連 艷， 王紅蘭， 楊 萍， 杜玖珍， 蔣桂華， 孫洪兵， 周 毅， 蔣舜媛， 朱文濤

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 四川 成都 611137；2. 四川省中醫(yī)藥科學(xué)院， 成都 610041)

對(duì)葉百部(StemonatuberosaLour.)為百部科百部屬多年生攀緣藤本植物，以塊根入藥，是傳統(tǒng)中藥百部的基源物種之一，也是東南亞各國(guó)的傳統(tǒng)藥用植物[1]。百部具潤(rùn)肺、下氣止咳、殺蟲滅虱的功效，是中醫(yī)治療肺系疾病及臨床殺蟲的常用藥，此外百部在植物源殺蟲劑領(lǐng)域也具有較大的利用和開(kāi)發(fā)前景[2-4]。對(duì)葉百部因資源分布廣，臨床效果好，目前已成為百部藥材主要來(lái)源[5-6]。近年來(lái)，在市場(chǎng)需求的刺激下，對(duì)葉百部野生資源遭受掠奪式采挖，資源儲(chǔ)量銳減，市場(chǎng)供求矛盾日益凸顯。人工種植替代野生資源是實(shí)現(xiàn)植物資源可持續(xù)利用的有效途徑。然而對(duì)葉百部種子大田出苗率低，部分地區(qū)甚至采用分株繁殖方式，這種方式成本高、效率低，導(dǎo)致人工種植產(chǎn)業(yè)發(fā)展緩慢。陳玉菡等[7]野外調(diào)查表明，對(duì)葉百部產(chǎn)種潛力較大，因此利用種子繁殖是保障人工種植產(chǎn)業(yè)發(fā)展的理想育苗方式。

種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最基本的生產(chǎn)資料，開(kāi)展種子學(xué)的相關(guān)研究對(duì)植物的栽培利用具有重要意義。目前有關(guān)對(duì)葉百部的研究主要集中在化學(xué)、藥理、品質(zhì)評(píng)價(jià)等方面[8-14]，在種子學(xué)方面研究較少，僅陳玉菡等[15]研究了對(duì)葉百部種子的發(fā)芽特性，有關(guān)對(duì)葉百部種子的生物學(xué)特性缺乏系統(tǒng)研究。因此，本研究從種子表型特征、吸脹特性、萌發(fā)特性、儲(chǔ)藏特性和休眠特性等方面對(duì)對(duì)葉百部種子生物學(xué)特性開(kāi)展系統(tǒng)研究，旨在為對(duì)葉百部種子鑒別、質(zhì)量評(píng)價(jià)及高效育苗等領(lǐng)域研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

實(shí)驗(yàn)用種分別于2019年、2020年和2021年的6月下旬，采自四川省成都市新都區(qū)龍橋鎮(zhèn)對(duì)葉百部野生引種基地，野生種源來(lái)源于四川省達(dá)州市大竹縣，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院周毅研究員鑒定為對(duì)葉百部(S.tuberosa)。種子去除雜質(zhì)后曬干，隨后置于10 ℃恒溫培養(yǎng)箱中保存。于2021年10月至11月集中開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1種子形態(tài)特征觀測(cè)

取2021年采收的對(duì)葉百部種子，于體視顯微鏡下觀察種子的形狀、顏色、表面紋理及解剖結(jié)構(gòu)，并采用精度為0.01 mm的游標(biāo)卡尺隨機(jī)測(cè)量100粒種子的長(zhǎng)、種柄長(zhǎng)、直徑等形態(tài)學(xué)指標(biāo)。

1.2.2種子含水量與千粒重

取2021年采收的對(duì)葉百部種子，參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 3543—1995)《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》[16]，采用高溫烘干法測(cè)定含水量，采用百粒稱重法測(cè)定千粒重。

1.2.3種子生活力檢測(cè)

取3個(gè)不同年限采收的對(duì)葉百部種子，自來(lái)水中浸泡24 h，隨后沿中軸線將種子縱向切開(kāi)，取其中一半浸泡于0.2% TTC溶液后置于30 ℃生化培養(yǎng)箱中避光染色6 h，染色結(jié)束后用清水漂洗、鏡檢。所有處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50粒種子。

1.2.4種子吸水特性

取2021年采收的對(duì)葉百部種子兩份，一份保留完整種皮，另一份自胚根端剝除少量種皮，露出內(nèi)部種仁。稱量種子初始重量，隨后將種子置于自來(lái)水中浸泡，分別在浸泡2、4、6、8、10、12、18、24、30 h時(shí)取出種子，用吸水紙吸干表面水分稱重。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

種子吸水率(%)=[(Wt-W)/W]×100%，其中，Wt為種子浸泡t時(shí)間后的重量，W為種子初始重量。

1.2.5種子發(fā)芽試驗(yàn)

溫度對(duì)種子萌發(fā)的影響。取2021年采收的對(duì)葉百部種子，自來(lái)水中浸泡24 h，隨后將種子與洗凈的濕河沙混合，平鋪于發(fā)芽盒底部。將發(fā)芽盒分別置于10、20、25、30、35、40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)開(kāi)展發(fā)芽實(shí)驗(yàn)。

種皮對(duì)種子萌發(fā)的影響。取2021年采收的對(duì)葉百部種子，自來(lái)水中浸泡24 h，隨后將種子分成兩份，一份保留完整種皮，另一份自胚根端剝?nèi)ド倭糠N皮，露出少量種仁。將種子與洗凈的濕河沙混合，平鋪于發(fā)芽盒底部，置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)開(kāi)展發(fā)芽實(shí)驗(yàn)。

儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)種子萌發(fā)的影響。取3個(gè)不同年限采收的對(duì)葉百部種子，自來(lái)水中浸泡24 h，隨后將種子與清洗干凈的濕河沙混合，平鋪于發(fā)芽盒底部，置于30 ℃的恒溫暗培養(yǎng)箱內(nèi)開(kāi)展發(fā)芽實(shí)驗(yàn)。

以上所有發(fā)芽實(shí)驗(yàn)每處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50粒種子。實(shí)驗(yàn)期間每隔2 d觀察種子發(fā)芽情況，并翻動(dòng)沙子以防止種子生霉。種子發(fā)芽以胚根生出0.5 cm為標(biāo)準(zhǔn)，第30天結(jié)束實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)。

發(fā)芽率(%)=(種子萌發(fā)總數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽勢(shì)(%)=(N20/供試種子總數(shù))×100%，式中，N20為實(shí)驗(yàn)前20 d的萌發(fā)種子總數(shù)；

發(fā)芽時(shí)滯(d)：第一粒種子發(fā)芽需要的天數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2018軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析及繪圖，運(yùn)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子形態(tài)特征

對(duì)葉百部種子呈棕褐色至黑褐色，主體呈橢圓形至卵圓形，表面具縱槽紋14～19條，無(wú)裂隙，發(fā)芽口隱藏不可見(jiàn)。種子基部具細(xì)長(zhǎng)種柄；頂端內(nèi)臍明顯，呈瘤狀突起；種脊線形，自種柄基部延伸至頂端內(nèi)臍(圖1 A，B)。種子長(zhǎng)(含種柄)7.72～12.39 mm，直徑2.09～3.84 mm，種柄長(zhǎng)1.42～3.70 mm，三者變異系數(shù)均超過(guò)11%，其中種柄長(zhǎng)的變異系數(shù)最大，達(dá)到20.05%(表1)。

注：A、B為種子形態(tài)特征；C為種子橫切面；D為種子縱切面。1為內(nèi)臍；2為種皮表面縱槽紋；3為種脊；4為種柄； 5為種脊橫/縱切面；6為種脊內(nèi)部管狀通道及絲狀纖維殘留；7為種胚；8為胚乳；9為種皮橫切面；10為發(fā)芽口。 圖1 對(duì)葉百部種子形態(tài)特征及解剖結(jié)構(gòu) Fig.1 The morphological characteristics and anatomical structure of S. tuberosa seeds

表1 對(duì)葉百部種子形態(tài)指標(biāo)分析Table 1 The morphological index of S. tuberosa seeds

種子解剖結(jié)構(gòu)觀察可知(圖1 C，D)，對(duì)葉百部種皮規(guī)律性增厚使種子橫切面呈齒輪狀，增厚部分內(nèi)部呈海綿狀；種脊內(nèi)部可見(jiàn)一管狀通道及絲狀纖維殘留；胚根端種皮縱切面可見(jiàn)隱藏的發(fā)芽口。對(duì)葉百部種子具白色的胚和胚乳，胚乳豐富；種胚條狀，著生于基部胚乳中央，屬典型的直立型胚，長(zhǎng)約占種仁的1/2。

注：A、B為胚●+胚乳●；C、D為胚+胚乳●；E、F為胚○+胚乳●；G、H為胚○+胚乳○。 圖2 對(duì)葉百部種子TTC染色模式 Fig.2 Pattern of TTC staining on S. tuberosa seeds

2.2 種子含水量與千粒重

自然曬干的對(duì)葉百部種子含水量為14.30%，在該含水量條件下的種子千粒重為25.31 g，依據(jù)作物種子千粒重分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)可將對(duì)葉百部種子歸為中粒種子。

2.3 種子生活力

采用TTC染色法測(cè)定對(duì)葉百部種子生活力，有活力種子的胚和胚乳均能被染色，且呈現(xiàn)4種染色模式：“胚+胚乳●”改為“胚●+胚乳●、胚+胚乳●、胚○+胚乳●、胚○+胚乳○(圖2，“●”表示全部染色，“”表示部分染色，“○”表示未染色)”；胚和胚乳的染色效果存在差異，胚染色后呈現(xiàn)出均一的鮮紅色，胚乳染色則呈現(xiàn)出顆粒狀或帶狀紅斑，顏色存在鮮紅和鐵銹紅兩種。本研究以種胚2/3以上被染成紅色作為種子生活力的判定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表明，對(duì)葉百部種子的生活力隨儲(chǔ)存時(shí)間的增加而急劇降低。2021年采收(儲(chǔ)存4個(gè)月)的種子生活力可達(dá)83.33%，儲(chǔ)存超過(guò)1年的種子生活力降低至30.67%，儲(chǔ)存兩年以上的種子則基本喪失生活力(圖3)。

注 ：不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。圖3 儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)對(duì)葉百部種子生活力的影響Fig.3 Effects of storage time on seed viability of S. tuberosa seeds

2.4 種子吸水特性

對(duì)葉百部種子吸水特性研究表明，無(wú)論種皮是否完整，種子吸水趨勢(shì)一致，以2 h為節(jié)點(diǎn)分為快速吸水期(0～2 h)和緩慢吸水期(2 h以后)(圖4)?？焖傥冢N皮完整種子吸水率達(dá)到44.27%，占總吸水量的59.75%；種皮破損種子吸水率為32.83%，占總吸水量的53.98%。緩慢吸水期，種皮完整種子吸水率增加29.81%，占總吸水量的40.25%；種皮破損種子吸水率增加27.99%，占總吸水量的46.02%。以吸水率增量同浸泡時(shí)間的比值評(píng)價(jià)種子吸水速率，種皮完整種子快速吸水期的吸水速率達(dá)到22.14%/h，顯著高于種皮破損種子的吸水速率(16.44%/h，p<0.05)；種皮完整種子和種皮破損種子在緩慢吸水期的吸水速率分別為1.06%/h和1.00%/h，兩者之間差異不顯著。

2.5 溫度對(duì)種子萌發(fā)的影響

溫度對(duì)對(duì)葉百部種子的萌發(fā)影響顯著，種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均隨溫度升高呈先增后降的趨勢(shì)(圖5)。對(duì)葉百部種子的最佳發(fā)芽溫度為30 ℃，發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)分別為64.67%和42.67%。當(dāng)溫度偏離最佳發(fā)芽溫度后，種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均顯著降低，其中溫度為20 ℃時(shí)，發(fā)芽勢(shì)降為0，發(fā)芽率僅為2.67%；當(dāng)溫度為35 ℃，種子發(fā)芽率降低至5.33%，發(fā)芽勢(shì)降為0.67%；溫度為40 ℃，發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均為0。

注 ：不同大寫字母表示發(fā)芽率差異顯著，不同小寫字母表示發(fā)芽勢(shì)差異顯著(p<0.05)。圖5 不同溫度下對(duì)葉百部種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)Fig.5 Germination rate and germination potential of S. tuberosa seeds in different temperature

不同溫度條件下對(duì)葉百部種子萌發(fā)進(jìn)程差異顯著(圖6)。30 ℃和25 ℃條件下種子最先萌發(fā)，發(fā)芽時(shí)滯為14 d，35 ℃和20 ℃條件下發(fā)芽時(shí)滯分別為18 d和24 d。比較不同溫度下日萌發(fā)種子數(shù)可知，30 ℃條件下種子萌發(fā)進(jìn)程最快，日萌發(fā)種子數(shù)呈現(xiàn)先增后減趨勢(shì)，并在第20天達(dá)到峰值。

圖6 不同溫度條件下對(duì)葉百部種子萌發(fā)進(jìn)程Fig.6 Germination process of S. tuberosa seeds in different temperatures

2.6 種皮對(duì)種子萌發(fā)的影響

種皮對(duì)對(duì)葉百部種子的萌發(fā)影響顯著(圖7)。種皮完整種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)分別為59.33%和38.00%；剝除胚根端種皮的種子，種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)增加到86.67%和80.67%，較種皮完整組分別提高46.08%和112.29%。

圖7 種皮對(duì)對(duì)葉百部種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的影響Fig.7 Effect of seed coat on germination rate and germination potential of S. tuberosa seeds

種皮對(duì)對(duì)葉百部種子的萌發(fā)進(jìn)程影響顯著，剝除胚根端的種皮后種子發(fā)芽時(shí)滯顯著縮短(圖8)。種皮完整的種子發(fā)芽時(shí)滯為12 d，在第18天日萌發(fā)種子數(shù)達(dá)到峰值，從開(kāi)始萌發(fā)到日萌發(fā)種子數(shù)達(dá)峰值用時(shí)6 d；剝除胚根端的種皮后，種子發(fā)芽時(shí)滯縮短至6 d，僅為種皮完整組的1/2，并在第8天達(dá)到日萌發(fā)種子數(shù)峰值，從開(kāi)始萌發(fā)到日萌發(fā)種子數(shù)達(dá)峰值僅用時(shí)2 d，為種皮完整組的1/3。

圖8 種皮對(duì)對(duì)葉百部種子萌發(fā)進(jìn)程的影響Fig.8 Effect of seed coat on germination process of S. tuberosa seeds

2.7 儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)種子萌發(fā)的影響

儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)對(duì)葉百部種子萌發(fā)影響顯著，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加，種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均顯著降低(圖9)。2021年采收的種子(儲(chǔ)存4個(gè)月)發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)分別為64.67%和42.67%；2020年采收的種子(儲(chǔ)存16個(gè)月)發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)分別低至11.33%和7.33%，僅為2021年采收種子的1/6左右；2019年采收的種子(儲(chǔ)存28個(gè)月)發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均為0，已經(jīng)喪失萌發(fā)能力。

圖9 儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)對(duì)葉百部種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的影響Fig.9 Effects of storage time on germination rate and germination potential of S. tuberosa seeds

儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)對(duì)葉百部種子萌發(fā)進(jìn)程的影響顯著(圖10)。儲(chǔ)存4個(gè)月的種子萌發(fā)啟動(dòng)時(shí)間比儲(chǔ)存16個(gè)月的種子早2 d，并且在整個(gè)種子萌發(fā)進(jìn)程中，儲(chǔ)存4個(gè)月的種子日萌發(fā)數(shù)均高于儲(chǔ)存16個(gè)月的種子。

圖10 儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)對(duì)葉百部種子萌發(fā)進(jìn)程的影響Fig.10 Effects of storage time on germination process of S. tuberosa seeds

3 討 論

種子的形態(tài)特征在遺傳上呈相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，對(duì)植物科、屬、種分類和鑒定具有重要意義[17-18]。對(duì)葉百部種子表型性狀特異，種皮表面不僅具有獨(dú)特的縱向槽紋，同時(shí)具有豐富的胚珠遺跡，包括種柄、內(nèi)臍、種脊及隱藏的發(fā)芽口等結(jié)構(gòu)。以上的形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征均可作為種屬鑒定的重要依據(jù)。同葉、花、果等其他器官組織一樣，種子的形態(tài)特征在種內(nèi)同樣存在著變異，在一定程度上可反映種群的遺傳多樣性[19]。對(duì)葉百部種子形態(tài)學(xué)指標(biāo)變異較大，變異系數(shù)均超過(guò)11%，最大達(dá)到20.05%，表明本實(shí)驗(yàn)樣品采收區(qū)的對(duì)葉百部種群內(nèi)部遺傳多樣性豐富。

溫度是種子萌發(fā)必要的外部條件之一，溫度過(guò)高或過(guò)低會(huì)使膜的透性、膜結(jié)合的活性和酶變性而影響萌發(fā)[20-21]。對(duì)于多數(shù)種子植物來(lái)說(shuō)，種子適宜發(fā)芽溫度具有一定范圍，偏離最適發(fā)芽溫度5～10 ℃仍然可以保持較高的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)[22-23]。而本研究表明，對(duì)葉百部種子的萌發(fā)對(duì)溫度極度敏感，低于或高于最適溫度后種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均急劇下降，甚至不發(fā)芽，表現(xiàn)出對(duì)溫度的狹窄適應(yīng)性。這一現(xiàn)象在瀕危植物中較為常見(jiàn)，星油藤[24]、海南龍血樹(shù)[25]、合柱金蓮木[26]、紅欖李[27]等瀕危植物的種子萌發(fā)均表現(xiàn)出對(duì)溫度不同程度的狹窄適應(yīng)性。對(duì)葉百部種子萌發(fā)對(duì)溫度的狹窄適應(yīng)性預(yù)示著野外條件下其種子的萌發(fā)率低，種群恢復(fù)和更新能力差，這也許是大量人工采挖導(dǎo)致對(duì)葉百部野生資源逐步枯竭的重要原因。

種子休眠是植物界中普遍存在的現(xiàn)象，是植物為長(zhǎng)期有效抵抗外界惡劣環(huán)境而產(chǎn)生的適應(yīng)性機(jī)制，對(duì)物種的延續(xù)和進(jìn)化具有重要意義[28-29]。不同植物種子致眠因素不盡相同，Baskin等[30]將種子的休眠劃分為生理休眠、形態(tài)休眠、形態(tài)生理休眠、物理休眠以及綜合休眠等五大類。本研究中種皮完整種子在整個(gè)吸脹過(guò)程中的吸水率高于種皮破損種子，表明種皮的存在并不影響內(nèi)部種仁的吸脹過(guò)程，且外部種皮的吸水性和持水性要高于內(nèi)部種仁，這與對(duì)葉百部種皮增厚部分呈現(xiàn)海綿狀結(jié)構(gòu)相吻合，這一現(xiàn)象在山鳶尾、玉蟬花、燕子花等鳶尾屬植物中同樣存在[31]。后續(xù)的萌發(fā)特性研究表明，種皮完整種子在最適溫度條件下并不能立即萌發(fā)，而是存在12 d左右的短暫休眠。當(dāng)種子胚根端的種皮被剝除后，種子的發(fā)芽時(shí)滯縮短100%，同時(shí)發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)提高46.08%和112.29%。綜上結(jié)果表明，對(duì)葉百部種皮具良好的透性，但對(duì)胚根的萌發(fā)存在機(jī)械阻礙，屬于典型的物理休眠。

實(shí)際生產(chǎn)中，種子從采收到播種往往需要經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的儲(chǔ)藏，在此過(guò)程中種子活力會(huì)逐漸降低，甚至喪失萌發(fā)能力[32]。對(duì)葉百部種子儲(chǔ)存過(guò)程中，種子的生活力、發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均隨儲(chǔ)存時(shí)間的增加而迅速降低，儲(chǔ)存16個(gè)月后種子基本喪失萌發(fā)能力，屬短命型種子[33]。在利用TTC染色法對(duì)種子生活力的測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，胚被染色的種子其胚乳均被染色，而胚乳被染色的種子其胚不一定被染色，表明對(duì)葉百部種子老化過(guò)程中，胚組織先于胚乳組織喪失活力，這一現(xiàn)象在檀香種子中較為突出[34]。鑒于對(duì)葉百部種子不耐儲(chǔ)存特性，因此生產(chǎn)中種子宜采用當(dāng)年采收當(dāng)年播種的方式進(jìn)行育苗。