宮銘 張成普

作者單位：110004 遼寧省沈陽市，中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院全科醫(yī)學科

氧化三甲胺(trimethylamine-N-oxide，TMAO)是膽堿在腸道的代謝產(chǎn)物。越來越多的證據(jù)表明，血清TMAO水平與結(jié)直腸癌(CRC)、胰腺癌、肝癌及胃癌等多種老年常見惡性腫瘤相關(guān)。本文結(jié)合了近年來的基礎(chǔ)研究和臨床研究，針對TMAO水平與老年人常見惡性腫瘤的發(fā)生風險及機制進行綜述。

1 TMAO的產(chǎn)生與代謝

TMAO是一種無色無味的晶體物質(zhì)，屬于胺類氧化物，化學式為(CH3)3NO。這種化合物通常存在于真菌、植物和動物中，并可在海洋動物中內(nèi)源性合成[1]。膽堿及L-肉堿是人體內(nèi)TMAO的重要來源，富含膽堿和L-肉堿的食物包括魚肉、紅肉、谷物、大豆和蔬菜等。攝入牛肉和雞蛋可以產(chǎn)生如L-肉堿、膽堿/磷脂酰膽堿、甜菜堿、膽堿、麥角硫氨酸和二甲基甘氨酸等物質(zhì)，進一步在腸道內(nèi)生成三甲胺(trimethylamine,TMA)[2]。TMA通過被動擴散迅速吸收到門脈循環(huán)中，在肝臟中的黃素單加氧酶3(flavin-containing monooxygenase 3,FMO3)作用下氧化為TMAO，經(jīng)腎臟排泄至體外。雖然既往研究認為TMAO是人類的代謝廢物，但許多研究表明TMAO參與了從細菌到哺乳動物的眾多生物體的多種生物學功能。例如，TMAO通過參與維持滲透壓和靜水壓而具有保持細胞體積的作用[3]。

血漿TMAO水平與年齡呈正相關(guān)[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，在老年健康男性中，循環(huán)TMAO對飲食蛋白質(zhì)攝入量的變化具有明顯響應性[5]。但Griffin等[4]發(fā)現(xiàn)，地中海飲食方式干預6個月后未發(fā)現(xiàn)血漿TMAO水平或TMAO與其前體化合物比值水平發(fā)生顯著改變，這表明老年人TMAO水平僅靠調(diào)整膳食結(jié)構(gòu)很難發(fā)生改變。最近的研究提示，一些生物活性化合物，如白藜蘆醇、大蒜素、辣椒素，以及蘋果、烏龍茶、天然麥麩和低脂飲食中的膳食成分，可以降低TMAO的水平[6]。血漿TMAO水平受多種因素影響，所以各研究之間仍存在較大差異。

惡性腫瘤是威脅人類健康的主要疾病之一，老年人是高危人群。有研究提出，隨著機體的衰老，血漿TMAO水平會逐漸升高，TMAO可以通過增加氧化應激等方式加速內(nèi)皮細胞和血管的老化[7]。越來越多研究證實，TMAO在多種老年常見腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。

2 TMAO與CRC

2020年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，CRC是世界上第三大常見惡性腫瘤(占總病例數(shù)的10.0%)和第二大癌癥死亡原因(占總癌癥死亡的9.4%)[8]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，人們對CRC發(fā)生過程中腸道微生物扮演的角色有了更清楚的認識。Bae等[9]在2014年第一次通過病例對照研究提出血漿膽堿代謝產(chǎn)物TMAO與CRC的風險呈正相關(guān)，尤其是在血漿維生素B12水平較低的女性中。血漿TMAO水平較高組罹患CRC的風險為血漿TMAO水平較低組的3.4倍。CRC病人的術(shù)前血清TMAO水平可作為CRC新的預后標志物[10]。多因素分析結(jié)果顯示，血清TMAO水平和遠處轉(zhuǎn)移是CRC獨立的預后因素[11]。另一項研究通過全基因系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)TMAO與大腸癌之間有顯著的關(guān)聯(lián)，并指出TMAO參與了代謝綜合征與癌癥的發(fā)生，特別是在CRC有關(guān)的遺傳途徑中發(fā)揮了重要作用[12]。

2.1 炎癥與氧化應激 炎癥在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。氧化應激是體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)等促氧化分子超過抗氧化化合物豐富程度的現(xiàn)象。ROS可以導致DNA突變、細胞損傷和炎癥，上述過程都是惡性腫瘤發(fā)病機制的關(guān)鍵因素。研究表明，TMAO以劑量依賴的方式激活胎兒結(jié)腸細胞(FHCs)中的ROS[13]。氧化應激對細胞蛋白質(zhì)和DNA造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷，包括DNA斷裂、蛋白質(zhì)斷裂和膜功能障礙。Sun等[14]觀察了TMAO刺激的硫氧還蛋白相互作用蛋白-核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(TXNIP-NLRP3)炎癥小體在人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)中的表達，證實TMAO 顯著引發(fā)氧化應激并激活TXNIP-NLRP3炎癥小體，其中炎癥細胞因子IL-1β和IL-18以劑量和時間依賴性方式釋放，并且抑制內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)和一氧化氮(NO)的產(chǎn)生。此外，使用ROS抑制劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)處理或siRNA介導的TXPIN和NLRP3基因敲除可以觀察到TMAO介導的效應明顯逆轉(zhuǎn)。該結(jié)果首次揭示了TMAO通過激活ROS-TXNIP-NLRP3炎癥小體誘導炎癥和內(nèi)皮功能障礙。Van Hecke等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，與雞肉飼養(yǎng)組的大鼠相比，牛肉飼養(yǎng)組的大鼠尿液中TMAO和TMA水平明顯增加，氧化應激改變了結(jié)腸微生物組成，從而改變了它們的代謝能力，這可能會對結(jié)腸黏膜產(chǎn)生有害影響。同時，作者認為氧化應激可能并不是導致CRC的直接因素，可能是ROS激活了其他與肉類相關(guān)的基因毒素，如苯并[a]芘(benzo[a]pyrene)等，使其最終致癌。長期以來，沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirtuins1, SIRT1)在癌癥發(fā)生中的雙重作用一直是科學家們的研究重點，SIRT1可以抑制炎癥及腫瘤的發(fā)生和進展，同時SIRT1也可以在腫瘤發(fā)病過程中起促進作用。SIRT1在CRC組織中表達增加。有研究表明SIRT1過表達與腫瘤晚期和不良預后相關(guān)[16]。另一項研究表明，TMAO抑制SIRT1的表達并增加體內(nèi)和體外的氧化應激，進而激活p53/p21/Rb通路，導致p53增加，p53、p21乙酰化，并降低細胞周期蛋白依賴性激酶2、細胞周期蛋白E1和磷酸化Rb的水平，該機制可能會加速內(nèi)皮細胞衰老和血管老化[7]。

一項關(guān)于健康老年女性的研究表明，補充肉堿24周后，氧化應激生物標志物如髓過氧化物酶、同型半胱氨酸、尿酸和低密度脂蛋白的水平與補充前相比沒有顯著差異[17]。在德國成年人群中，食用肉類也與血漿TMAO水平無關(guān)[18]。上述結(jié)果差異可能是由樣本量的變化、研究參數(shù)的差異、性別偏倚或年齡差異導致。

2.2 腸道通透性改變 血液中TMAO的濃度可能取決于多種因素，包括飲食、腸道微生物活動、腸道血液屏障(gut-blood barrier, GBB)對TMA的滲透性、肝臟對TMA的氧化以及TMA和TMAO的排泄。越來越多的證據(jù)表明，腸道微生物產(chǎn)生生物活性化合物進入循環(huán)，影響循環(huán)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)。腸道細菌代謝產(chǎn)物進入血液循環(huán)需要通過GBB，2020年的一項動物實驗表明，大鼠TMAO水平增加是由于GBB紊亂和TMA的腸道血液通道增加所致[19]。Jaworska等[20]對24～26周血壓正常的大鼠(WKY)和自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)進行實驗研究，結(jié)果顯示SHR大鼠血液中TMA水平升高，這是由于GBB功能喪失所致。GBB功能喪失增加了GBB的通透性，導致更多的TMA被轉(zhuǎn)運到肝臟，在肝臟進一步生成TMAO。同時，研究發(fā)現(xiàn)肥胖CRC病人的腸道微生物群存在更高豐度的條件致病菌(如普雷沃氏菌、核梭桿菌、腸桿菌科和大腸桿菌)，這可能會損害腸道屏障功能(增加循環(huán)佐菌素水平)，并通過增加炎癥分子如IL-1β和TMAO的水平，促進其與CRC相關(guān)的炎癥過程[21]。高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box protein 1, HMGB1)是一種已被報道破壞細胞-細胞連接的炎癥介質(zhì)，可以導致血管內(nèi)皮通透性增高及內(nèi)皮功能障礙。有研究表明HMGB1是TMAO誘導內(nèi)皮功能障礙的重要介質(zhì)之一[22]。

2.3 DNA損傷 TMAO有可能誘導炎癥和氧化應激，從而導致DNA損傷，最終導致CRC的發(fā)生。2021年一項研究證實了TMAO可以破壞DNA的組織結(jié)構(gòu)[23]。在TMAO處理24 h后，人臍動脈平滑肌細胞(HUASMC)的氧化應激水平升高，但這并未影響線粒體功能和NF-κB活性。CRC的風險隨年齡增長而增加，這可能與TMAO水平隨年齡增長相關(guān)。DNA損傷導致復制和插入突變錯誤，有利于癌前缺陷的擴展。DNA損傷在惡性細胞的生長和CRC的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。膽堿及其產(chǎn)物TMAO是總甲基供體，可作為底物，使N2O3亞硝化生成N-亞硝基化合物(NOCs)。NOCs有可能引起DNA甲基化等表觀遺傳改變，從而造成DNA損傷，并導致惡性轉(zhuǎn)化。因此，TMAO可能通過增加遺傳負荷來促進CRC的發(fā)展。表觀遺傳修飾通過調(diào)節(jié)基因表達，特別是不直接修飾基因組中的DNA序列來影響許多細胞過程[24]。表觀遺傳修飾包括組蛋白修飾、DNA甲基化、染色質(zhì)重塑和基于RNA的調(diào)控。已知一些細菌代謝物會影響細胞過程，如能促進組蛋白修飾的短鏈脂肪酸和甲硫氨酸，后者可以合成甲基供體，這與大腸桿菌產(chǎn)生TMA有關(guān)，也與DNA的甲基化有關(guān)。TMAO與胰島素抵抗和胃腸癌(GIC)的發(fā)生風險以及動脈粥樣硬化性心血管疾病有關(guān)，其共同的途徑是通過NOCs的形成進一步導致DNA損傷和表觀遺傳的變化[25]。因此，TMAO在表觀遺傳變化中的影響也不可忽視。

2.4 蛋白質(zhì)折疊 2017年關(guān)于TMAO的研究報告稱，TMAO通過誘導蛋白質(zhì)的壓實而非正常折疊，破壞了α-酪蛋白的伴侶活性[26]。不同的滲透劑(如TMAO)可能對無序蛋白(IDP)產(chǎn)生不同的結(jié)構(gòu)和功能的影響，因此可能對涉及IDP的大量人類疾病(例如淀粉樣變性、癌癥、糖尿病和神經(jīng)變性)具有臨床意義。

總之，CRC是截止到目前被發(fā)現(xiàn)與TMAO作用最為緊密的老年人常見惡性腫瘤。腸道細菌代謝產(chǎn)物TMAO進入腸上皮細胞，激活ROS的產(chǎn)生，導致炎癥的發(fā)生。ROS也可以創(chuàng)造低氧微環(huán)境和消炎作用，但過量的TMAO會導致ROS的持續(xù)和失控產(chǎn)生，促進炎性細胞因子的釋放。炎癥可損傷DNA，可導致突變或誘導基因組不穩(wěn)定，最終導致CRC的發(fā)生。TMAO可以導致蛋白質(zhì)的錯誤折疊或引起折疊蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化，這些蛋白質(zhì)可以形成聚集體，累積的蛋白質(zhì)聚集體可以促進CRC的發(fā)生。

3 TMAO與胰腺癌

胰腺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的第七大原因，5年生存率低至9%[27]，胰腺癌一直缺乏可靠的早期診斷工具。雖然癌抗原-9是疾病進展的良好標志物，但研究表明該標志物不能區(qū)分重度不典型增生和胰腺癌。2020年Morgell等[28]通過招募獨立隊列，使用正交定量方法發(fā)現(xiàn)，在侵襲性胰腺癌的囊性前體中存在具有代謝活性的細菌(腸桿菌科細菌、克雷伯菌等)及其微生物區(qū)系相關(guān)的代謝物(膽汁酸、TMAO、參與TMAO轉(zhuǎn)化的膽堿和肉堿以及色氨酸衍生物等)。這一發(fā)現(xiàn)對于研究腫瘤內(nèi)微生物藥物代謝而產(chǎn)生的化療耐藥性具有重要臨床意義。Huang等[29]通過前瞻性隊列研究發(fā)現(xiàn)，甲硫氨酸和總甲基供體(包括膽堿、甜菜堿和甲硫氨酸)與胰腺癌風險呈負相關(guān)，這一結(jié)論支持DNA修復和甲基化對胰腺癌的發(fā)展起著重要作用，另外，他還發(fā)現(xiàn)TMAO可能會導致胰腺癌發(fā)生風險升高，這表明腸道微生物群在膳食膽堿-胰腺癌風險關(guān)聯(lián)中具有調(diào)節(jié)作用。一項對TMAO在胰腺癌中的作用的研究表明，TMAO水平升高增加了超氧化物歧化酶的活性，并增加了促炎生物標志物，如TNF-α、可溶性腫瘤壞死因子受體(sTNF-R) p55和sTNF-R p75[30]。促炎標志物的濃度與癌癥的嚴重程度呈正比。這一系列研究值得我們思考——腸道細菌與胰腺癌的關(guān)系會不會如同胃癌與幽門螺桿菌(Hp)感染一樣直接相關(guān)？腸道細菌及其代謝產(chǎn)物在胰腺癌的發(fā)生及進展中起到怎樣的作用?

4 TMAO與肝癌

一項來自中國廣東省的病例對照研究通過對比分析671例原發(fā)性肝癌病人與671例對照組受試者的血清TMAO及膽堿水平發(fā)現(xiàn)，血清TMAO水平較高的受試者發(fā)生原發(fā)性肝癌的風險顯著增加，但其前體膽堿與原發(fā)性肝癌風險呈負相關(guān)[31]。作者提出2種可能存在的機制。首先，TMAO可能通過降低總膽汁酸池大小和影響肝臟TG水平來引發(fā)肝損傷，導致原發(fā)性肝癌的發(fā)展。其次，TMAO可能是間接危險因素，參與多種慢性疾病的病因，包括動脈粥樣硬化、血栓形成、高血壓和慢性腎病，這些都是原發(fā)性肝癌的潛在危險因素。2019年一項試驗發(fā)現(xiàn)，TMAO在生理相關(guān)濃度下與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激激酶PERK(EIF2AK3)結(jié)合，選擇性激活未折疊蛋白反應的PERK分支，并通過PERK依賴的方式誘導叉頭轉(zhuǎn)錄因子O1(FOXO1)[32]，這是代謝疾病的關(guān)鍵驅(qū)動因子。通過控制腸道微生物群或抑制FMO3來降低TMAO，可以降低肝臟中PERK的激活和FOXO1的水平。上述結(jié)論揭示了TMAO和PERK可能是代謝綜合征發(fā)病機制的核心。

5 TMAO與胃癌

Hp的定植誘導胃黏膜的免疫和炎癥反應[33]。有學者對TMAO和Hp感染對胃上皮細胞基因表達的影響進行了研究，并使用人類基因芯片Affymetrix HTA 2.0進行生物信息分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，在Hp和TMAO共處理的人胃黏膜上皮細胞(GES-1)中，1312個基因被鑒定為差異表達基因?；虮倔w(GO)分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析表明這些差異表達基因的功能與免疫炎癥密切相關(guān)。Hp和TMAO的協(xié)同作用使IL-6、CXCL1、CXCL2、FOS和C3等免疫炎癥相關(guān)基因的表達增強，與未感染的對照細胞、Hp感染的細胞和TMAO刺激的細胞相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這項研究表明，TMAO改變了Hp感染誘導的免疫炎癥基因的表達水平，Hp和TMAO的協(xié)同作用為研究慢性胃炎、胃潰瘍和胃癌的進展提供了新的見解。

6 總結(jié)與展望

TMAO作為一種腸道菌群的代謝產(chǎn)物，在老年常見惡性腫瘤的發(fā)病過程中起重要作用。同時其在代謝性疾病及心血管系統(tǒng)疾病中的作用也漸漸被證實。隨著TMAO檢驗技術(shù)的更新迭代，越來越多便捷、廉價、高效的TMAO檢測手段問世[34]，這將為TMAO更加深入地指導臨床工作及深入探究TMAO與疾病的關(guān)系提供條件。綜上所述，TMAO可能為常見惡性腫瘤的預后提供參考價值，并成為一種全新的治療靶點。