陳能剛， 鄢小青， 李 歡， 陳 鋒

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所， 貴陽 550006)

水稻是重要的糧食作物，對(duì)保障糧食安全具有重要作用。水稻理想株型育種是提高水稻產(chǎn)量的重要研究方向之一，穗型是株型的重要組成部分，穗型發(fā)育突變體的發(fā)現(xiàn)與研究不僅是鑒定穗型發(fā)育功能基因的重要途徑之一，也是水稻新品種選育、生物技術(shù)研究以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)水稻超高產(chǎn)育種和分子育種有著重要意義。

近年來，科學(xué)家在水稻穗型相關(guān)突變體、基因克隆以及激素調(diào)控等方面開展了深入研究，并取得重要進(jìn)展。發(fā)現(xiàn)了許多與水稻穗型相關(guān)的調(diào)控基因，其中突變體dep1呈現(xiàn)直立穗[1]。sp1突變體表現(xiàn)出短穗表型[2]。pap2突變體產(chǎn)生多個(gè)軸枝梗，呈現(xiàn)簇狀穗[3]。srs3籽粒呈現(xiàn)小圓粒表型[4]。dep2穗長(zhǎng)變短是穗發(fā)育過程中細(xì)胞增殖減少所致[5]。sped1形成簇生小穗[6]。asp1/osrel2突變體的枝梗結(jié)構(gòu)混亂，一次枝梗數(shù)量增加，二次枝梗數(shù)量減少[7]。本研究利用60Co輻射誘變貴州地方粳稻品種“橋港珍珠米”，獲得一份短穗小粒突變體sp18(short panicle 18)。對(duì)sp18突變表型特征鑒定、遺傳與分子標(biāo)記連鎖、全基因組重測(cè)序變異檢測(cè)及候選基因進(jìn)行分析，為基因克隆和功能分析以及分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

短穗小粒突變體sp18是利用貴州地方粳稻資源橋港珍珠米通過60Co輻射誘變獲得的，經(jīng)過連續(xù)多代自交，該突變表型能夠穩(wěn)定遺傳。2019年3月在海南基地以正常表型的橋港珍珠米和秈稻R 1638為父本，分別配制sp18/橋港珍珠米和sp18/R 1638兩個(gè)雜交組合，分別收獲F1代種子，同年在貴陽種植F1代，F(xiàn)1自交構(gòu)建F2遺傳群體和F2定位群體。

1.2 遺傳與分子標(biāo)記連鎖分析

在貴陽分別種植親本、F1、F2代，在抽穗期觀察各世代的表型差異。參照鄢小青等[8]的SDS法提取水稻新鮮葉片DNA，分別提取sp18、橋港珍珠米和R 1638以及F2群體中的突變混池和正?；斐氐臉O端混池用于基因定位。采用BSA法定位目標(biāo)基因，從sp18/R1638的F2群體中選取10株正常單株和10株呈現(xiàn)短穗小粒的單株，分別等量混合成正?；蚧斐睾屯蛔兓蚧斐亍⒄账净蚪M的SSR分子標(biāo)記，利用秈稻9311和粳稻日本晴基因組間的差異，尋找多態(tài)性較好的SSR分子標(biāo)記。通過3%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，篩選在突變體sp18與R 1638間的多態(tài)性分子標(biāo)記。然后用多態(tài)性好的分子標(biāo)記分析正常基因池與突變基因池之間的多態(tài)性，找到目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記后用F2群體中的隱性單株進(jìn)行驗(yàn)證，確定該分子標(biāo)記是否與突變性狀連鎖。

1.3 DNA文庫構(gòu)建、測(cè)序和變異檢測(cè)分析

CTAB法提取樣品DNA，通過Covaris破碎機(jī)將其打斷為長(zhǎng)度350 bp大小片段。采用TruSeq Library Construction Kit建庫，文庫構(gòu)建完成后，使用Qubit 3.0進(jìn)行初步定量，再使用Agilent 2100對(duì)文庫的insert size進(jìn)行檢測(cè)，文庫的有效濃度采用Q-PCR進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析(文庫有效濃度>2 nM)，待合格后進(jìn)行illumina測(cè)序分析。通過BWA軟件[9]對(duì)獲得的有效測(cè)序數(shù)據(jù)(雙親和兩個(gè)極端混池)與參考基因組比對(duì)分析，并經(jīng)SAMTOOLS[10]去除重復(fù)。采用SAMTOOLS進(jìn)行個(gè)體SNP和長(zhǎng)度小于50 bp的小片段插入與缺失(InDel)進(jìn)行檢測(cè)。再利用Break Dancer軟件[11]，基于pair-end reads比對(duì)到參考基因組上面的關(guān)系及實(shí)際insert size大小檢測(cè)樣品與參考基因組間的插入(insertion，INS)、缺失(deletion，DEL)、倒置(inversion，INV)、染色體內(nèi)部遷移(intra-chromosomal translocation，ITX)、染色體間的遷移(inter-chromosomal translocation，CTX)。通過ANNOVAR對(duì)PE reads支持?jǐn)?shù)小于2的DEL、INS、INV進(jìn)行變異注釋。最后利用CNVnator[12]對(duì)基因組上不同的reads 覆蓋深度進(jìn)行檢測(cè)分析，判斷潛在的deletion和duplication，并采用ANNOVAR進(jìn)行變異注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型鑒定與農(nóng)藝性狀調(diào)查

在田間，短穗突變體sp18與野生型相比，分蘗數(shù)無明顯變化，而穗長(zhǎng)變小，穗粒數(shù)明顯減少，籽粒明顯變小(圖1)。成熟后，通過對(duì)sp18和野生型農(nóng)藝性狀調(diào)查發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，突變體sp18的株高增加，有效穗沒有顯著變化，而結(jié)實(shí)率、穗長(zhǎng)、穗粒數(shù)和千粒重較野生型顯著減少(圖2)。

圖1 突變體sp18與野生型表型Fig.1 The phenotype observation of sp18 and wild-type

圖2 突變體sp18與野生型農(nóng)藝性狀鑒定Fig.2 The identification on agronomic characterization of sp18 and wild-type

2.2 遺傳與分子標(biāo)記連鎖分析

突變體sp18分別與正常的野生型和秈稻品種R 1638雜交，在貴陽分別種植親本、F1、F2代，在抽穗期觀察各世代的表型，結(jié)果F1代表現(xiàn)為野生型，F(xiàn)2代植株可分為野生型性狀和突變型性狀。經(jīng)卡方(χ2)測(cè)驗(yàn)，其分離比例均符合3∶1(表1)，表明sp18的突變表型受1對(duì)隱性核基因控制。sp18與秈稻品種R 1638雜交獲得的F2代群體作為基因定位群體，利用分布在水稻染色體上的SSR標(biāo)記進(jìn)行初步定位，研究發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)基因與第11號(hào)染色體上的分子標(biāo)記RM 167和RM 27150連鎖，物理距離分別為19.1 cM和41.5 cM處。

表1 雜交F2群體中短穗植株的分離情況Table 1 The isolation of short-spike plants in hybrid F2 population

2.3 變異檢測(cè)分析

通過測(cè)序數(shù)據(jù)分析(表2)，本次測(cè)序共產(chǎn)生原始數(shù)據(jù)31.46 Gb，過濾后的有效數(shù)據(jù)31.23 Gb，有效率大于99%。野生型和突變體的GC含量分別為44.52%和44.55%，測(cè)序質(zhì)量合格，GC分布正常，符合要求，可以進(jìn)行后續(xù)分析。本研究以粳稻日本晴為參考基因組，其大小為375 049 285 bp，所有樣本的比對(duì)率在96.67%～99.16%之間， 對(duì)參考基因組(排除N區(qū))的平均覆蓋深度在30.60～38.61 X之間，1 X覆蓋度(至少有一個(gè)堿基的覆蓋)在97.09%以上。比對(duì)結(jié)果正常，可用于后續(xù)的變異檢測(cè)及相關(guān)分析。

表2 野生型(WT)和sp18測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量情況匯總Table 2 Summary of wild-type (WT) and sp18 sequencing data quality

最終在野生型親本和突變體sp18中分別檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)數(shù)為289 649和289 784，InDel個(gè)數(shù)分別為60 268和59 645，SV個(gè)數(shù)分別為8 207和7 510，CNV個(gè)數(shù)分別為4 722和4 402，變異檢測(cè)結(jié)果正常(圖3)。為了形象化展示樣本中的結(jié)構(gòu)變異，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行如下處理：

1) 對(duì)于SNP和InDel，畫出其在染色體上的密度分布；

2) 對(duì)于SV及CNV，畫出它們?cè)谌旧w上的位置及大小。

注：由外到內(nèi)依次為染色體、SNP、InDel、CNV duplication、CNV deletion、SV insertion、SV deletion、SV invertion (SV ITX，SV CTX)。 圖3 野生型和突變體的基因組結(jié)構(gòu)變異分布 Fig.3 Distribution of structural variation in the genome of wild-type and mutant

2.4 候選基因篩選

結(jié)合分子標(biāo)記與變異檢測(cè)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，sp18在第11號(hào)染色體上缺失于322 720 bp(7 189 868～7 512 630 bp之間)。通過水稻數(shù)據(jù)庫http://rice.uga.edu對(duì)該缺失區(qū)間的功能基因進(jìn)行注釋(表3)。研究發(fā)現(xiàn)，該缺失區(qū)間包括Os11g0235200、Os11g0235700、Os11g0235750、Os11g0236000、Os11g0236100、Os11g0236200、Os11g0237900、Os11g0238000、Os11g0238400、Os11g0238700、Os11g0239000、Os11g0239200、Os11g0239400、Os11g0239500、

表3 候選基因注釋信息Table 3 Candidate gene annotation information

Os11g0240600和Os11g0240900。其中Os11g0235200編碼肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，為已克隆的短穗基因sp1。Os11g0236000編碼磷酸甘油二酯磷酸二酯酶家族蛋白，通過數(shù)據(jù)庫https://rapdb.dna.affrc.go.jp分析發(fā)現(xiàn)，與GH3基因(Os06g0499500)有關(guān)，參與生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)；Os11g0239500和Os11g0240600均編碼赤霉素受體GID 1 L 2，參與赤霉素的調(diào)控。

3 結(jié)論與討論

通過對(duì)sp18和野生型(橋港珍珠米)的表型特征分析發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，sp18的株高有所增加，有效穗沒有顯著變化，而結(jié)實(shí)率、穗長(zhǎng)、穗粒數(shù)和千粒重較野生型顯著減少。sp18的表型特征與已報(bào)告的sp1呈現(xiàn)出相似的短穗小粒突變表型[2]，但株高與sp1存在差異表型。通過分子標(biāo)記連鎖分析，將候選基因初步定位于第11號(hào)染色體上的分子標(biāo)記RM 167和RM 27150附近，物理距離分別為19.1 cM和41.5 cM處。經(jīng)過全基因組重測(cè)序?qū)p18和野生型橋港珍珠米的基因組中SNPs、InDel、SV和CNV變異進(jìn)行分析。結(jié)果表明，sp18在第11染色體上缺失322 720 bp(7 189 868～7 512 630 bp之間)。對(duì)sp18缺失區(qū)間相關(guān)基因的功能注釋發(fā)現(xiàn)，在缺失區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)參與生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)和赤霉素調(diào)控相關(guān)的基因，包括Os11g0235200(短穗基因SP1)、Os11g0236000、Os11g0239500和Os11g0240600。Os11g0236000編碼磷酸甘油二酯磷酸二酯酶家族蛋白，參與生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)，Os11g0239500和Os11g0240600均編碼赤霉素受體GID 1 L 2，參與赤霉素的調(diào)控。因此，短穗小粒突變基因sp18為sp1的新等位基因，然而sp18突變體呈現(xiàn)出與sp1存在既相似又不同的突變表型特征，推測(cè)可能是由于sp18基因組大片段缺失，包括多個(gè)與植物激素相關(guān)的基因缺失而導(dǎo)致的。