陽 騰, 劉怒安, 劉聰聰, 陳恩發(fā)

(貴州省生物技術(shù)研究所， 貴陽 550006)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是世界四大糧食作物之一，塊莖中富含淀粉、蛋白質(zhì)、維生素、類胡蘿卜素、花青素等營養(yǎng)成分[1-3]，在鞏固我國糧食安全和人民營養(yǎng)健康方面發(fā)揮著重要作用。病毒病是引起馬鈴薯減產(chǎn)的重要因素[4]，可使馬鈴薯減產(chǎn)20%～50%，嚴(yán)重的達80%以上。感染病毒的馬鈴薯通過塊莖無性繁殖進行世代積累和傳遞，致使塊莖種性退化，產(chǎn)量下降。約40種病毒及類病毒可侵染馬鈴薯引發(fā)病害[5]，馬鈴薯 X 病毒(PVX)、馬鈴薯 Y 病毒(PVY)、馬鈴薯 A 病毒(PVA)、馬鈴薯卷葉病(PLRV)、馬鈴薯 S 病毒(PVS)以及馬鈴薯紡錘狀塊莖類病毒(PSTVd)[4]是目前嚴(yán)重危害我國馬鈴薯產(chǎn)區(qū)的幾類馬鈴薯病毒。

病毒檢測技術(shù)是阻斷病毒在馬鈴薯種薯中累積傳播的重要手段，主要用于病毒檢測的技術(shù)有免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。免疫學(xué)方法中的酶聯(lián)免疫吸附劑測定法(ELISA)在病毒檢測上應(yīng)用較廣泛[6-7]，但存在耗時長、干擾因素多、易出現(xiàn)假陽性等缺點。實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測技術(shù)因其靈敏度高、特異性強、重復(fù)性好和可批量檢測多種病毒等優(yōu)點，已被運用于動物[8-9]、果樹[10]等多物種的病毒檢測中。

本研究根據(jù)馬鈴薯病毒序列設(shè)計特異性引物，并構(gòu)建PVY、PVX、PVS、PSTVd、PLRV五種馬鈴薯病毒qRT-PCR檢測方法，以期能提高病毒檢測通量，提高病毒檢測效率，促進馬鈴薯病毒檢測技術(shù)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本實驗所用馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)脫毒苗保存于貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所種質(zhì)資源庫中。

1.2 DAS-ELISA

試劑盒購于瑞士BIOREBA公司，按試劑盒操作說明進行試驗。

1.3 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備

RNA提取試劑盒購于ABI公司，按照試劑盒操作說明提取樣品RNA，并測定濃度。反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega，隨機引物購自Takara，按照操作說明進行反轉(zhuǎn)錄。使用1 U Ex-Taq(Takara)進行25 μL體系的基因擴增，反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，72 ℃ 10 min，共30個循環(huán)，引物序列及擴增片段大小見表1。

取3 μL PCR擴增產(chǎn)物與PMD-19T載體連接，總體系10 μL，16 ℃過夜連接。使用CaCl2法制備E.coli DH 5 α 感受態(tài)菌，將載有目標(biāo)片段的T 載通過熱休克法轉(zhuǎn)化至感受態(tài) DH 5 α大腸桿菌中，并通過氨芐篩選培養(yǎng)基和藍白斑法進行陽性克隆的篩選。運用堿裂解法抽提陽性單菌落質(zhì)粒，雙酶切(BamH I/Hind Ⅲ)和質(zhì)粒PCR進行陽性驗證。重組質(zhì)粒于上海生工進行測序。

1.4 qRT-PCR

qRT-PCR熒光染料購于TAKARA公司，采用10 μL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min ，95 ℃ 20 s， 60 ℃ 1 min， 40個循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后，進行65～95 ℃的熔解曲線分析，qRT-PCR所用引物序列見表2，由上海生工合成。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性檢測

使用設(shè)計的熒光定量PCR引物(序列見表2)擴增對應(yīng)的陽性質(zhì)粒來驗證引物的特異性(圖1)。5對引物擴增條帶均一，且沒有引物二聚體條帶，結(jié)果表明，設(shè)計的5對引物均能很好地擴增目的片段，可用于后續(xù)的實時熒光定量PCR檢測。

注：M為200 bp DNA maker；1和2為PLRV 149 bp；3和4為PVY 79 bp；5和6為PVS 117 bp；7和8為PVX 91 bp；9和10為PSTVd 114 bp。圖1 五種馬鈴薯病毒引物特異性檢測Fig.1 Primer-specific detection of five potato viruses

2.2 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

5種重組質(zhì)粒經(jīng)103～108倍稀釋后，進行實時熒光定量PCR檢測。以CT值為Y軸、所測質(zhì)?？截悢?shù)對數(shù)為X軸，運用Excel軟件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，并得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(表3)。

圖2 五種重組質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of five recombinant plasmids

繪制的五組標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的R2均接近1，表明在所測濃度范圍內(nèi)，陽性質(zhì)?？截悢?shù)對數(shù)與對應(yīng)的CT值線性相關(guān)度較高，可用于后續(xù)樣品中病毒拷貝量的檢測。

表3 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table 3 Recombinant plasmid standard curve equations

2.3 檢測重復(fù)性與靈敏度分析

對每組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進行了組內(nèi)重復(fù)性分析，各組標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.5，變異系數(shù)值均小于1.5%(表4)，各組標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度間組內(nèi)重復(fù)性良好，表明五種馬鈴薯病毒qRT-PCR檢測體系重復(fù)性好，可滿足后續(xù)實驗要求。

經(jīng)測定，重組質(zhì)粒PMD 19 T-PVY、PMD 19 T-PVX、PMD 19 T-PVS、PMD 19 T-PSTVd、PMD 19 T-PLRV初始濃度分別為2.38 ng/μL、2.03 ng/μL、1.46 ng/μL、2.44 ng/μL和2.22 ng/μL(表5)。經(jīng)103～108倍稀釋后，運用qRT-PCR技術(shù)進行檢測。結(jié)果表明，qRT-PCR技術(shù)能檢出重組質(zhì)粒PMD 19 T-PVY、PMD 19 T-PVX、PMD 19 T-PVS、PMD 19 T-PSTVd、PMD 19 T-PLRV的最低濃度分別為5.74 copies/μL、4.89 copies/μL、3.52 copies/μL、5.88 copies/μL、5.35 copies/μL，此方法檢測靈敏度較高。

表4 標(biāo)準(zhǔn)偏差與變異系數(shù)范圍Table 4 Variation range of standard deviation and coefficient

表5 質(zhì)粒初始濃度(稀釋倍數(shù)為1)Table 5 Table of initial plasmid concentration (dilution multiple 1)

2.4 樣品檢測

實驗室保存的50份馬鈴薯脫毒菌苗被用于此qRT-PCR病毒檢測，將獲得的CT值代入對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品中病毒拷貝數(shù)。結(jié)果表明(表6)，保存的50株脫毒苗病毒檢出陽性率分別為PVY 2%、PVX 6%、PVS 2%、PSTVd 0%、PLRV 4%；陽性樣品中病毒的拷貝數(shù)(范圍)依次為：PVY 217 copies/μL、PVX (525～68)copies/μL、PVS 354 copies/μL、PSTVd 0 copies/μL、PLRV (221～179)copies/μL(表6)。

同時運用ELISA法檢測同一批馬鈴薯脫毒苗樣品，PVY、PLRV、PSTVd、PVS四種病毒檢出陽性率結(jié)果與qRT-PCR法一致，而PVX陽性檢出率較qRT-PCR法檢測結(jié)果偏低，為4%(表6)。

表6 qRT-PCR法與DAS-ELISA法樣品檢測比較Table 6 Comparison of sample detection by qRT-PCR method and DAS-ELISA method

3 討 論

馬鈴薯病毒病是馬鈴薯的主要病害，在我國大部分地區(qū)均有發(fā)生。已感染病毒的馬鈴薯可通過營養(yǎng)器官無性繁殖世代積累和傳遞病毒，最終將引起馬鈴薯種性退化、生長繁殖受阻、產(chǎn)量下降等現(xiàn)象[11]。快速高效的病毒檢測技術(shù)能夠及時篩選出帶毒株系，有效阻斷病毒在馬鈴薯種薯中的累積傳播。

ELISA法是目前應(yīng)用較為廣泛的馬鈴薯病毒檢測技術(shù)[12-13]，主要通過病毒與特異性抗體結(jié)合，固定病毒顆粒，并利用酶與底物的顯色反應(yīng)來進行病毒檢測，但存在耗時較長、干擾因素多、易出現(xiàn)假陽性等缺點。qRT-PCR在病毒檢測方面具有較大的潛力，它省略了常規(guī)PCR后的繁瑣操作，可批量檢測多種病毒并對反應(yīng)產(chǎn)物實時監(jiān)測，操作簡單、靈敏度高、重復(fù)性好，已逐步應(yīng)用于動植物病毒的檢測[8-10]。本研究通過兩種方法對保存的脫毒馬鈴薯苗中5種病毒進行檢測，PVX含量有差異(表6)，qRT-PCR陽性檢出率為6%，而DAS-ELISA法陽性檢出率為4%，推測是由于部分樣品中PVX病毒含量較低，未達到DAS-ELISA法檢測限度[14]。同時也表明，qRT-PCR法的靈敏度比DAS-ELISA法高。

本實驗室保存的脫毒苗PSTVd脫毒較為徹底，而PVY、PVX、PLRV、PVS這四種病毒的脫除還有待加強，脫毒苗在保存、繼代、擴繁期間仍有可能重新感染病毒。脫毒技術(shù)、繼代擴繁等操作均可影響馬鈴薯病毒攜帶率[15]。因此，脫毒苗的生產(chǎn)與保存過程中，還應(yīng)注意定期對脫毒苗進行病毒檢測，確保脫毒苗的品質(zhì)。