從而間接抑制Teff細(xì)胞的抗腫瘤免疫活性［31］。因此，通過免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）選擇性阻斷Treg細(xì)胞表面的免疫檢查點，可恢復(fù)APC的免疫功能，增強抗腫瘤免疫反應(yīng)。但是免疫檢查點也并非Treg細(xì)胞表面所特有，且目前有關(guān)Treg細(xì)胞上的免疫檢查點靶向治療研究仍有限，因此其靶點及其作用機制仍不明確。

細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4）是Treg細(xì)胞表面非特異性免疫檢查點，在活化的Teff細(xì)胞上也可存在。當(dāng)CTLA-4與APC結(jié)合后，不僅能干擾正常的T細(xì)胞抗原受體（T cell receptor，TCR）信號，還能促使細(xì)胞凋亡，抑制Teff細(xì)胞活性［32］。Ipilimumab是第一個被FDA批準(zhǔn)的靶向CTLA-4的IgG1型抗體，目前已廣泛用于治療晚期黑色素瘤，對非小細(xì)胞肺癌、腎細(xì)胞癌等也有一定療效。Tremelimumab是另一種新型抗CTLA-4的IgG2型抗體，已用于黑色素瘤、結(jié)腸癌、胃癌和間皮瘤的臨床研究中。以上兩種藥物均可有效上調(diào)Teff/Treg比值，促進效應(yīng)性細(xì)胞因子IFN、TNF-α生成，從而殺死腫瘤細(xì)胞［33］。然而，鑒于CTLA-4在Treg細(xì)胞和Teff細(xì)胞表面均有表達，其ICIs的作用位點仍有爭議；但是大量體內(nèi)外研究表明該類抗體在經(jīng)過Fc區(qū)域修飾后具有高度抗體依賴的細(xì)胞毒性作用和細(xì)胞吞噬作用，可選擇性殺傷瘤內(nèi)Treg細(xì)胞并擴增抗原特異性CD8+T細(xì)胞以及提高Teff/Treg比值，從而達到抗腫瘤治療效果［34-36］。近年來，針對CTLA-4的治療方法也在不斷更新。如PAI等［37］開發(fā)了一種新型的條件性抗CTLA-4抗體，該抗體在前列腺癌小鼠模型中發(fā)揮抗CTLA-4作用的同時，還避免了對外周正常組織Treg細(xì)胞的免疫毒性作用，有效減輕了免疫治療的毒副反應(yīng)。KVARNHAMMAR等［38］開發(fā)的靶向CTLA-4和OX40的雙特異性抗體ATOR-1015具有更高的腫瘤特異性，有望成為下一代新型抗CTLA-4藥物。但是值得注意的是，不恰當(dāng)?shù)厥褂肐CIs也會過度破壞體內(nèi)正常組織的Treg細(xì)胞，造成免疫相關(guān)不良事件［39］。

程序性死亡受體PD-1是CD28超家族的一種跨膜免疫抑制蛋白，PD-1可與其配體PD-L1結(jié)合并干擾正常抗腫瘤免疫功能［33］?？筆D-1單抗Nivolumab已于2015年被FDA批準(zhǔn)用于治療不能切除或已經(jīng)轉(zhuǎn)移的黑色素瘤，以及轉(zhuǎn)移性鱗狀非小細(xì)胞肺癌。另一種新型的抗PD-1單抗Pembrolizumab可通過上調(diào)mTOR和MAPK抑制基因激活STAT1通路，增加CD4+初始T細(xì)胞向Th1、Th17分化的數(shù)量，并降低向Treg細(xì)胞分化的數(shù)量，從而減少成熟Treg細(xì)胞的數(shù)目并弱化其免疫抑制功能［40］。

淋巴細(xì)胞活化基因3（lymphocyte activation gene 3，LAG-3）是一種跨膜的CD4相關(guān)蛋白，在活化的Teff細(xì)胞上瞬時表達，而在Treg細(xì)胞上持久高表達，是繼CTLA-4與PD-1之后的另一種新型免疫檢查點。與CTLA-4類似，當(dāng)LAG-3與APC相互作用后，會導(dǎo)致Teff細(xì)胞應(yīng)答下調(diào)，從而減弱抗腫瘤免疫反應(yīng)。IMP321是最早的一類靶向LAG-3的重組融合蛋白，在一項Ⅰ/Ⅱa期臨床研究中，16例黑色素瘤患者接種了含有IMP321的腫瘤疫苗，其中13例患者瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答率有所增高，且所有患者的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答率明顯上升，表明靶向LAG-3可有效增強抗腫瘤免疫反應(yīng)［41］。目前，針對LAG-3的單克隆抗體也不斷被開發(fā)，其中Relatlimab（BMS-986016）是第一個人源性抗LAG-3單克隆抗體，且已被證明與抗PD-1抗體Nivolumab聯(lián)合使用能更加安全有效地治療進展性黑色素瘤［42］。

TIGIT為IG超家族的一類受體，在Teff細(xì)胞、NK細(xì)胞、Treg細(xì)胞上均有表達，并在限制適應(yīng)性和先天性免疫應(yīng)答方面起著重要作用，為近年來發(fā)現(xiàn)的新型免疫檢查點［43］。在一項黑色素瘤與結(jié)腸癌小鼠模型研究中，TIGIT與腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞失活和Treg細(xì)胞激活有關(guān)，且阻斷該受體后腫瘤生長顯著延遲，抗腫瘤活性明顯增強［44］。

2.2.4 靶向共刺激分子 共刺激分子主要表達于Treg細(xì)胞和Teff細(xì)胞表面，根據(jù)結(jié)構(gòu)特征分為免疫球蛋白超家族和腫瘤壞死因子受體超家族（tumor necrosis factor receptor superfamily，TNFRSF）。共刺激分子與其配體結(jié)合后形成的共刺激信號可誘導(dǎo)Treg細(xì)胞凋亡并促進Teff細(xì)胞的產(chǎn)生，因此可以利用相關(guān)激動性藥物增強共刺激信號，從而增強抗腫瘤免疫反應(yīng)［45］。GITR是一類TNFRSF共刺激分子，有研究報道，將一種編碼了鼠源性GITRL的質(zhì)粒通過基因槍注入荷瘤小鼠體內(nèi)后，可觀察到瘤內(nèi)特異性CD8+T細(xì)胞表達了GITR共刺激信號，且該細(xì)胞有效抵抗了Treg細(xì)胞的免疫抑制作用，說明GITR共刺激分子可作為抗腫瘤免疫反應(yīng)的潛在靶點［46］。OX40為另一種TNFRSF共刺激分子，目前已有Ⅰ期臨床試驗表明抗OX40單克隆抗體9B12可使瘤組織內(nèi)Treg細(xì)胞的OX40優(yōu)先上調(diào)，并增強Teff細(xì)胞及B細(xì)胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)，使部分晚期黑色素瘤患者的病情好轉(zhuǎn)［47］。

2.2.5 靶向TGF-β/TGF-βR1 轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β由多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生，其可以誘導(dǎo)Foxp3的穩(wěn)定表達并促進Treg細(xì)胞免疫抑制功能。HOLMGAARD等［48］在乳腺癌小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子β受體1（TGF-βR1）的小分子抑制劑Galunisertib能顯著抑制Treg細(xì)胞的免疫抑制功能，增強抗腫瘤免疫反應(yīng)。STRAUSS等［49］首創(chuàng)的雙功能融合蛋白 M7824（MSB0011359C）則能同時阻斷TGF-β與PD-L1信號，在晚期實體瘤患者中取得了肯定的療效。

2.2.6 靶向VEGF/VEGFR2 腫瘤產(chǎn)生的血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）不僅能促使瘤組織中的血管生成，增加腫瘤細(xì)胞的血供來源，還能以血管內(nèi)皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）依賴的方式誘導(dǎo)Treg細(xì)胞增殖，抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)［50］。Ramucirumab是一種IgG1型抗VEGFR2抗體，有研究顯示靶向阻斷VEGF-VEGFR2信號通路可抑制Treg細(xì)胞并參與抗腫瘤免疫治療［51］。

2.3 靶向胞內(nèi)分子及通路

2.3.1 靶向Foxp3 叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子Foxp3是調(diào)控Treg細(xì)胞生長發(fā)育、生理功能以及維持免疫穩(wěn)態(tài)的特異性分子。然而，F(xiàn)oxp3作為Treg細(xì)胞胞內(nèi)分子，較其他表面分子（CCR4、CD25、CTLA-4）更難標(biāo)記，因此許多研究結(jié)果并不理想。最新研究顯示，一種TCR模擬型單克隆抗體Foxp3-#32可特異性識別Treg細(xì)胞表面的Foxp3衍生表位，通過ADCC作用有效清除卵巢癌腹水中的Treg細(xì)胞，證實TCR模擬型單抗能靶向Foxp3來清除瘤組織內(nèi)的Treg細(xì)胞，達到治療腫瘤的效果［52］。

2.3.2 靶向EZH2 EZH2是一種表達于T細(xì)胞內(nèi)的組蛋白H3K27甲基轉(zhuǎn)移酶，在Treg細(xì)胞激活時被誘導(dǎo)，并與Foxp3形成復(fù)合體來維持Treg細(xì)胞穩(wěn)定和功能。EZH2基因缺失的荷瘤小鼠會表現(xiàn)出更強的抗瘤免疫活性，且EZH2抑制劑CPI-1205能誘導(dǎo)Treg細(xì)胞表型和功能改變，增強Teff細(xì)胞毒性，說明EZH2可作為Treg細(xì)胞免疫治療新靶點［53］。

2.3.3 靶向PI3K PI3K通路可通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞表面受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮重要作用，如刺激T細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子表達、調(diào)控T細(xì)胞增殖、遷移和新陳代謝等［54］。PI3K抑制劑Wortmannin和Akt抑制劑Triciribine比一般的T細(xì)胞能更顯著地抑制人外周血中的Treg細(xì)胞增殖能力，說明Treg細(xì)胞在增殖中更依賴PI3K-Akt信號通路，且PI3K抑制劑可顯著降低荷瘤小鼠Treg細(xì)胞數(shù)量，抑制腫瘤細(xì)胞生長［55］。

3 小結(jié)

Treg細(xì)胞經(jīng)趨化作用進入TME后，在各種胞內(nèi)外分子及信號通路的調(diào)節(jié)下抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)，促使腫瘤生長。通過干預(yù)該過程的各個靶點，減少腫瘤組織中Treg細(xì)胞的浸潤數(shù)目，削弱其免疫抑制功能，從而增強抗腫瘤免疫反應(yīng)，達到靶向治療腫瘤的效果。但是值得注意的是，Treg細(xì)胞是機體內(nèi)維持免疫平衡的重要免疫抑制性細(xì)胞，盲目殺傷耗竭并不可取，因此后續(xù)藥物的開發(fā)仍需要深入研究并尋找瘤內(nèi)Treg細(xì)胞的特異性靶點，以降低毒副反應(yīng)并提高療效，從而讓更多患者獲益。