□ 傅婧潔

（海南師范大學，海南 ?？?571158）

作為一項全球化產(chǎn)業(yè)，食用菌具有巨大的經(jīng)濟價值，現(xiàn)代分子生物學技術的發(fā)展更是為食用菌發(fā)展提供了必要的支持。分子生物技術作為一門研究分析生物生命結構的技術門類，不僅促進了生物醫(yī)學研究的發(fā)展，更為食用菌的分析與應用提供了技術保障。國外學者Devries在1972年最早分離除了裂褶菌，自此，分子生物學技術被廣泛應用于食用菌領域。傳統(tǒng)食用菌多采用的是自然選育、雜交育種，無法滿足人們對食用菌產(chǎn)量及質(zhì)量的需求。分子生物技術的應用機制建立在生物科學之上，其主要通過蛋白質(zhì)、核酸在分子水平上的研究分析，幫助研究者充分掌握住被研究目標的生物性質(zhì)、分子構成。尤其是近年來我國食用菌產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，分子生物技術中的DNA分子標記、分子轉化、基因克隆三種技術方法被人們廣泛關注。通過DNA分子標記、分子轉化、基因克隆三種分子生物技術在食用菌中的研究應用，能夠為食用菌的高效育種、繁殖、生產(chǎn)等開拓出更廣闊的的前景。文章以DNA分子標記、分子轉化、基因克隆三種技術方法為例，提出分子生物技術在食用菌研究中的使用途徑與機制，從而彰顯出分子生物技術在食用菌研究中的價值作用。

一、分子生物技術的相關概述

分子生物技術是分子生物學范疇下的主要實驗方法之一。而分子生物學（molecularbiology）是生物學中的一個重要的分支，是研究細胞不同系統(tǒng)中生物分子之間生物活性的分子基礎，如DNA、RNA、蛋白質(zhì)之間的相互作用與生物合成。分子生物學是生物學中的一個大門類，分子生物學下又涵蓋了多種分子生物學技術，如常見的分子克隆技術、聚合酶鏈式反應技術、凝膠電泳技術、高分子印記和探針技術等等。分子生物技術是在分子水平上通過對蛋白質(zhì)和核酸的研究，獲得研究對象的性質(zhì)，并利用其性質(zhì)在分子結構水平上進行操作，實現(xiàn)人們對生物學的改造的一種技術方式。分子生物學技術的理論基礎來源于PCR（序列互補）和酶切（識別酶切特定序列），主要的分子生物技術有已知序列的基因合成、未知序列的全基因的合成、southern雜交、northern雜交等技術。分子生物技術主要用于重組蛋白的生產(chǎn)、基因改造物種、基因治療、基因改造及刑事案件的斷定、環(huán)境保護等等。

二、食用菌研究應用中常用的分子生物技術類型

（一）DNA分子標記

DNA分子標記是分子生物技術中的主要技術種類之一，其主要研究生命物的分子構成與DNA組成序列。從DNA分子標記的基本機制上分析，分子標記的概念本身可以分為廣義、狹義兩種說法。其中，廣義上的分子標記主要是指可遺傳和可檢測的DNA序列或蛋白質(zhì)。而狹義上的分子標記是主要是指能夠反映單個生物或種群基因組某些差異的特定DNA片段。DNA分子標記的應用形式與標準體現(xiàn)為：限制性片段長度的多態(tài)性；分子檢測表現(xiàn)的共顯性；數(shù)目可變串聯(lián)重復多態(tài)性等等。其中，RAPD、RFLP、SCAR、AFLP等分子標記技術被廣泛應用于食用菌的檢測、實驗、研究之中，通過對食用菌中的分子組成及化學物質(zhì)提取，有效探測到生物體中的DNA序列。

（二）分子轉化

分子轉化作為分子生物技術的主要手段之一，其在食用菌研究中的使用，關鍵在于對食用菌的化學物質(zhì)元素的轉換與構建，通過相應的化學技術手段及生物提取物，對食用菌中的化學物質(zhì)進行提取與檢測，從而獲取研究所需的標志物，將檢測出的標志物以相應的檢測技術進行重復檢測分析，從而得到生物體的化學檢測結果，為食用菌的培育、種植、生產(chǎn)及食用、藥用等提供化學物質(zhì)基礎。目前，隨著我國對食用菌的廣泛研究與種植，分子轉化已經(jīng)成為食用菌研究、培育、化學物質(zhì)檢測等重要的技術手段之一，成為了基因工程、微生物遺傳、分子遺傳等研究領域的基本實驗技術。食用菌的分子生物學研究之中，分子轉化往往分為啟動子、篩選標記、PEG法、電激發(fā)、限制性內(nèi)切酶介導整合法等技術種類。

（三）基因克隆

基因克隆是20世紀70年代發(fā)展起來的一項具有革命性的研究技術，其技術內(nèi)容上可分為五大要素，即分、切、連、轉、選。其主要目的是對生物體中的基因制取與無性繁殖，即將生物體中的器官、細胞、組織等以人工合成的方式提取出基因，然后克隆或拼接到另一個生物體目標上，從而實現(xiàn)生物體復制的目的?；蚩寺〉谋举|(zhì)目的是通過基因的復制進行無性繁殖，從而將一個生命體的優(yōu)秀基因復制或轉移到另一個生命體上，實現(xiàn)優(yōu)秀延伸拓展的目的。野生菌界本身有不少的菌類能夠進行自主的無性繁殖，他們先天具備了克隆能力。而以食用菌為例，采用基因克隆技術將野生菌中的化學物質(zhì)提取出來，然后與其它菌類進行基因重組，從而實現(xiàn)食用菌基因性質(zhì)上的互補，可更好地提高食用菌的產(chǎn)量、育種效果、經(jīng)濟價值。

三、各類分子生物技術在食用菌研究中的應用方法

（一）DNA分子標記：科學選取菌種樣品，分子標記結合鑒定

DNA分子標記能夠?qū)ξ锓N個體差異性予以反映，具有遺傳性，能夠?qū)NA序列及蛋白質(zhì)予以監(jiān)測。目前，在食用菌中常用的DNA分子標記技術主要包括RAPD技術、SCAR、RFLP技術，目前DNA在食用菌中的應用技術已經(jīng)趨于成熟，關于食用菌遺傳多樣性、雜交子鑒定及菌株鑒別方面的報道較多。DNA分子標記技術在食用菌研究中的使用，無論是對食用菌DNA的水平遺傳變異性質(zhì)研究，還是對食用菌的種群鑒定及優(yōu)良品種選育都具有十分重要的意義。例如：以銀耳的菌屬分子鑒定，在鑒定的過程中，需要應用到DNA分子標記技術方式的應用。首先，可采用常規(guī)PCR的分子標記技術，將銀耳的基因寡核苷酸點樣放置在芯片表面，確保實驗材料的完整、有效。然后，對菌種樣品進行處理，確保處理后的樣品還能夠滿足檢測的實際需求。其次，對經(jīng)過處理后的菌種進行核算擴增，并對菌種樣品的核算進行有效提取，然后借助熒光素做好相應的標記。并將芯片上的寡核苷酸點樣與處理好的菌種樣品進行雜交，再通過分析樣品熒光分析模式和掃描儀定量，實現(xiàn)對菌種分子性質(zhì)的化學分析。同時，目前隨著DNA條形碼鑒定技術的發(fā)展，也可采用該模式進行銀耳的DNA特征提取與分析，如采用RFLP分子標記技術，對銀耳的化學物質(zhì)元素進行標記鑒定，由于該技術方式可廣泛適用于種內(nèi)與種間遺傳變異的鑒定，因此，其本身具備了標記覆蓋性強、檢測結果穩(wěn)定的優(yōu)點。目前在食用菌核酸研究領域常用方法為熒光定量PCR、Southern等，主要被用于食用菌的質(zhì)量評價與監(jiān)督、生產(chǎn)質(zhì)量控制。近年來新發(fā)現(xiàn)的ncRNA，其屬于具有特定功能的RNA小分子，具備轉錄功能，但對食用菌無編碼。通過DNA分子標記技術的使用，幫助研究者有效明確食用菌的化學物質(zhì)構建及其規(guī)律，為食用菌的化學提取與種根培育提供技術基礎。

（二）分子轉化：注重菌根化學物質(zhì)提取，分子轉化結合物理鑒定

分子轉化技術是分子生物學中的重要技術方式之一，其目的就是將外源的DNA分子引入受體細胞之上，并通過化學檢驗與化學物質(zhì)轉換的方式使生物體獲取新的遺傳性狀的一種技術方式。分子生物技術在塊菌中的研究應用，主要是方便研究者更深一步探究出塊菌的化學物質(zhì)組成及特性，從而全面掌握到塊菌的繁殖與生長機制，為塊菌的培育、種植提供資料支撐。例如以塊菌為例，塊菌也稱松露，是一種食用價值極高的食用菌類，素來有“黑色金剛石”之稱。首先，分子生物技術在塊菌中的使用，尤為注重塊菌的化學物質(zhì)分子的轉化，為了最大程度上確保分子生物技術分析的有效性及研究結果客觀性，研究者可以選取我國雷公山自然保護區(qū)的塊菌，該地區(qū)的塊菌常年生長在野生環(huán)境中，能夠最大程度保證塊菌的化學物質(zhì)穩(wěn)定、原始、純粹。其次，對塊菌的化學物質(zhì)組成鑒定及其分子構成的研究中，可使用PCR擴增的方式進行，即將保存于CTAB緩沖液中的塊菌菌根挑取2～3個根尖，然后采用CTAB法提取根尖中的DNA。其中，PCR技術即聚合酶鏈式反應技術，PCR技術主要是通過運用變性以及復性的原理，在特定的引物的引導下，使得DNA序列在規(guī)定時間內(nèi)進行大量的復制，所形成的DNA序列會在短時內(nèi)進行快速、大量的擴增。然后，再使用其它檢測技術與方法就可以及時得到食用菌化學物質(zhì)組檢測結果。最后，研究者在保證實驗環(huán)境符合標準的情況下，將提取出的總DNA以ITSIF、ITS4為引物進行PCR。進行PCR后得到凝膠電泳檢測標志物，將標志物以系統(tǒng)發(fā)育分析的技術方法進行檢驗分析，從而得到塊菌的化學分子構成規(guī)律及菌類分類地位。電激法是分子轉化常用方法，其利用高壓脈沖作用，將外源DNA攝入原生質(zhì)體膜，經(jīng)過一系列改良操作能夠在帶壁細胞組織打孔，其所需的DNA含量少，但儀器昂貴，且電擊操作會對轉化子造成一定的損傷。

（三）基因克隆：菌類細胞化學性質(zhì)分析，功能基因結合分子特征

在基因轉移、基因編輯技術支持下，食用菌的蛋白質(zhì)、脂肪及淀粉等營養(yǎng)要素含量、性質(zhì)的改變成為可能，可幫助食用菌向有益于人們身體健康的方面發(fā)展?；蚩寺〖夹g方式在食用菌的使用，不僅可以用以食用菌的功能基因定位，還可以用以食用菌的化學物質(zhì)提取及其復制。通過基因克隆技術在食用菌中的應用，能夠?qū)y帶突變基因的等位基因菌株特性進行鑒定，有利于對食用菌品種的培育，從而復制培育出更優(yōu)質(zhì)的菌種。例如以猴頭菌為例，猴頭菌俗稱猴頭菇、刺猬菌等，是一種藥食功能兼具的食用菌類，在我國的河北、吉林、四川、遼寧等地廣泛種植。生物科學界對猴頭菌的功能基因定位及食用菌的基因克隆培育研究中，通常使用到基因克隆的技術手段。首先，對猴頭菌進行生物化學實驗之前，明確猴頭菌的基本性狀、特征、基因特點，如猴頭菌的菌絲生長速度、酶活性及產(chǎn)量等等，采用分子生物化學技術的方式了解猴頭菌菌絲生長特征、酶活性、分子細胞等基礎構成特點基礎上，采用基因克隆技術的手段，對猴頭菌中的DNA序列及化學物質(zhì)細胞進行提取，從而初步獲取到猴頭菌的基因分子。其次，采用構建遺傳連鎖譜的方法，尋找猴頭菌中的與分子檢測目標相似的及數(shù)量相對的狀位點緊密連鎖分析，對生物體的分子及化學物質(zhì)進行標記而提取，從而方便用于其它菌類的合成上。最后，采用基因克隆的技術手段，對猴頭菌木質(zhì)素降解酶基因全長cDNA的分子序列和蛋白結構進行預測，采用實驗標準中所需的分子生物技術對猴頭菌錳過氧化物酶（MnPs）基因進行轉換與復制，研究乙醇脫氫酶啟動子alcA基因?qū)χ亟M表達菌株細胞活性的調(diào)控機制，從而實現(xiàn)猴頭菌基因功能的精準定位與優(yōu)質(zhì)分子化學物質(zhì)的提取復制，并且為篩選重組MnPs高效表達量的工程菌株提供理論基礎。

四、結語

綜上所述，分子生物學技術作為生物科學界的主要實驗技術手段，是研究者充分分析與了解生物體基本構造與化學物質(zhì)組成、生命體構成的主要技術渠道。尤其是分子生物學范疇下的DNA分子標記、分子轉化、基因克隆三種技術方法，其被廣泛應用于我國食用菌的研究之中，為食用菌的菌種培育、種植及生產(chǎn)等提供了主要的科學技術手段，促進食用菌的高效生產(chǎn)?；贒NA分子標記、分子轉化、基因克隆三種技術方法的應用，我國生物科學界對其研究較為廣泛，因此，結合著我國對DNA分子標記、分子轉化、基因克隆三種技術方法的研究理論，以各類食用菌為例，更進一步梳理出DNA分子標記、分子轉化、基因克隆三種技術方法的使用方式，從而促進分子生物技術在食用菌中的研究應用。