張開惠,劉源,崔艷,吳昊芬,徐永俊,馬子煜,季艷偉

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西 楊凌,712100)

食品安全仍是當(dāng)今世界范圍內(nèi)的首要問題之一,世界衛(wèi)生組織指出,多種疾病和失調(diào)均與食品安全有關(guān),食品安全已被世界衛(wèi)生組織列為高度優(yōu)先事項(xiàng)[1],因此,建立保障食品安全的檢測(cè)體系顯得尤為重要。目前,常用的儀器分析方法如高效液相色譜法、氣相色譜法、質(zhì)譜法等,雖然具有特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn),但往往需要繁瑣的前處理步驟和檢測(cè)過程、昂貴的儀器設(shè)備、專業(yè)化的技術(shù)人員及較長(zhǎng)的檢測(cè)周期,不適用于快速篩查和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[2-3]?；诳乖贵w特異性反應(yīng)的免疫學(xué)檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、成本低、易于商業(yè)化生產(chǎn)且可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn),在食品安全快速檢測(cè)中已得到了廣泛應(yīng)用[4-5]。

目前,常用的免疫學(xué)檢測(cè)方法如酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和免疫層析檢測(cè)法,多采用針對(duì)一種靶分子的單克隆抗體進(jìn)行特異性檢測(cè)(圖1-A),但由于食品成分復(fù)雜,食品中往往含有多種結(jié)構(gòu)類似的危害物,如生物毒素、農(nóng)獸藥殘留及非法添加物等。當(dāng)多種同類危害物共存時(shí),由于危害物間毒性機(jī)理相似,即使單個(gè)危害物不超標(biāo),食品仍存在很大的毒性積累風(fēng)險(xiǎn)[6],而針對(duì)多種危害物的同時(shí)檢測(cè)方法既能提供更加豐富的樣品信息從而降低假陰性結(jié)果,又能減少檢測(cè)時(shí)間和成本,因此已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品安全快速檢測(cè)領(lǐng)域[7]。目前,針對(duì)多種危害物的同時(shí)檢測(cè)方法多采用不同信號(hào)標(biāo)記材料對(duì)多個(gè)不同抗體分別進(jìn)行標(biāo)記,或者僅用一種標(biāo)記材料,通過將多個(gè)不同抗體分別固定在不同區(qū)域,一次加樣檢測(cè),獲得多種被分析物的信號(hào)(圖1-B)。然而,“并聯(lián)式”檢測(cè)區(qū)域設(shè)計(jì)及制備的復(fù)雜性隨著檢測(cè)區(qū)域數(shù)量的增加而增加,并且樣品溶液在通過多個(gè)檢測(cè)區(qū)域時(shí)流量變化的不確定性將影響其檢測(cè)的準(zhǔn)確性[8]。還有文獻(xiàn)報(bào)道采用多克隆抗體實(shí)現(xiàn)多種危害物的同時(shí)檢測(cè),雖然多克隆抗體易制備、生產(chǎn)成本低,但其組分不單一、特異性較低、批次間差異較大的特點(diǎn)導(dǎo)致基于多克隆抗體的檢測(cè)方法不穩(wěn)定,較難滿足市場(chǎng)需求。相比于多克隆抗體,廣譜性抗體基于一類或幾類物質(zhì)的共有結(jié)構(gòu)而實(shí)現(xiàn)對(duì)這一類或幾類物質(zhì)的廣譜性識(shí)別[9]。相較于“并聯(lián)式”檢測(cè)方法,基于廣譜性抗體的多危害物檢測(cè)方法憑借“以一代多”的特點(diǎn)使其具有更低的成本和更高的檢測(cè)效力,在大批量樣品的初步、快速篩查中具有重要意義(圖1-C)。

本文主要綜述廣譜性抗體的制備方法,提高廣譜性抗體的廣譜性及親和力的常用策略,以及其在毒素類、農(nóng)獸藥類殘留和其他常見食品危害物檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀。

A-單一危害物的免疫層析檢測(cè)法;B-針對(duì)多種危害物的多重免疫層析法;C-基于可識(shí)別4種危害物的廣譜性抗體的免疫層析檢測(cè)法圖1 基于免疫層析檢測(cè)法檢測(cè)樣品中的4種危害物Fig.1 Detection of four kinds of hazards in samples based on immunochromatography

1 廣譜性抗體的制備方法

廣譜性抗體是廣譜性免疫學(xué)檢測(cè)方法的核心識(shí)別元件,抗原的設(shè)計(jì)及合成是制備廣譜性抗體的關(guān)鍵步驟?？乖O(shè)計(jì)和合成的方法主要有以下3種:混合抗原法、多重抗原法及基于共同抗原表位的通用型結(jié)構(gòu)抗原法,除此之外,還可以通過基因突變等基因工程手段進(jìn)一步提高抗體的廣譜性和親和力。

1.1 混合抗原法

混合抗原指多種抗原的混合物組成的免疫原,來自不同免疫原的多種抗原表位有利于刺激更多樣的B細(xì)胞的增殖從而增加在單細(xì)胞融合時(shí)產(chǎn)生各種雜交瘤細(xì)胞系的機(jī)會(huì),為廣譜性抗體的產(chǎn)生和篩選奠定了基礎(chǔ)。混合抗原法一般是指以混合抗原作為免疫原進(jìn)行免疫后,采集小鼠血清進(jìn)行效價(jià)測(cè)定,選擇產(chǎn)生高效價(jià)血清的小鼠,分離其脾細(xì)胞用于后續(xù)的細(xì)胞融合和篩選工作,利用間接ELISA篩選廣譜性單克隆抗體(圖2),將對(duì)應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞腹腔注射到小鼠體內(nèi),大量生產(chǎn)目標(biāo)廣譜性單克隆抗體。除產(chǎn)生廣譜性抗體之外,混合抗原法還能產(chǎn)生對(duì)單個(gè)抗原特異性更高的單克隆抗體,可以同時(shí)滿足對(duì)這2種抗體的需求。

混合抗原法已經(jīng)應(yīng)用于較多的領(lǐng)域。LIU等[10]采用氟喹諾酮類藥物的6種人工合成抗原的混合物作為免疫原(每種免疫原0.5 mg),篩選得到一株廣譜性單克隆抗體,該株抗體除不識(shí)別氟甲喹外,針對(duì)其他5種免疫原的IC50分別為0.1～132.28 ng/mL。DONG等[11]采用7種蘇云金桿菌Cry1類毒素的混合物(每種毒素各70 μg)作為免疫原進(jìn)行免疫后,采用間接ELISA篩選得到一株能識(shí)別7種Cry1毒素的廣譜性抗體,采用雙抗夾心ELISA法進(jìn)行測(cè)定,其針對(duì)7種毒素的檢出限在6.37～11.35 ng/mL。PENG等[12]通過在諾氟沙星和沙氟沙星的哌嗪環(huán)上引入6-溴己酸,使抗原抗體相互作用的關(guān)鍵表位即 3位羧基和1位烷基充分暴露制得諾氟沙星衍生物和沙氟沙星衍生物,以衍生物的混合物作為半抗原,最終免疫制得了能識(shí)別32種(氟)喹諾酮類抗生素的廣譜性抗體。

采用混合抗原法制備廣譜性抗體具有簡(jiǎn)單高效的特點(diǎn),但存在一些問題,如混合抗原中每種抗原的免疫原性不同,優(yōu)勢(shì)抗原往往產(chǎn)生高親和力的抗體,而免疫原性弱的抗原產(chǎn)生的抗體親和力較低或丟失[13]。

圖2 采用混合抗原免疫動(dòng)物后制備廣譜性單克隆抗體Fig.2 Preparation of broad-spectrum monoclonal antibodies by immunizing animals with mixed antigens

1.2 多重抗原法

多重抗原是指幾種半抗原與單個(gè)蛋白質(zhì)載體分子偶聯(lián)所得的免疫原,因此也被稱為多抗原表位抗原。多重抗原法將選擇共有結(jié)構(gòu)的過程“設(shè)計(jì)”到抗原抗體特異識(shí)別的免疫過程中,通過多個(gè)抗原決定簇的篩選作用得到廣譜性抗體(圖3)。相較于在半抗原設(shè)計(jì)過程中尋找“共性”的通用型結(jié)構(gòu)抗原,通過控制與載體蛋白結(jié)合的半抗原的種類,可以確定誘導(dǎo)所產(chǎn)生抗體的識(shí)別譜,如果結(jié)合通用型半抗原技術(shù),則能進(jìn)一步拓寬抗體的識(shí)別譜,可以滿足對(duì)不同危害物和特殊產(chǎn)品的檢測(cè)需求。WANG等[14]將4種不同農(nóng)藥的半抗原偶聯(lián)至牛血清白蛋白制備多重抗原,篩選得到的抗體對(duì)4種農(nóng)藥半抗原的IC50分別為 0.29、0.07、0.58和2.82 μg/mL。ZHANG等[15]以對(duì)硫磷半抗原和吡蟲啉半抗原分別與牛血清白蛋白偶聯(lián)制備多抗原表位免疫原,建立了一種基于廣譜多克隆抗體的異源間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法,用于對(duì)硫磷和吡蟲啉的檢測(cè)。

制備多半抗原免疫原時(shí),較難控制不同半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)比,導(dǎo)致產(chǎn)生的抗體對(duì)不同分析物的親和力不一致且較低。雖然高劑量的免疫原在一定程度上有利于拓寬抗體的識(shí)別譜[16],但廣譜性抗體的親和力也會(huì)隨著多半抗原免疫原中半抗原數(shù)量的增加而降低,很可能是因?yàn)槎喟肟乖庖咴谋砻娌焕诹馨图?xì)胞對(duì)載體蛋白的識(shí)別,導(dǎo)致免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)不良[17]。因此,目前仍無法獲得具有同等效力且親和力較高的最佳多重免疫原。

圖3 采用多半抗原免疫原制備廣譜性抗體Fig.3 Preparation of broad-spectrum antibodies with multi-hapten immunogens

1.3 基于共同抗原表位的通用型結(jié)構(gòu)抗原法

同一類污染物如農(nóng)獸藥殘留和真菌毒素,具有相同的母體結(jié)構(gòu)。采用結(jié)構(gòu)類似物的母體結(jié)構(gòu)進(jìn)行半抗原的設(shè)計(jì),并制備完全抗原,免疫動(dòng)物后所得到的抗體往往可以同時(shí)識(shí)別多種具有免疫原母體結(jié)構(gòu)的危害物。通用型結(jié)構(gòu)抗原的設(shè)計(jì)合成一般包括半抗原的設(shè)計(jì)、半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成完整抗原及免疫產(chǎn)生抗體三步。選擇合適的半抗原是制備廣譜性抗體和開發(fā)廣譜性免疫分析方法的關(guān)鍵步驟,而結(jié)構(gòu)相似性是選擇半抗原的基礎(chǔ)[18],因此,以某些結(jié)構(gòu)類似物共有的“中心基團(tuán)”為分子模板,結(jié)合分子大小、立體化學(xué)、電子特性、活性基團(tuán)、活性位點(diǎn)等指標(biāo)設(shè)計(jì)半抗原是較為常用的方式。小分子污染物通過肟化活潑酯法、氨甲基化法、混合酸酐法、環(huán)氧化物法、半縮醛法、烯醇醚衍生物法與載體蛋白偶聯(lián)得到完全抗原后通過免疫、細(xì)胞融合及篩選即可得到相應(yīng)的廣譜性抗體[19]。MARI等[20]通過對(duì)硝呋喃嗪代謝物進(jìn)行分子改造合成半抗原,通過偶聯(lián)載體蛋白得到完全抗原,免疫后最終獲得能識(shí)別 4 種雞體內(nèi)4-羥基苯肼的廣譜單克隆抗體。

隨著計(jì)算科學(xué)、量子化學(xué)、分子動(dòng)力學(xué)等學(xué)科理論的發(fā)展,以及分子模擬技術(shù)、計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)、網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)分析技術(shù)等的進(jìn)步,建模式半抗原的制備也逐漸成為研究熱點(diǎn),通過數(shù)據(jù)庫(kù)檢索氨基酸序列、相關(guān)軟件比較確定高度相似序列,進(jìn)而通過專業(yè)網(wǎng)站建模、評(píng)估,找出某些結(jié)構(gòu)類似物的重疊區(qū)域,即為所需要的目標(biāo)序列,表達(dá)純化后即可得到相應(yīng)的“人工”半抗原。如DONG等[21]從GenBank中檢索出7種主要的蘇云金桿菌Cry1類毒素：Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1E和Cry1F的氨基酸序列,利用DNAMAN軟件進(jìn)行比較,確定高度相似的序列,利用DNA Star軟件計(jì)算抗原表位的抗原性和親水性,將Cry1Aa和Cry1Ac的X射線晶體結(jié)構(gòu)作為模型,由SWISS-MODEL網(wǎng)站建模,并通過Ra machadran plot、ERRAT和Verify 3D進(jìn)行評(píng)估,然后用SWISS-Pdb Viewer 4.1.0軟件對(duì)模型進(jìn)行分析,找出7種Cry1毒素的重疊區(qū)域。綜合考慮這些分析結(jié)果,確定了序列和空間構(gòu)象相似性高、抗原性和親水性強(qiáng)的目標(biāo)序列,并合成多肽。以合成的多肽作為半抗原,最終制備了一種能同時(shí)識(shí)別7種主要Cry1類毒素的單克隆抗體,且具有較好的親和力(1.36×10-8～5.17×10-8mol/L)(圖4)。

1.4 通過基因突變提高廣譜性抗體的廣譜性和親和力

通過前文所述的3種方法獲得廣譜性抗體后,可以借助基因突變等基因工程技術(shù)進(jìn)一步提高廣譜性抗體的廣譜性和親和力,基因突變主要分為隨機(jī)突變和定點(diǎn)突變2種(圖5)。

簡(jiǎn)便、快速的隨機(jī)突變方法結(jié)合有效的篩選策略(如借助噬菌體展示技術(shù)或核糖體展示技術(shù)進(jìn)行篩選)有助于獲得親和力更高的抗體。LEIVO等[22]通過隨機(jī)突變使得一種識(shí)別喹諾酮類藥物的抗體的親和力顯著提高,使其對(duì)沙氟沙星的IC50降低20倍以上,對(duì)馬波沙星的IC50降低近3倍。

通過預(yù)測(cè)抗原抗體識(shí)別的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn),并利用定點(diǎn)突變的方法將目標(biāo)氨基酸的1 個(gè)位置或多個(gè)位置被其他19種氨基酸隨機(jī)替換,從而使抗體的廣譜性及親和力發(fā)生變化,選擇突變后廣譜性和親和力均提高的抗體,這種改性的方法同樣也適用于廣譜性抗體。WEN等[23]為了制備能夠識(shí)別喹諾酮類藥物的通用抗體,以諾氟沙星單克隆抗體為基礎(chǔ)制備了可識(shí)別17種常見的喹諾酮類藥物的廣譜性單鏈抗體,為了進(jìn)一步提高其廣譜性和親和力,采用同源建模構(gòu)建抗體的結(jié)構(gòu),分析了關(guān)鍵氨基酸殘基并對(duì)抗體中的抗原互補(bǔ)決定區(qū)3(complementarity determining region 3,CDR3)的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變,最終篩選得到了既保留了對(duì)以上17種喹諾酮類藥物的廣譜性,又可特異性識(shí)別沙拉沙星、二氟沙星和曲伐沙星的高親和抗體。ZHONG等[24]利用定點(diǎn)突變的方法增強(qiáng)單鏈抗體的廣譜性,最終獲得一種可以識(shí)別5種Cry1Ab毒素的廣譜性抗體突變體D9。JIAO等[25]采用同源建模和分子對(duì)接技術(shù)分析了Cry1Ab毒素單域抗體A8與5種Cry1毒素的關(guān)鍵氨基酸結(jié)合位點(diǎn),然后對(duì)關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行位點(diǎn)飽和突變。最后篩選出針對(duì)多種Cry1毒素的高親和力廣譜性抗體,比親本親和力高20倍。

A-Cry1類毒素結(jié)構(gòu)分析;B-探尋Cry1類毒素共有結(jié)構(gòu)及氨基酸,合成多肽抗原并進(jìn)行免疫;C-基于廣譜性抗體的7種Cry1類毒素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線分析圖4 Cry1類毒素免疫原設(shè)計(jì)、合成及廣譜性抗體制備Fig.4 Immunogen design, synthesis, and broad-spectrum antibody preparation of toxoid Cry1

近年來定點(diǎn)突變與虛擬突變和虛擬篩選的聯(lián)合使用為提高廣譜性抗體的親和力提供了新的策略。WANG等[26]在已經(jīng)制得的針對(duì)12種氟喹諾酮類藥物的廣譜性抗體的基礎(chǔ)上,結(jié)合虛擬突變的結(jié)果,將單鏈抗體的 Tyr99 定向突變?yōu)?His,結(jié)果表明,突變體對(duì)12種藥物的靈敏度提高了 7 倍,對(duì) 12 種藥物的檢測(cè)限為0.3～8.0 ng/mL。

同源建模及分子對(duì)接等生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展雖然使得構(gòu)建的結(jié)構(gòu)模型的準(zhǔn)確性得到了顯著提高,但其構(gòu)建的三維模型與真實(shí)的結(jié)構(gòu)仍然存在差異,并不能完全反映其真實(shí)結(jié)構(gòu),仍存在一定的發(fā)展空間。

圖5 提高廣譜性抗體的廣譜性和親和力的主要方法Fig.5 Main methods for improving the corss-reactivity and affinity of broad-spectrum antibodies

2 廣譜性抗體在食品安全快速檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀

2.1 食品中毒素類危害物的檢測(cè)

食品中毒素類危害物種類繁多,真菌毒素和藻類毒素是食物中主要的2種生物毒素。真菌毒素的主要種類有黃曲霉毒素(aflatoxins,AFS)、玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)、脫氧雪腐鐮刀菌醇(deoxyni- valenol,DON)等,其普遍存在于玉米、大米、小麥、油、牛奶、水果及相關(guān)加工產(chǎn)品中,大部分真菌毒素具有致癌、致畸性、致突變、免疫毒性、肝毒性、神經(jīng)毒性、皮膚毒性等多種毒性作用[27]。藻類毒素主要包括肝毒素、神經(jīng)毒素和內(nèi)毒素,藻類毒素能夠引起腹瀉、神經(jīng)麻痹、肝損傷、中毒甚至死亡[28]。因此食品中的真菌毒素、藻類毒素的高通量檢測(cè)對(duì)保障食品安全具有重要意義。每一類毒素的結(jié)構(gòu)相似性(如ZEN都有與雌激素相似的結(jié)構(gòu);AFS基本結(jié)構(gòu)中都有二呋喃環(huán)和氧雜萘鄰?fù)猍19]等)為廣譜性抗體的創(chuàng)制及應(yīng)用提供了可行性。

WANG等[29]根據(jù)ZEN的分子結(jié)構(gòu)和活性部位,設(shè)計(jì)了人工抗原,研究得出用肟化活性酯法制備免疫原ZEN-牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)免疫動(dòng)物,獲得的針對(duì)ZEN及其類似物的廣譜性抗體最優(yōu),并且WANG等[30]利用該抗體建立了針對(duì)ZEN及其5個(gè)同系物的異源間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA免疫檢測(cè)法。張海棠等[19]根據(jù)黃曲霉毒素B1(AFB1)的分子結(jié)構(gòu)和活性位點(diǎn),合成人工抗原AFB1-BSA,最終制備出了高效價(jià)、靈敏、廣譜的AFB1單克隆抗體。LU等[31]通過將微囊藻毒素(Microcystin,MC)中的MC-LR和鑰孔戚血藍(lán)蛋白偶聯(lián),最終免疫獲得能夠同時(shí)檢測(cè)9種微囊藻毒素和結(jié)核素的廣譜性抗體,并通過異源包被策略來提高檢測(cè)的靈敏度,最終建立了一種廣譜、高靈敏的競(jìng)爭(zhēng)性間接酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法。

2.2 食品中農(nóng)獸藥殘留的檢測(cè)

農(nóng)藥用于控制、調(diào)節(jié)、預(yù)防或驅(qū)除影響植物生長(zhǎng)的疾病、雜草、昆蟲和害蟲[32]。獸藥在養(yǎng)殖實(shí)踐中通常用于預(yù)防治療疾病、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。農(nóng)藥和獸藥的合理使用可以防止農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)的破壞性損失,從而滿足全球人口增長(zhǎng)的需求。然而,過度使用或?yàn)E用殺蟲劑和獸藥會(huì)導(dǎo)致這些物質(zhì)在食品中殘留,并通過食物鏈進(jìn)入人體,產(chǎn)生累積毒性、細(xì)菌耐藥性等一系列危害,對(duì)人體健康構(gòu)成威脅,因此,農(nóng)藥和獸藥殘留的高效檢測(cè)是一個(gè)重要的全球性食品安全問題[33]。大部分農(nóng)獸藥均屬于家族類小分子化合物,因此,廣譜性抗體的應(yīng)用為農(nóng)獸藥殘留提供了新的高效檢測(cè)思路。

SHI等[34]制備了一種可以同時(shí)識(shí)別氯丙嗪、異丙嗪、乙酰丙嗪等5種吩噻嗪類藥物的廣譜單克隆抗體,并利用定點(diǎn)誘變技術(shù)將抗體輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2的Phe 164突變?yōu)镻ro 164,制得了一種單鏈抗體基因突變體,突變體對(duì)5種藥物的親和力得到較大提升。LI等[35]利用合理設(shè)計(jì)的4-[(4-氨基苯基)磺酰基-氨基]-2-甲氧基苯甲酸半抗原與牛血清白蛋白進(jìn)行生物偶聯(lián),制備了抗磺胺類藥物的廣譜、高親和力的多克隆抗體(pAb)[35]。GALVIDIS等[36]將2種具有廣譜性的單克隆抗體結(jié)合使用,建立了一種雙競(jìng)爭(zhēng)性?shī)A心酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法,該法適用于測(cè)定14種磺胺類藥物的最大殘留限量濃度。CHEN等[37]研究了喹諾酮類藥物與以吡哌酸為半抗原所產(chǎn)生抗體之間的交叉反應(yīng)性,并與已報(bào)道的交叉反應(yīng)性數(shù)據(jù)及半抗原組成進(jìn)行比較,分析了抗原抗體的三維定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系,結(jié)果表明,形狀像字母“Y”的半抗原構(gòu)象對(duì)于產(chǎn)生具有廣譜性和高交叉反應(yīng)性的抗體具有關(guān)鍵作用,該研究結(jié)果對(duì)準(zhǔn)確設(shè)計(jì)半抗原、預(yù)測(cè)抗體的特異性以及更好地理解抗原和抗體之間的識(shí)別機(jī)制具有重要意義。LIU等[38]利用分子模型和主成分分析選擇合適的半抗原,最終建立了一種針對(duì)10種三嗪類除草劑的廣譜性異源免疫測(cè)定法。王弘等[39]從噬菌體展示納米抗體文庫(kù)中篩選得到了一種針對(duì)二乙氧基有機(jī)磷農(nóng)藥的納米抗體,該納米抗體能夠檢測(cè)多種二乙氧基有機(jī)磷,且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好。YIN等[40]針對(duì)α-玉米赤霉醇(α-zearalanol,α-ZAL)類化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),制備出可同時(shí)識(shí)別6種α-ZAL類化合物的高靈敏廣譜單克隆抗體,建立了能同時(shí)檢測(cè)多種α-ZAL類化合物的酶聯(lián)免疫吸附法。WANG等[41]根據(jù)全息圖和三維定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系得出β-激動(dòng)劑半抗原上有2個(gè)影響抗體特異性的關(guān)鍵結(jié)合表位,且C-2′表位上的叔丁基是產(chǎn)生廣譜性抗體的必要條件,本研究最終開發(fā)了一種可用于識(shí)別23種β-激動(dòng)劑和類似物的競(jìng)爭(zhēng)抑制酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法。表1為更詳細(xì)的廣譜性抗體在農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用舉例。

表1 廣譜性抗體在農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用Table 1 Application of broad-spectrum antibodies in detection of pesticide and veterinary drug residues

2.3 其他

除了在毒素污染和農(nóng)藥殘留檢測(cè)方面的應(yīng)用,廣譜性抗體還被廣泛應(yīng)用于其他多種危害物的高通量檢測(cè),如作為口服藥使用的磺酰脲類藥物、混入食物中的植物毒素生物堿、肉類食品中的蛋白質(zhì)經(jīng)加工后產(chǎn)生的雜環(huán)胺、作為抗生素的青霉素、動(dòng)物體內(nèi)的雄激素等。

磺酰脲類藥物是一類廣泛應(yīng)用于臨床治療的降2型糖尿病藥物,然而,近年來,為了改善聲稱的抗糖尿病活性,人們往往在多種草藥茶中非法摻假。當(dāng)處于最低能量構(gòu)象時(shí),所有的磺酰脲類藥物都具有相似的J型構(gòu)象和分子靜電勢(shì)等值面。XIE等[51]合理設(shè)計(jì)了一種新型半抗原,并開發(fā)出一種可以識(shí)別9種磺脲類藥物的廣譜性單克隆抗體,為多種涼茶產(chǎn)品中非法摻假成分的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了一種高效快速的方法。生物堿大多數(shù)有復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu),氮素多包含在環(huán)內(nèi),有顯著的生物活性。WANG等[52]通過研究10種主要生物堿及其代謝物的結(jié)構(gòu)選取合適的半抗原,最終得到了一種廣譜的抗生物堿單克隆抗體,并以此為基礎(chǔ)開發(fā)了一種間接競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法,可以用于快速篩查豬尿、豬肉和谷類面粉樣品中的阿托品、東莨菪堿、高阿托品、茴香堿、茴香堿和L-羥胺的殘留。雜環(huán)胺(heterocyclic aromatic amines,HAAs)是在高溫烹調(diào)加工各種蛋白質(zhì)含量豐富的食品時(shí)產(chǎn)生的一類具有致突變、致癌作用的物質(zhì),研究表明,長(zhǎng)期食用含雜環(huán)胺的熟肉制品,可增加癌癥的發(fā)生率,特別是結(jié)、直腸部位。SHENG等[53]通過合成半抗原最終得到一種可以同時(shí)測(cè)定8種HAAs的廣譜性抗體,用于檢測(cè)加熱處理肉類中的雜環(huán)胺殘留。青霉素是最常用的一類廣譜抗生素,含有共同的母核結(jié)構(gòu),不同的青霉素之間由不同側(cè)鏈結(jié)構(gòu)予以區(qū)分,獸醫(yī)臨床上常把它作為消炎抗感染的首選藥使用,但治療人員為了追求治療效果,出現(xiàn)了濫用或超劑量使用的現(xiàn)象,造成藥物在動(dòng)物體內(nèi)的殘留[54]。劉偉怡等[55]通過活潑酯法將青霉素G(penicillin,PEN)合成人工抗原PEN-BSA和PEN-卵清蛋白,將PEN-BSA免疫新西蘭大白兔獲得可以同時(shí)測(cè)定8種青霉素類抗生素的多克隆抗體,并建立了異源ELISA檢測(cè)法用于測(cè)定牛奶中青霉素類抗生素的殘留。動(dòng)物可食用組織中雄激素的殘留具有多種危害,如造成頭痛、胸悶、心悸、肌肉疼痛、禿發(fā)、內(nèi)分泌紊亂、染色體畸變和生殖毒性。雄激素是常見的甾體結(jié)構(gòu)化合物之一,主要區(qū)別在C-17或C-19位的甲基末端取代基上,不同的雄激素在空間構(gòu)象上具有一定的相似性,這為通用抗體的制備提供了可能。GAO等[56]使用MT-CMO-KL作為半抗原制備廣譜性抗體,最終開發(fā)了一種準(zhǔn)確度高的用于檢測(cè)動(dòng)物可食用組織中多種雄激素殘留物的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法。

由上可知,某一類危害物的結(jié)構(gòu)相似性為廣譜性抗體的制備及應(yīng)用提供了理論依據(jù),針對(duì)更多危害物的廣譜免疫學(xué)檢測(cè)法也將因其“高效、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便”的特點(diǎn)得到更廣泛的應(yīng)用,為不同領(lǐng)域帶來經(jīng)濟(jì)安全雙效益保障。

3 廣譜性抗體在食品安全快速檢測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì)

廣譜性抗體在食品安全領(lǐng)域的開發(fā)與應(yīng)用目前主要有2個(gè)問題:(1)半抗原設(shè)計(jì)盲目性仍較高,“試錯(cuò)”法仍然是大部分研究所用的方法;(2)廣譜性抗體的檢測(cè)靈敏度普遍較低,一些創(chuàng)新性的研究針對(duì)這2個(gè)問題做出了解答,同時(shí)也對(duì)廣譜性抗體的未來研究方向有一定的指導(dǎo)作用。

盡管制備廣譜性抗體有多種方法,但是通用型結(jié)構(gòu)抗原法是使用最廣泛的方法,半抗原的設(shè)計(jì)是該法中的關(guān)鍵性步驟,目前大多數(shù)研究中仍然使用二維的共性結(jié)構(gòu)分析加實(shí)驗(yàn)“試錯(cuò)”的方法篩選所需的半抗原,由于抗原的立體化學(xué)和電子性質(zhì)在與抗體的相互作用中起著重要作用,因此半抗原的設(shè)計(jì)不應(yīng)僅考慮二維結(jié)構(gòu),還應(yīng)考慮三維構(gòu)象以及是否容易獲得等多個(gè)因素[35]。雖然傳統(tǒng)方式也可以進(jìn)一步結(jié)合多方面的信息進(jìn)行精細(xì)篩選,但是能夠模擬特定抗體的交叉反應(yīng)細(xì)節(jié)且成本低的建模方式,是改進(jìn)傳統(tǒng)“試錯(cuò)式”半抗原設(shè)計(jì)更好的選擇。同時(shí),了解抗原抗體的識(shí)別機(jī)制對(duì)于提高廣譜性抗體的性能以及指導(dǎo)免疫分析方法的建立具有重要作用。

目前廣譜性抗體的檢測(cè)靈敏度并不理想,這與所用的篩選策略和建立的檢測(cè)方法均有關(guān),如研究表明非競(jìng)爭(zhēng)性免疫檢測(cè)法、異源性檢測(cè)方法均可以在一定程度上提高檢測(cè)靈敏度。