唐修君，樊艷鳳，賈曉旭，葛慶聯(lián)，陸俊賢，周 倩，陳大偉，高玉時(shí)*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，揚(yáng)州 225015； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南京210095；3.江蘇省家禽遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225125)

線粒體DNA由于其母系遺傳、獨(dú)立的核外遺傳密碼以及進(jìn)化速率快等獨(dú)有特性，廣泛被用于探討物種遺傳結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化及種質(zhì)資源鑒定研究[1-3]。線粒體D-loop區(qū)又稱(chēng)D-環(huán)區(qū)，為線粒體DNA中的一段非編碼區(qū)，它是線粒體基因組序列上變異最大的區(qū)域，被作為理想的分子標(biāo)記用來(lái)研究親緣關(guān)系較近群體的遺傳起源和種質(zhì)鑒定[4-7]。迄今為止，在雞[8]、山鷓鴣[9]、鴿[10]、鴨[11]、豬[12-13]、牛[14-15]、羊[16-17]、馬[18-19]、驢[20-21]、鹿[22]和小鼠[23]等諸多物種的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育研究中已被成功應(yīng)用。在我國(guó)，將線粒體D-loop區(qū)作為目標(biāo)位點(diǎn)應(yīng)用于地方雞種遺傳多樣性和母系起源研究已成為科研熱點(diǎn)[24-27]。然而其中針對(duì)線粒體優(yōu)勢(shì)單倍型與雞生產(chǎn)性能相關(guān)性的研究甚少。1985年，Bell等[28]研究顯示，由線粒體DNA遺傳效應(yīng)引起的細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)會(huì)影響奶牛的生產(chǎn)性能指標(biāo)，主要包括乳脂率和產(chǎn)奶量等。Toelle等[29]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)母系效應(yīng)對(duì)杜洛克豬和約克夏豬初生重、斷奶重和背膘厚度等均有重要影響。Mannen等[30]研究發(fā)現(xiàn)，線粒體16sRNA的2 232 bp處的堿基替換可作為日本黑牛肉質(zhì)性狀的重要候選基因?？梢?jiàn)，線粒體遺傳效應(yīng)對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)性能具有重要影響。

經(jīng)研究顯示，線粒體D-loop區(qū)遺傳多樣性和單倍型比例在雞母本和后代個(gè)體中嚴(yán)格遵循母系遺傳[31]。然而，自達(dá)爾文提出家雞的祖先為紅色原雞以來(lái)，家雞的母系起源問(wèn)題至今還沒(méi)有明確定論。1994年，F(xiàn)umihito等[32]研究顯示，家雞唯一起源于分布于泰國(guó)東部及其周邊地區(qū)的原雞指名亞種。2008年，Kanginakudru等[33]揭示了分布于印度及其周邊地區(qū)的原雞印度亞種和滇南亞種，其在家雞馴化和選育過(guò)程中也發(fā)揮了重要的作用。2020年，Wang等[34]基于全基因組測(cè)序技術(shù)，系統(tǒng)地比較了來(lái)自于亞洲和歐洲的大量雞種、4種原雞以及紅色原雞5個(gè)亞種共計(jì)863份樣品，分析并提出了家雞可能的起源地以及馴化要地。作為伴隨人類(lèi)農(nóng)業(yè)文明起源和發(fā)展的重要家禽，從源頭上查清我國(guó)地方雞的起源馴化和進(jìn)化關(guān)系，對(duì)當(dāng)前品種的保護(hù)規(guī)劃以及開(kāi)發(fā)利用具有現(xiàn)實(shí)意義。

本研究擬通過(guò)研究不同類(lèi)型肉雞生長(zhǎng)性能情況和線粒體單倍型特性，分析線粒體優(yōu)勢(shì)單倍型與肉雞生長(zhǎng)速度的相關(guān)性；同時(shí)通過(guò)與紅色原雞序列的聚類(lèi)分析，探討不同雞種母系起源，研究結(jié)果將為肉雞配套系選育提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇6個(gè)不同類(lèi)型肉雞品種(配套系)為研究對(duì)象(表1)，其中快大型白羽肉雞品種2個(gè)，分別為AA肉雞和羅斯308；黃羽肉雞品種4個(gè)，根據(jù)不同生長(zhǎng)速度分類(lèi)，分為中快速型黃羽肉雞配套系2個(gè)(禽雁麻雞和裕禾1號(hào)肉雞)；慢速型黃羽肉雞配套系2個(gè)(園豐麻雞2號(hào)和港豐瑤黑麻雞)。其中，中快速型黃羽肉雞多為我國(guó)地方黃羽雞種(父系)與引進(jìn)快大型隱性白羽肉雞(母系)品種雜交選育而成，根據(jù)線粒體的母系遺傳規(guī)律，配套系商品代多含有引進(jìn)快大型隱性白羽肉雞的線粒體遺傳信息。而慢速型黃羽肉雞，為保持我國(guó)地方雞品種的優(yōu)良品質(zhì)，多不引入快大型肉雞血統(tǒng)。AA肉雞和羅斯308受精蛋來(lái)源于國(guó)家家禽生產(chǎn)性能測(cè)定站，其他雞種受精蛋來(lái)源于相關(guān)公司(表1)，每個(gè)雞種收集受精蛋300個(gè)，在同一條件下孵化出雛。

表1 雞種來(lái)源和血液采樣數(shù)

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生產(chǎn)性能測(cè)定 所有雞種統(tǒng)一飼養(yǎng)于國(guó)家家禽生產(chǎn)性能測(cè)定站，按照各自公司提供的飼養(yǎng)規(guī)程飼養(yǎng)管理，生產(chǎn)性能測(cè)定方法參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《家禽生產(chǎn)性能名詞術(shù)語(yǔ)和度量計(jì)算方法》(NY/T 823-2020)執(zhí)行。

1.2.2 血樣采集和總DNA提取 各雞種血液采樣數(shù)見(jiàn)表1，翅靜脈采血，ACD抗凝。參照文獻(xiàn)方法提取血樣基因組總DNA[35]，1.0%瓊脂糖(Promega，美國(guó))凝膠電泳檢測(cè)提取效果。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)和合成 參照紅色原雞線粒體D-loop區(qū)全序列(序列號(hào): NC_007235)，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，PF：5′- AAACACCCAAA- CTCACTAAC-3′；PR：5′-CACTGGGATGCGGA-TACTTGC-3′，擴(kuò)增全長(zhǎng)為1 586 bp，引物交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.4 PCR擴(kuò)增和測(cè)序 采用50 μL擴(kuò)增體系：其中DNA模板2 μL，2×PCR Master Mix(大連寶生物公司)25 μL，10 μmol·L-1上、下游引物各1.5 μL，滅菌雙蒸水20 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，共32個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 10 min。采用1.2%瓊脂糖(Promega，美國(guó))凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增效果，之后交由生工生物工程(上海)股份有限公司完成測(cè)序工作，測(cè)序方法采用Sanger法，所有序列均采用雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

采用SeqMan程序拼接測(cè)序序列，剪去多余片段后通過(guò)BioEdit軟件與紅色原雞參考序列(NC_007235)逐堿基比對(duì)。利用DnaSP 5.10軟件統(tǒng)計(jì)突變位點(diǎn)總數(shù)和單倍型數(shù)等遺傳多樣性信息[36]。利用MEGA 5.05軟件構(gòu)建基于雙參數(shù)遺傳距離的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[37]。利用Network 10.2軟件構(gòu)建中介網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同類(lèi)型肉雞群體生長(zhǎng)性能測(cè)定

本研究測(cè)定了公母雞平均體重約1.8 kg時(shí)不同雞種的日齡和飼料轉(zhuǎn)化比(表2)。結(jié)果顯示，當(dāng)群體平均體重約1.8 kg時(shí)，白羽肉雞約為5周齡，飼料轉(zhuǎn)化比為1.60∶1～1.65∶1；中快速型黃羽肉雞約為8～11周齡，飼料轉(zhuǎn)化比為2.09∶1～2.51∶1；慢速型黃羽肉雞約為14周齡，飼料轉(zhuǎn)化比為3.13∶1～3.35∶1。

表2 不同雞種初生重及公母平均體重約1.8 kg時(shí)的日齡和飼料轉(zhuǎn)化比

2.2 不同類(lèi)型肉雞群體線粒體D-loop區(qū)突變位點(diǎn)和單倍型分布特征

6個(gè)雞種線粒體D-loop區(qū)突變位點(diǎn)和單倍型分析顯示(表3)，314個(gè)個(gè)體共發(fā)現(xiàn)37個(gè)突變位點(diǎn)，可劃分為40種單倍型。由Network10.2構(gòu)建的中介網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(圖1)可以看出，40種單倍型明顯地分成了A、B、C和E 4個(gè)單倍型群(分枝)，4個(gè)單倍型群分別含有9、17、5和9種單倍型以及34、65、45和170條序列。其中，出現(xiàn)頻率最高的為單倍型E1，存在于5個(gè)品種89個(gè)個(gè)體中；其次是單倍型E3，共出現(xiàn)59次；再次是單倍型C2，共出現(xiàn)27次；第四是單倍型B1，共出現(xiàn)18次。

圖1 6個(gè)雞種線粒體D-loop區(qū)40種單倍型Network圖

表3 6個(gè)雞種線粒體D-loop區(qū)突變位點(diǎn)和單倍型分布

進(jìn)一步分析顯示(表4)，白羽肉雞和中快速型黃羽肉雞E單倍型比例較高，在AA肉雞、羅斯308、禽雁麻雞和裕禾1號(hào)肉雞中占比分別為85.92%、50.00%、100.00%和70.21%；慢速型黃羽肉雞配套系園豐麻雞2號(hào)和港豐瑤黑麻雞E單倍型占比相對(duì)較低，分別為15.00%和22.39%，園豐麻雞2號(hào)優(yōu)勢(shì)單倍型為B單倍型，占比66.67%(40/60)；港豐瑤黑麻雞優(yōu)勢(shì)單倍型為C單倍型，占比40.30%(27/67)。

表4 不同雞種線粒體D-Loop區(qū)全序列單倍型特征

2.3 不同雞種生長(zhǎng)性能與線粒體D-loop區(qū)單倍型之間的相關(guān)性分析

對(duì)不同類(lèi)型肉雞生長(zhǎng)性能和線粒體單倍型比例之間進(jìn)行相關(guān)性分析(表5)。初生重與E單倍型比例之間呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與A、B和C單倍型比例之間均呈負(fù)相關(guān)，并與B和C單倍型比例之間負(fù)相關(guān)水平顯著(P<0.05)；公母平均體重約1.8 kg時(shí)日齡與E單倍型比例之間呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；公母平均體重約1.8 kg時(shí)飼料轉(zhuǎn)化比與E單倍型比例之間呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，而與B和C單倍型比例之間呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

表5 雞生長(zhǎng)性能與線粒體D-loop區(qū)單倍型之間的相關(guān)性分析

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

采用NJ法將本研究中所獲得的40種單倍型與從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的19條紅色原雞線粒體D-loop區(qū)全長(zhǎng)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。下載的紅色原雞序列涵蓋滇南亞種(Gallusgallusspadiceus，GGS)、指名亞種(Gallusgallusgallus，GGG)、印度亞種(Gallusgallusmurghi，GGM)、海南亞種(Gallusgallusjabouillei，GGJ)和印尼亞種(Gallusgallusbankiva，GGB)的序列。

由圖2可見(jiàn)，A、B、C和E 4種單倍型在發(fā)育樹(shù)中均單獨(dú)形成進(jìn)化枝。其中A分支9種單倍型和B分支17種單倍型均與原雞滇南亞種(GGS)聚為一枝，A分支所有個(gè)體均與GGS5(GU261695)聚為一枝，B分支所有個(gè)體與GGS8(GU261704)和GGS1(NC007235)交叉聚為一枝。E分支9種單倍型與原雞印度亞種(GGM1、GGM3和GGM4)交叉聚為一枝。5種C單倍型聚類(lèi)形成C分支，并與原雞印度亞種GGM2、滇南亞種GGS10、指名亞種GGG1和GGG2以及印尼亞種GGB等4種紅色原雞亞種5條序列聚為一類(lèi)。

(轉(zhuǎn)下頁(yè) Carried forward)

圖2 基于線粒體DNA D-loop區(qū)采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討 論

3.1 不同類(lèi)型肉雞群體mtDNA控制區(qū)單倍型特征

本研究對(duì)6個(gè)不同類(lèi)型肉雞品種(配套系)314個(gè)個(gè)體線粒體控制區(qū)序列進(jìn)行研究，共發(fā)現(xiàn)37個(gè)突變位點(diǎn)和40種單倍型，參照文獻(xiàn)規(guī)定的單倍型分類(lèi)通用標(biāo)準(zhǔn)[38]，40種單倍型主要分為A、B、C和E共4個(gè)單倍型群。白羽肉雞和中快速型黃羽肉雞均以E單倍型為優(yōu)勢(shì)單倍型，占比均≥50%；而慢速型黃羽肉雞E單倍型占比均<25%，其中園豐麻雞2號(hào)B單倍型含量較高(66.67%)，港豐瑤黑麻雞C單倍型含量相對(duì)較高(40.30%)。有研究顯示，中快速型黃羽肉雞、817雜交肉雞以及高產(chǎn)蛋雞E單倍型含量較高，而地方雞種和慢速型黃羽肉雞E單倍型含量則相對(duì)較低，與本研究結(jié)果一致[39]。據(jù)文獻(xiàn)記載，線粒體E單倍型普遍存在于印度半島、中東和歐洲地方雞品種中，為這些地區(qū)雞種的主要單倍型。但是在中國(guó)目前還未發(fā)現(xiàn)E單倍型占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的地方品種，且只在少數(shù)地方雞種中被檢測(cè)到[40]。E單倍型在中快速型黃羽肉雞中的高比例存在，揭示了歐美商品雞包括隱性白羽雞和安卡紅雞等在我國(guó)肉雞配套系的成功培育中貢獻(xiàn)突出。

3.2 肉雞生長(zhǎng)速度與線粒體單倍型相關(guān)性分析與應(yīng)用

為了滿足消費(fèi)者多元化需求，我國(guó)大批黃羽肉雞配套系被成功培育，按其生長(zhǎng)速度可劃分為快速型、中速型和慢速型三大類(lèi)。由于我國(guó)地方雞品種生長(zhǎng)速度一般較慢，因此在培育中快速型配套系時(shí)，一般引入快大型隱性白羽肉雞血統(tǒng)來(lái)提高生長(zhǎng)速度，且在雜交過(guò)程中多以快大型隱性白羽肉雞為母本，因此后代可較完整地遺傳母本的線粒體遺傳信息。本研究對(duì)不同生長(zhǎng)速度類(lèi)型肉雞群體生產(chǎn)性能與線粒體D-loop區(qū)單倍型進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，所涉及到的肉雞群體E單倍型與初生重之間呈極顯著正相關(guān)、與公母平均體重約1.8 kg時(shí)日齡和飼料轉(zhuǎn)化比之間分別呈顯著和極顯著負(fù)相關(guān)，即E單倍型比例越高，雞群達(dá)到1.8 kg時(shí)日齡與快大型白羽肉雞越接近。在本研究中，兩個(gè)快大型白羽肉雞中E單倍型所占比例分別為50.00%和85.92%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于只有地方雞血統(tǒng)的慢速型黃羽肉雞的15.00%和22.39%，可見(jiàn)，擁有較高線粒體E單倍型占比的快大型白羽肉雞在中快速型黃羽肉雞的育種中貢獻(xiàn)較大。有研究顯示，利用線粒體標(biāo)記進(jìn)行動(dòng)物輔助選育是可行的[29-31]，近年來(lái)在植物上也有相關(guān)報(bào)道。錢(qián)明娟等[41]基于線粒體基因組DNA開(kāi)展了水稻不育系品種細(xì)胞質(zhì)進(jìn)化和鑒定方法研究，成功研發(fā)了一套線粒體分子標(biāo)記。張躍建等[42]基于甜瓜線粒體基因組富含SSR位點(diǎn)及父系遺傳的特性，對(duì)328個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了標(biāo)記開(kāi)發(fā)，有助于甜瓜的育種和種質(zhì)資源保護(hù)。目前，有關(guān)線粒體基因組分子標(biāo)記在雞配套系選育方面應(yīng)用的研究還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，然而由于線粒體母系遺傳的獨(dú)有特性以及線粒體E單倍型在中快速型肉雞培育過(guò)程中的重要作用，線粒體標(biāo)記在肉雞育種工作中應(yīng)用前景廣闊。

3.3 不同類(lèi)型肉雞群體系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系和母系起源

家雞不僅品種豐富，而且飼養(yǎng)范圍廣泛，其馴化過(guò)程和母系起源自達(dá)爾文時(shí)代以來(lái)就備受廣大學(xué)者關(guān)注[43-45]。2006年，Liu等[38]基于mtDNA控制區(qū)第一高變區(qū)對(duì)世界家雞和紅色原雞的世系構(gòu)成進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)主要包括A、B、C、D、E、F、G、H和I型等9個(gè)母系。2013年，Miao等[46]對(duì)世界各地家雞樣本線粒體控制區(qū)序列進(jìn)行了系統(tǒng)研究，揭示了家雞和紅色原雞的世系構(gòu)成除了Liu等[38]的研究結(jié)果外，還包括W、X、Y和Z型。本研究聚類(lèi)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擁有A或B單倍型的個(gè)體均僅與原雞滇南亞種交叉聚為一枝。且有研究顯示，我國(guó)地方雞品種中絕大多數(shù)以A或B單倍型為優(yōu)勢(shì)單倍型[24]。由此推測(cè)，在我國(guó)地方雞品種長(zhǎng)期馴化以及慢速型黃羽肉雞選育過(guò)程中，均保留了原雞滇南亞種母系血統(tǒng)。本研究中，E單倍型所有個(gè)體均僅與紅色原雞印度亞種交叉聚為一枝。據(jù)文獻(xiàn)記載，E單倍型是南亞和歐美商品雞的主要單倍型[38]。廣大育種者在中快速型肉雞配套系的選育過(guò)程中引入了這些外來(lái)雞種血液，進(jìn)而加快了育種進(jìn)程。而擁有C單倍型的個(gè)體分別與原雞指名亞種、滇南亞種、印度亞種以及印尼亞種交叉聚為一枝，可見(jiàn)C分支在長(zhǎng)期馴化過(guò)程中可能受到多種原雞亞種血統(tǒng)的影響，母系起源頗為豐富。

4 結(jié) 論

本研究中，6個(gè)肉雞群體314個(gè)個(gè)體線粒體D-loop區(qū)全序列共發(fā)現(xiàn)37個(gè)突變位點(diǎn)，共組成40種單倍型，并劃分為A、B、C和E共4個(gè)單倍型群。線粒體單倍型與肉雞生長(zhǎng)速度相關(guān)緊密，其中E單倍型與肉雞生長(zhǎng)速度呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)。E單倍型為白羽肉雞和中快速型黃羽肉雞的優(yōu)勢(shì)單倍型，而在慢速型黃羽肉雞群體中其比例普遍較低。母系起源分析顯示，原雞滇南亞種為A和B單倍型群的主要起源，印度亞種為E單倍型群的主要起源，而C單倍型群則起源于原雞指名亞種、滇南亞種、印度亞種和印尼亞種。