楊英閣

河南省南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校第一附屬醫(yī)院，河南南陽(yáng) 473052

小兒結(jié)核病是指16歲以下的兒童所患的結(jié)核病，與成人結(jié)核病一樣，也是由結(jié)核分枝桿菌引起，結(jié)核病在小兒呼吸系統(tǒng)疾病中發(fā)病率高達(dá)5%，尤其是在新生兒階段若治療不及時(shí)極易威脅生命安全[1-2]。影響小兒結(jié)核病的因素較多，除了外界環(huán)境的接觸外，機(jī)體本身的易感性也逐漸成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，其中基因多態(tài)性能夠反映出同種人群對(duì)同種疾病的不同患病風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。GATA3-白細(xì)胞介素(IL)-13基因通路被報(bào)道與肺部疾病相關(guān)，包括哮喘、支氣管哮喘等[5-6]，但是關(guān)于該基因通路與結(jié)核病，尤其是小兒結(jié)核病的研究較少。因此，本研究從2個(gè)關(guān)鍵基因GATA3和IL-13入手，重點(diǎn)分析其單核苷酸多態(tài)性(SNP)與小兒結(jié)核病易感性的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機(jī)選取2019年12月至2020年12月于本院診治的根據(jù)2017年版《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)肺結(jié)核診斷》標(biāo)準(zhǔn)，痰培養(yǎng)抗酸桿菌陽(yáng)性并結(jié)合影像學(xué)確診為肺結(jié)核的414例小兒結(jié)核病患兒作為觀察組，另選取456例同期來(lái)本院診治的無(wú)肺結(jié)核感染的上呼吸道感染患兒作為對(duì)照組。觀察組中，男242例，女172例；年齡1～14歲；平均體質(zhì)量(33.21±13.21)kg；血壓正常406例；血糖正常410例；發(fā)熱411例。對(duì)照組中，男264例，女192例；年齡1～14歲；平均體質(zhì)量(34.32±14.44)kg；血壓正常432例；血糖正常455例；發(fā)熱446例。所有患兒及家屬均了解本研究的情況，并在知情同意書(shū)簽字。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。兩組性別、年齡、體質(zhì)量等比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1基因組DNA的提取 用含乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)的抗凝管采集每例患兒5 mL全血。使用Omega Mag-Binds Forensic DNA Kit 試劑盒(美國(guó)Omega公司，生產(chǎn)批號(hào)：20101109)提取血液的基因組DNA，完成后用ND2000型nanodrop(美國(guó)Thermo Fisher公司)測(cè)定DNA的濃度和純度，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型 使用Oligo6.0設(shè)計(jì)SNP位點(diǎn)處的引物序列及其Taqman探針序列，見(jiàn)表1，引物合成由上海生工生物公司完成。將1 μL的DNA溶液和配制好的1.2 μL引物溶液(包括上、下游引物，探針引物各0.4 μL)加入到預(yù)先配制好的17.8 μL的TransStart Probe qPCR SuperMix(北京全式金生物公司)中，輕微振蕩混勻，放入bio-rad CFX96熒光定量PCR儀中，反應(yīng)條件為94 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果由儀器自帶軟件生成。每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔，陰性對(duì)照使用焦碳酸二乙酯(DEPC)水，陽(yáng)性對(duì)照使用含有該序列的陽(yáng)性質(zhì)粒(由上海生工生物公司合成)?；蛐偷呐卸ǎ嚎拷麱AM橫坐標(biāo)為野生純合型，靠近VIC縱坐標(biāo)為突變純合性，位于靠近45°線的位置為雜合型。

表1 SNP引物序列

1.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清中IL-13水平 取觀察組患兒的血清約1 mL，向96孔板中滴加標(biāo)準(zhǔn)品。樣品孔中加入樣品，每個(gè)樣品3個(gè)復(fù)孔?；靹?，用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min，小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外，混勻，用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min后每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。以空白空調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度。

2 結(jié) 果

2.1GATA3基因rs422628位點(diǎn)和IL-13基因rs20541位點(diǎn)的基因分型結(jié)果及其分布頻率 所有待測(cè)的患兒均得到了明確的基因分型結(jié)果，見(jiàn)圖1。在研究人群中，觀察組GATA3基因的rs422628位點(diǎn)TT、TC和CC 3種基因型頻率與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；觀察組IL-13基因的rs20541位點(diǎn)GG和GA兩種基因型頻率與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但是AA基因型頻率與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。

表2 基因分型的頻率分布

注：A為rs422628位點(diǎn)的基因分型結(jié)果，方形圖示為T(mén)T基因型，圓形圖示為CC基因型，三角形圖示為CT基因型；B為rs20541位點(diǎn)的分型結(jié)果，圓形圖示為GG基因型，方形圖示為AA基因型，三角形圖示為AG基因型。

2.2rs422628位點(diǎn)不同模型分析小兒結(jié)核病的患病風(fēng)險(xiǎn) 顯性模型(TC+CC/TT)的OR值為1.100(P=0.950)，隱性模型(CC/TT+TC)的OR值為1.210(P=0.757)，超顯性模型中(TT+CC/TC)的OR值為0.981(P=0.920)。見(jiàn)表3。

表3 rs422628位點(diǎn)不同遺傳模型分析小兒結(jié)核病的患病風(fēng)險(xiǎn)

2.3rs20541位點(diǎn)不同模型分析小兒結(jié)核病的患病風(fēng)險(xiǎn) 顯性模型(AG+AA/GG)的OR值為1.746，P=(0.057)，隱性模型(AA/GG+AG)的OR值為3.349(P=0.008)，超顯性模型(GG+AA/AG)的OR值為1.018(P=0.944)，見(jiàn)表4。

表4 rs20541位點(diǎn)不同遺傳模型分析小兒結(jié)核病的患病風(fēng)險(xiǎn)

2.4rs422628和rs20541位點(diǎn)聯(lián)合作用與小兒結(jié)核病患病的關(guān)系 2個(gè)SNP位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生純合突變的攜帶CC基因型和AA基因型的兒童，觀察組有19例，占4.6%，對(duì)照組有1例，占0.2%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.043)，與未突變的野生純合型(TT+GG)比較OR值為28.500。見(jiàn)表5。

表5 rs422628 和rs20541位點(diǎn)聯(lián)合作用基因型的頻率分布及其OR值

2.5觀察組和對(duì)照組IL-13水平比較 觀察組血清IL-13水平高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.6不同IL-13基因分型患兒IL-13水平比較 攜帶AA基因型患兒的血清IL-13水平高于攜帶AG和GG基因型患兒(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

注：與AA基因型比較，**P<0.05。

3 討 論

小兒結(jié)核病是由外界結(jié)核分枝桿菌入侵體內(nèi)造成的，既與外界的環(huán)境因素有關(guān)，也與自身體質(zhì)和免疫力相關(guān)[7-8]。目前，關(guān)于免疫力的提高，除了養(yǎng)成良好的生活習(xí)慣和飲食補(bǔ)充身體必需微量元素外，并無(wú)實(shí)質(zhì)性的有效措施。對(duì)于16歲以下的兒童，免疫力較差，容易受到外界細(xì)菌和病毒的侵入，因此，小兒結(jié)核病與兒童的免疫力是直接相關(guān)的[9-10]。影響免疫力的因素也有很多，目前受學(xué)者廣泛關(guān)注的是免疫因子信號(hào)傳遞通路的相關(guān)研究，免疫因子是免疫系統(tǒng)的直接信使，它們可以通過(guò)刺激或激活免疫細(xì)胞的活性來(lái)殺滅體內(nèi)入侵的病毒和細(xì)菌[11-12]。

GATA3屬于鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)胸腺的發(fā)育和T細(xì)胞的分化有促進(jìn)作用，rs422628位點(diǎn)是GATA3基因上的SNP突變位點(diǎn)，位于內(nèi)含子區(qū)域，該位點(diǎn)的突變能夠影響GATA3的轉(zhuǎn)錄，從而影響其下游信號(hào)分子的表達(dá)，使T細(xì)胞的發(fā)育受到影響[13-14]。有研究表明，GATA-3在哮喘大鼠肺組織中的表達(dá)較高，通過(guò)抑制GATA-3的表達(dá)可減輕新生兒細(xì)菌性呼吸道炎癥反應(yīng)[15]。但是本研究發(fā)現(xiàn)，在小兒結(jié)核病的易感性方面，觀察組rs422628位點(diǎn)TT、TC和CC3種基因型頻率與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，顯性、隱性和超顯性3種遺傳模型分析差異也均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明GATA3基因rs422628位點(diǎn)多態(tài)性與小兒結(jié)核病易感性的關(guān)聯(lián)不強(qiáng)。IL-13主要是由活化的T輔助細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞等細(xì)胞分泌，有相關(guān)研究表明，IL-13與支氣管哮喘、肺間質(zhì)纖維化和急性肺損傷均有密切的關(guān)系[16-17]。IL-13可以阻斷腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的激活蛋白-1和核因子κB激活，抑制相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，降低炎癥因子對(duì)細(xì)胞的損傷[18]。此外，IL-13還可以促進(jìn)B細(xì)胞的增殖和分化，以及分泌免疫球蛋白[19]。rs20541位點(diǎn)位于IL-13基因的編碼區(qū)，其突變可導(dǎo)致氨基酸由谷氨酰胺變?yōu)榫彼?，使IL-13基因的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而影響免疫功能[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，攜帶AA基因型的兒童屬于小兒結(jié)核病的易感人群，隱性模型的OR值為3.349(P=0.008)，提示該類(lèi)兒童患病風(fēng)險(xiǎn)較高，且攜帶AA基因型兒童抵抗結(jié)核分枝桿菌病原入侵的免疫力較差。本研究進(jìn)一步分析了rs422628與rs20541位點(diǎn)聯(lián)合作用與小兒結(jié)核病患病的關(guān)系，結(jié)果顯示，雖然rs422628位點(diǎn)單獨(dú)分析時(shí)與小兒結(jié)核病的易感性并無(wú)關(guān)聯(lián)，但是若rs422628位點(diǎn)純合突變型CC基因型與rs20541位點(diǎn)AA基因型同時(shí)存在，其OR值高達(dá)28.500(P=0.043)，表明GATA3基因rs422628位點(diǎn)純合型突變能夠在易感性方面起到輔助的促進(jìn)作用，間接影響機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的抵抗能力。目前常見(jiàn)成人結(jié)核病易感人群血液IL-13水平升高的報(bào)道，鑒于IL-13基因與結(jié)核病有較高的易感性關(guān)系，本研究進(jìn)一步分析了血清IL-13水平與IL-13基因rs20541位點(diǎn)各基因型的關(guān)系，結(jié)果顯示，觀察組攜帶AA基因型的患兒血清IL-13水平高于攜帶AG和GG基因型患兒，進(jìn)一步證實(shí)IL-13基因rs20541位點(diǎn)AA基因型患兒的炎癥反應(yīng)程度更高。

綜上所述，攜帶IL-13基因rs20541位點(diǎn)AA基因型的兒童對(duì)小兒結(jié)核病的易感性較高，患病風(fēng)險(xiǎn)較大。但是，SNP位點(diǎn)可能因?yàn)槿朔N和樣本量的不同存在結(jié)果差異和多樣化。因此，如果可以獲得更大樣本量和不同民族、種族的細(xì)致劃分，會(huì)使研究結(jié)果更有說(shuō)服力。