黃明輝，張 景，湯玲玲，胡 鈺

目前，心血管疾病是人類首要致死原因之一，但其發(fā)病機制仍未完全明確。心肌細胞、內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞和心肌成纖維細胞死亡和新生的平衡維持著心血管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及功能。細胞死亡和非感染性炎癥反應在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[1]?；谛螒B(tài)特征變化，細胞死亡主要包括凋亡、自噬性細胞死亡和壞死。凋亡是一種程序性細胞死亡，細胞出現(xiàn)DNA斷裂、染色體聚集、細胞收縮、胞膜空泡化、形成凋亡小體但質(zhì)膜仍保持完整，此外未發(fā)生炎癥反應，自噬性細胞死亡與自噬過程密切相關，自噬發(fā)生時，胞質(zhì)內(nèi)容物被自噬體吞噬降解，而在病理條件下，自噬失調(diào)，發(fā)生率增加10倍以上導致細胞死亡；壞死是一種受調(diào)控的細胞死亡方式，細胞和細胞器發(fā)生腫脹，最終細胞膜破裂，染色質(zhì)輕度濃縮但細胞核保持完整[1]。

焦亡是一種促炎性的程序性細胞壞死，細胞形態(tài)變化結(jié)合了凋亡和壞死的特征，細胞質(zhì)膜上形成膜孔，細胞腫脹迅速破裂，釋放前炎性因子和細胞內(nèi)容物[2]。研究發(fā)現(xiàn)，焦亡及其相關的炎性因子在血管炎癥反應和心血管疾病進程中發(fā)揮著重要作用[2]。本研究將焦亡相關分子通路及其在心血管疾病中的作用研究進展進行綜述。

1 焦亡及其通路

焦亡由微生物感染或損傷等細胞內(nèi)外相關信號誘導半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-1、Caspase-11、Caspase-4、Caspase-5，進而釋放促炎因子[白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-18(IL-18)]，使細胞膜完整性被破壞。焦亡主要包括依賴Caspase-1的經(jīng)典途徑和依賴Caspase-4/5(人)及Caspase-11(小鼠)的非經(jīng)典途徑[3]。在經(jīng)典途徑中包括NOD樣受體(NOD like receptor proteins，NLRPs)NLRP3、黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)和熱蛋白(pyrin)等炎性小體。炎性小體通過病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)、危險信號分子模式(danger-associated molecular patterns，DAMPs)活化后募集凋亡相關斑點樣蛋白[apoptosis-associated speck-like protein containing a Caspase activation and recruitment domain(CARD)，ASC]和pro-Caspase-1。CARD與pro-Caspase-1相互作用啟動自我剪切形成活化的Caspase-1；此外活化的Caspase-1將IL-1β和IL-18前體分子轉(zhuǎn)化為成熟的炎癥分子。活化的Caspase-1剪切GSDMD(gasdermin 蛋白家族成員)和31 kD GSDMD-N寡聚體釋放出GSDMD-N，釋放出的GSDMD-N在胞膜上形成孔洞，進而促進炎性因子的釋放和細胞腫脹，引發(fā)焦亡。在非經(jīng)典途徑中，小鼠細胞的Caspase-11或人細胞的Caspase-4/5識別脂多糖(LPS)后直接剪切GSDMD啟動焦亡；同時，GSDMD-N激活NLRP3炎性小體，Caspase-1活化IL-1β和IL-18。

此外，GSDME可以將腫瘤壞死因子-α(TNF-α)或化療藥物引起的Caspase-3介導的凋亡轉(zhuǎn)化為焦亡。Caspase-3剪切GSDME產(chǎn)生GSDME-N引起膜穿孔誘導焦亡[4]。在硬骨魚中僅存在GSDME，其被Caspase-1、3、7剪切后誘導焦亡[5]。耶爾森菌屬中的細菌毒力因子YopJ抑制Tak1激酶后誘導了Caspase-8依賴的GSDMD剪切而引起細胞焦亡[6]。此外，激活Caspase-8觸發(fā)了NLPR3炎癥小體，Caspase-8和Caspase-11放大了炎癥反應[7-8]。所以，Caspase-3/GSDME和Caspase-8/GSDMD通路可能也是焦亡相關通路。

2 焦亡執(zhí)行者：gasdermin蛋白家族(GSDMs)

GSDM是細胞焦亡的主要執(zhí)行者。在人類中存在6種GSDMs成員：GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME和DFNB59，在小鼠中沒有GSDMB，存在3種GSDMA同源蛋白(GSDMA1-3)和4種GSDMC同源蛋白(GSDMC1-4)；GSDMs(除DFNB59外)均含有高度保守的N-末端和C-末端；GSDMD是首個鑒定出的焦亡經(jīng)典和非經(jīng)典的直接執(zhí)行者[9-10]。完整的GSDMD沒有生物活性，Caspase-1和Caspase-11/4/5特異性剪切GSDMD，將N-末端從具有自我抑制作用的C-末端釋放出，GSDMD-N具有與脂質(zhì)結(jié)合和成孔的能力，當招募至胞膜后，導致膜離子通道形成，細胞滲透性腫脹，最終細胞膜破裂并伴隨大量炎性因子釋放，此外，GSDME也是一個焦亡執(zhí)行者，其可以被Caspase-3特異性剪切[11-12]。

3 焦亡在心血管疾病中的作用

心血管疾病發(fā)生率和致死率極高。焦亡通過介導炎癥反應和細胞死亡，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。焦亡相關的分子亦影響著心血管疾病的進程和結(jié)果。

3.1 動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS) AS是一種脂質(zhì)在主動脈沉積形成斑塊，阻礙血液流動的慢性進行性疾病。AS涉及內(nèi)皮細胞功能失衡、低密度脂蛋白(LDL)積聚和氧化、單核細胞和淋巴細胞募集、平滑肌細胞遷移和增殖、炎性因子激活、血小板聚集。在這些過程中炎癥反應發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，焦亡通過炎性因子及對斑塊形成的影響而影響著AS的發(fā)生和進程。Salidroside通過抑制Caspase-1的激活、IL-1β的釋放、降低GSDMD的表達，進而抑制內(nèi)皮細胞的焦亡，減少動脈粥樣斑塊的形成[13]。研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎性小體在內(nèi)皮細胞和巨噬細胞的激活影響AS，尼古丁可以導致高脂飲食的ApoE-/-小鼠形成更大的AS斑塊，但沉默NLRP3或凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)后，尼古丁誘導的主動脈內(nèi)皮細胞Caspase-1的激活、IL-18和IL-1β的生成及凋亡被抑制[14]。成纖維細胞生長因子21亦通過抑制NLRP3炎癥小體減輕焦亡而改善AS[15]。氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導的人巨噬細胞死亡在AS形成不穩(wěn)定斑塊中發(fā)揮著重要作用，沉默巨噬細胞線粒體膜外蛋白NIX后，Caspase-1激活、IL-1β表達上調(diào)、NLRP3增加，NIX可以抑制ox-LDL誘導的巨噬細胞凋亡而改善AS[16]。但是也有研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3對AS的進程無影響。敲除NLRP3的高脂飲食ApoE-/-小鼠AS模型的AS進程、巨噬細胞對斑塊的浸潤和斑塊的穩(wěn)定并沒受到影響[17]。

3.2 缺血性心臟病 心肌梗死(myocardial infarction，MI)主要是由于冠狀動脈的急性閉塞，長時間缺血導致心肌細胞死亡。這涉及如凋亡、壞死及嚴重的炎癥反應。研究發(fā)現(xiàn)，焦亡及其相關因子在心肌細胞、心臟成纖維細胞和巨噬細胞的變化影響著MI。NLPR3炎癥小體在心臟缺血再灌注損傷后的形成中分成兩步：首先NLPR3炎性小體的組分表達增加；在急性心肌梗死(AMI)發(fā)生后6～24 h NLRP3炎癥小體逐漸增加，介導AMI的后期損傷；再灌注發(fā)生后立即或1 h使用NLPR3抑制劑能夠降低梗死面積，在3 h時使用無此效果[18]。AMI病人及大鼠的中性粒細胞NLRP3凋亡小體、Casapse-1激活，釋放IL-1β，進而導致心肌細胞和心臟成纖維細胞的IL-1R表達上調(diào)，加重炎癥反應，最終心肌細胞凋亡及纖維化[19]。血中高水平髓系細胞觸發(fā)受體-1(myeloid cells trigger receptors 1，TREM-1)，低水平sirtuin 6(Sirt6)增加了AMI病人2年隨訪的死亡率和不良心血管事件的發(fā)生，這與抑制Sirt6誘導的凋亡后導致TREM-1介導的血管內(nèi)皮細胞焦亡相關[20]。

氧化應激在AMI后的心肌細胞死亡中也發(fā)揮著重要作用，研究發(fā)現(xiàn)，焦亡和氧化應激通過核因子-κB(NF-κB)共同影響著心肌細胞的死亡。NF-κB是GSDMD的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。缺血缺氧條件下，通過N-acetyl-cysteine抑制氧化應激后，心肌細胞的NF-κB、GSDMD和NLRP3炎性小體的激活及焦亡受到抑制，此外，使用pyrrolidine dithiocarbamate抑制NF-κB后降低了GSDMD的轉(zhuǎn)錄和激活，繼而抑制了NLRP3炎性小體介導的心肌細胞焦亡[21]。這說明NF-κB/GSDMD軸作為橋梁影響著氧化應激和NLRP3凋亡小體介導的焦亡。但在巨噬細胞中NF-κB直接介導NLRP3的表達[22]。

3.3 糖尿病性心肌病(diabetic cardiomopathy，DCM) DCM與心臟的慢性炎癥緊密相關，最終導致心力衰竭。在此過程中，心臟出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的異常，如心肌細胞功能失調(diào)、死亡，心肌成纖維化，左心室功能紊亂，代謝失調(diào)。高糖引起的炎癥級聯(lián)反應和氧化應激反應在糖尿病并發(fā)癥中發(fā)揮著重要作用。NLRP3是DCM的一個生物標志物，沉默NLRP3減輕了2型糖尿病大鼠DCM的進程[23]。ELAV-like protein 1(ELAVL1)在炎癥反應和心力衰竭中扮演著重要角色，糖尿病病人心臟和高糖處理的心肌細胞ELAVL1表達明顯上調(diào)；同時Caspase-1、IL-1β也顯著上調(diào)，敲除ELAVL1或通過miR-9靶向抑制其表達后NLRP3、Caspase-1和IL-1β表達下調(diào)，抑制了TNF-α介導的經(jīng)典途徑凋亡[24]。抑制活性氧后，高糖處理的心肌細胞黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)表達下調(diào)；或沉默AIM2后，ASC、GSDMD-N、Caspase-3和IL-1β表達下調(diào)而減輕心肌細胞焦亡，改善代謝紊亂、心室重構(gòu)導致的心臟功能紊亂[25]。

非編碼RNA包括miRNAs、LncRNAs和circRNAs，在疾病的進程中具有重要作用。miR-30d在鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠心臟和高糖處理的心肌細胞中上調(diào)，抑制Forkhead box O3(Foxo3a)導致凋亡抑制因子表達降低、Caspase-1激活、IL-1β和IL-18增加，促進心肌細胞焦亡[26]，而miR-9具有抑制心肌細胞焦亡的作用[24]。Yang等[27]發(fā)現(xiàn)LncRNA KCNQ1OT1在糖尿病小鼠左心室及高糖處理的心肌成纖維細胞中表達升高，KCNQ1OT1促進GSDMD剪切、IL-1β釋放，下調(diào)KCNQ1OT1通過miR-214-3p/Caspase-1/TGF-β1通路改善了心肌細胞焦亡和纖維化。Caspase-1 associated circRNA(CACR)亦通過miR-214-3p/Caspase-1通路調(diào)節(jié)高糖致心肌細胞焦亡[28]。

3.4 其他心血管疾病 尿毒癥性心肌病是慢性腎衰竭的主要并發(fā)癥之一，約50%慢性腎臟疾病病人出現(xiàn)該癥狀，心臟出現(xiàn)肥大、纖維化、炎癥和代謝重構(gòu)[29]。尿毒癥小鼠模型心臟浸潤的巨噬細胞釋放含有miR-155的外泌體被心肌細胞吸收后，釋放出的miR-155靶向Foxo3a促進了心肌細胞的凋亡及其他變化[29]。多種刺激可以導致心臟形成生理性或病理性心臟肥大。最初的肥大是適應壓力過載，但持續(xù)性的壓力最終導致心力衰竭。體內(nèi)外心臟肥大模型Caspase-1和IL-1β表達量均上調(diào)，抑制Caspase-1可以降低血管緊張素Ⅱ誘導心肌肥大的作用[30]。

4 靶向焦亡相關分子的心血管疾病治療藥物

4.1 NLRP3炎性小體抑制劑 秋水仙堿是治療痛風的常用藥物。研究發(fā)現(xiàn)，其通過抑制NLRP3炎性小體而抑制炎癥，急性冠脈綜合征病人服用秋水仙堿后，單核細胞Caspase-1表達下調(diào)，抑制了IL-1β的分泌[31]。另一項研究中，與2 379例安慰劑組AMI病人相比，2 366例AMI病人經(jīng)過中位數(shù)22.6個月低劑量秋水仙堿治療后，復發(fā)缺血性事件顯著降低[32]。但非ST段抬高型AMI病人使用秋水仙堿后炎癥反應和梗死面積并未改善[33]。

Dapansutrile是特異性NLRP3炎性小體抑制劑，其可縮小小鼠心臟梗死面積和抑制左心室收縮功能障礙[34]。

體外研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀通過抑制NLRP3炎性小體發(fā)揮抗炎作用[35]。冠狀動脈疾病病人使用阿托伐他汀8個月后，其NLRP3炎性小體和IL-1β、IL-18表達顯著下調(diào)[36]。他汀類藥物可能對冠狀動脈疾病內(nèi)皮細胞功能障礙具有改善作用。

4.2 IL-1β抑制劑 阿那白滯素是一種重組IL-1受體拮抗劑，抑制IL-1α和IL-1β的激活，被批準用于治療由于NLRP3炎性小體異常激活、IL-1β上調(diào)而發(fā)生的Cryopyrin蛋白相關周期性綜合征(cryopyrin-associated period syndromes，CAPS)。Ⅱ期臨床試驗表明阿那白滯素能改善ST段抬高型AMI病人和射血分數(shù)降低型心力衰竭病人病情，并成為治療復發(fā)性心包炎的二線用藥[37]。

卡那單抗是作用于IL-1β，但對IL-1α無作用的人源化單克隆抗體，亦被批準治療CAPS，在長達 6 年并且有10 061例AMI病人參與的Canakinumab Anti-inflammatory Thrombosis Outcomes Study研究數(shù)據(jù)證明，心血管相關的死亡率降低15%，但并未被批準用于治療心血管疾病[38]。

利納西普是一種可溶性IL-1受體誘捕拮抗劑，與IL-1β結(jié)合力極強而抑制其活性，也是CAPS治療藥物。臨床試驗發(fā)現(xiàn)，利納西普可降低AS病人血液C-反應蛋白(CRP)水平，減輕炎癥，改善血管功能，Ⅱ期臨床試驗顯示出對復發(fā)性心包炎良好的治療效果，Ⅲ期試驗正在進行中[39]。

5 小 結(jié)

NLRP3炎性小體介導的焦亡在心血管疾病中廣泛研究，其參與了心肌細胞、心肌成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞、巨噬細胞等細胞的焦亡和炎癥反應。抑制炎癥反應對心血管疾病的疾病進程具有臨床受益。數(shù)種NLRP3炎性小體抑制劑的效果已經(jīng)通過體內(nèi)外試驗驗證，但是該靶點的藥物目前并未上市，其臨床效果仍需臨床試驗進一步觀察。焦亡通路中的其他分子如Caspase-1、IL-1、IL-1β也可能是治療心血管疾病的重要靶點，大規(guī)模的臨床試驗已經(jīng)證實IL-1β的臨床受益。但是大部分焦亡相關抑制劑在人體中的作用并不明確。因此，仍需進一步探究焦亡的機制及其對心血管疾病進程的影響，發(fā)現(xiàn)更多的靶點和治療藥物。