李武峰，邱麗霞，關(guān)家偉，李 麗，杜 敏

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太谷 030801； 2.美國華盛頓州立大學(xué)動(dòng)物科學(xué)系，普耳曼 99164-6310)

驢(Equusasinus)是傳統(tǒng)的役用家畜，肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，其包含亞麻酸在內(nèi)的多不飽和脂肪酸，種類豐富且含量高，易于被人體吸收利用[1]。廣靈驢屬大型驢種，其體軀粗壯、產(chǎn)肉性能較好、食用口感與風(fēng)味俱佳，是中國的優(yōu)勢(shì)驢種之一[2-3]。肉的好壞和質(zhì)量一般可通過嫩度、肌內(nèi)脂肪(intramuscular fat, IMF)含量、系水力、肉色、風(fēng)味等指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)定，而嫩度則作為重要感官指標(biāo)用來直接衡量肉品質(zhì)[4]。嫩度是咀嚼肉的感覺，可以很大程度上影響和決定消費(fèi)者購買選擇與欲望，因此探究驢肉嫩度的調(diào)控機(jī)制具有極其重要的價(jià)值和意義。

本試驗(yàn)以廣靈驢為研究對(duì)象，以剪切力和IMF為表型信息，通過WGCNA技術(shù)篩選與驢肉嫩度相關(guān)的基因及代謝物并進(jìn)行聯(lián)合分析，解析相應(yīng)的驢肉嫩度調(diào)控機(jī)制，為廣靈驢肉質(zhì)嫩度分子改良和分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及數(shù)據(jù)獲取

選用廣靈驢作為試驗(yàn)對(duì)象，選取30頭在相同環(huán)境與飲食條件下生長(zhǎng)、24～36月齡的雌性廣靈驢(平均體重236.10 kg)，獲取途徑來源于山西省忻州市繁峙縣田源毛驢養(yǎng)殖科技發(fā)展有限公司。對(duì)動(dòng)物進(jìn)行屠宰后于30 min內(nèi)取第12～13肋骨間的背最長(zhǎng)肌組織，立即儲(chǔ)存到液氮中供后續(xù)處理。本研究運(yùn)用的前期轉(zhuǎn)錄組及代謝組樣本是依據(jù)剪切力大小與肌內(nèi)脂肪含量從30頭廣靈驢中選取的最具差異的14個(gè)樣本，前期轉(zhuǎn)錄組及代謝組數(shù)據(jù)分析見[14-15]。為了讓片段數(shù)能真實(shí)的反映轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平，采用FPKM(fragments Per kilobase per million)方法作為衡量基因表達(dá)水平的指標(biāo)，F(xiàn)PKM計(jì)算公式如下[16]：

其中，Xi為唯一比對(duì)到基因的片段數(shù)；li為基因的長(zhǎng)度；N為唯一比對(duì)到參考基因組的總片段數(shù)。

1.2 試驗(yàn)試劑及儀器

石油醚為Merck級(jí)別；索氏抽提器SXT-02(上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司)；MAQC-12肌肉嫩度儀(南京銘奧儀器設(shè)備有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 剪切力及肌內(nèi)脂肪含量測(cè)定

剪切力測(cè)定：參照國家標(biāo)準(zhǔn)NY_T 1180-2006《肉嫩度的測(cè)定 剪切力測(cè)定法》測(cè)定驢肉剪切力。將驢肉置于80 ℃水浴鍋中加熱，利用溫度計(jì)監(jiān)測(cè)肉樣中心溫度，達(dá)到70 ℃后放置室溫環(huán)境冷卻，后用肌肉嫩度儀測(cè)定肉樣的剪切力大小，設(shè)置3個(gè)樣本重復(fù)。

肌內(nèi)脂肪含量測(cè)定：參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.6-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》要求提取測(cè)定廣靈驢背最長(zhǎng)肌的肌內(nèi)脂肪含量。利用索氏抽提儀提取驢肉肌內(nèi)脂肪，溶劑為石油醚，每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)。

1.4 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用R 4.1.0軟件中的WGCNA 1.7.0包將14個(gè)樣本的所有表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析。利用pickSoftThreshold函數(shù)計(jì)算最佳軟閾值，選取無尺度網(wǎng)絡(luò)擬合指數(shù)R2>0.8時(shí)power值最小的數(shù)為最佳power值。利用WGCNA包中的blockwiseModules函數(shù)構(gòu)建共表達(dá)矩陣，相似模塊合并閾值設(shè)置0.25(mergeCutHeight=0.25)，TOM類型為unsigned，deepSplit = 1，每個(gè)模塊內(nèi)的最小基因數(shù)設(shè)置為30(minModuleSize = 30)，其他參數(shù)按照默認(rèn)設(shè)置。

1.5 目標(biāo)模塊的篩選

對(duì)模塊內(nèi)的基因進(jìn)行PCA分析，將主成分1作為模塊特征向量(module eigengenes, MEs)。為篩選出與IMF和剪切力密切相關(guān)的模塊，計(jì)算MEs與IMF和剪切力之間的相關(guān)系數(shù)r以及相應(yīng)P值。對(duì)特異性模塊進(jìn)行篩選，|r|≥0.5且P≤0.05范圍的模塊可進(jìn)行后續(xù)分析。

2)將適應(yīng)值排在第1/3Np+1(Np為種群規(guī)模)的個(gè)體記為mk。對(duì)每維個(gè)體，求適應(yīng)值大于mk且符合式(18)范圍的所有個(gè)體集合，記為L(zhǎng)n。如果Ln中個(gè)體數(shù)大于k/2，則表示優(yōu)異種群在該位置信息失效。

1.6 模塊基因的GO、KEGG富集分析

應(yīng)用R軟件中的topGO 2.40.4包對(duì)特異性模塊基因進(jìn)行基因本體(gene ontology, GO)功能富集分析，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為該GO條目顯著富集。運(yùn)用Cluster Profiler 3.16.1包進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)功能富集分析，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為該信號(hào)通路的富集具有顯著性。

1.7 代謝組WGCNA分析

代謝物共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建是選取無尺度網(wǎng)絡(luò)擬合指數(shù)R2>0.85時(shí)power值最小的數(shù)為最佳power值，其余步驟及參數(shù)與“1.4”部分相同，目標(biāo)模塊的篩選同“1.5”部分。使用美吉云平臺(tái)(https://www. http://cloud.majorbio.com/)的自建數(shù)據(jù)庫對(duì)目標(biāo)模塊內(nèi)的代謝物進(jìn)行人類代謝數(shù)據(jù)庫(human metabolome database, HMDB)化合物分類和KEGG功能富集分析。

1.8 轉(zhuǎn)錄組代謝組聯(lián)合分析

利用KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行共富集分析，通過Cytoscape 3.7.2軟件中的MetScape預(yù)測(cè)聯(lián)合通路中基因與代謝物互作網(wǎng)絡(luò)圖。然后用R語言cor運(yùn)算基因和代謝物的Pearson相關(guān)系數(shù)，繪制相關(guān)性聚類熱圖并結(jié)合相關(guān)系數(shù)篩選出大于0.5的基因和代謝物，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄-代謝物網(wǎng)絡(luò)。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

剪切力及肌內(nèi)脂肪測(cè)定數(shù)據(jù)采用Excel 2019軟件進(jìn)行加權(quán)平均值計(jì)算，結(jié)果以每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)計(jì)算的平均值表示。以P<0.05標(biāo)準(zhǔn)篩選GO和KEGG顯著富集結(jié)果，對(duì)各通路中的基因及代謝物進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，以相關(guān)性大于0.5為標(biāo)準(zhǔn)，使用R 4.1.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化呈現(xiàn)。

2 結(jié) 果

2.1 剪切力和肌內(nèi)脂肪含量測(cè)定結(jié)果

14個(gè)廣靈驢背最長(zhǎng)肌表型數(shù)據(jù)檢測(cè)結(jié)果如表1所示。從30頭動(dòng)物中抽取了6頭具有高、低肌內(nèi)脂肪含量顯著差異的24月齡廣靈驢和8頭具有高、低剪切力顯著差異的36月齡廣靈驢，從表中可以看到，肌內(nèi)脂肪含量與剪切力大小呈負(fù)相關(guān)。

表1 廣靈驢肉用指標(biāo)相關(guān)的描述性統(tǒng)計(jì)

2.2 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵模塊鑒定

通過軟閾值選擇最佳β值，當(dāng)power值等于5，無尺度網(wǎng)絡(luò)擬合指數(shù)R2>0.8(圖1A)。利用TOM值進(jìn)行層次聚類，通過混合動(dòng)態(tài)剪切來劃分模塊，構(gòu)建出了28個(gè)模塊(圖2A)，通過顏色差異區(qū)分不同模塊。每個(gè)模塊的詳細(xì)基因數(shù)目見圖1B，其中Turquoise模塊內(nèi)的基因數(shù)目最多，共5 362個(gè)，White模塊內(nèi)的基因數(shù)目最少，為34個(gè)，其他模塊數(shù)目介于43～2 779之間。

模塊與IMF和剪切力的相關(guān)性如圖2B所示，本研究以|r|≥0.5及P≤0.05為判定標(biāo)準(zhǔn)共篩選出3個(gè)關(guān)鍵模塊。其中Darkgreen模塊(r=0.73，P=0.003)含有NIT2、LST1、SOCS7、GAPT、PAPN2等95個(gè)基因；Greenyellow模塊(r=0.52，P=0.05)含有LSR、MYOG、AKT1、CD5、ELOVL2等372個(gè)基因以及Darkgrey模塊(r=0.56，P=0.04)含有CXCL9、CAD1、FADS6、ADH4、TSR1等73個(gè)基因，3個(gè)模塊均與IMF顯著正相關(guān)，Darkgreen模塊(r=-0.64，P=0.01)與剪切力顯著負(fù)相關(guān)。為了驗(yàn)證和解析模塊的功能，本研究對(duì)這3個(gè)模塊進(jìn)行后續(xù)分析。

A.基因聚類模塊劃分；B.IMF、剪切力與基因模塊特征向量的交匯結(jié)果

2.3 模塊基因GO功能富集分析

本研究對(duì)Greenyellow、Darkgrey以及Darkgreen三個(gè)模塊進(jìn)行GO功能富集分析(圖3)。Greenyellow模塊顯著富集到262個(gè)生物過程、37個(gè)細(xì)胞組分、53個(gè)分子功能，主要在甘油磷脂的生物合成、脂肪酸連接酶活性、脂肪酸β-氧化、脂質(zhì)氧化、脂肪酸結(jié)合等功能上富集。Darkgrey模塊顯著富集到93個(gè)生物過程、20個(gè)細(xì)胞組分、30個(gè)分子功能，主要在羧酸生物合成過程、脂肪酸生物合成過程、G蛋白偶聯(lián)受體活性、蛋白磷酸酶抑制劑活性、ATP酶調(diào)節(jié)活性等功能上富集。Darkgreen模塊顯著富集到105個(gè)生物過程、28個(gè)細(xì)胞組分、21個(gè)分子功能，主要在肌管分化、細(xì)胞大分子分解代謝過程、肌肉器官發(fā)育、橫紋肌組織發(fā)育、肌肉細(xì)胞遷移、鈣離子結(jié)合、細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合、肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合等功能上富集。

圖3 Greenyellow(A)、Darkgrey(B)、Darkgreen(C)差異模塊基因GO富集結(jié)果

2.4 模塊基因KEGG通路富集分析

對(duì)3個(gè)模塊進(jìn)行KEGG功能富集分析，結(jié)果見圖4。Greenyellow模塊的富集結(jié)果顯示涉及267條通路，發(fā)現(xiàn)有40條通路被顯著富集(P<0.05)，主要有HF-1信號(hào)通路、脂肪酸代謝、Wnt信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路以及花生四烯酸代謝等。Darkgrey模塊的富集結(jié)果顯示涉及89條通路，其中有9條通路被顯著富集(P<0.05)，即藥物代謝-細(xì)胞色素P450、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用、細(xì)胞色素P450對(duì)異生素的代謝、藥物代謝-其他酶、致心律失常性右心室心肌病、視黃醇代謝、化學(xué)致癌、牛磺酸和亞牛磺酸代謝和軸突再生。Darkgreen模塊富集結(jié)果顯示涉及126條通路，其中有細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、刺猬信號(hào)通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號(hào)通路、氨酰-tRNA生物合成、庫欣綜合征、胃癌、細(xì)胞凋亡、JAK-STAT信號(hào)通路、子宮內(nèi)膜癌、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、甲狀腺激素合成、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、cAMP信號(hào)通路、致心律失常性右心室心肌病、甲狀旁腺激素的合成、分泌和作用共16條通路顯著富集(P<0.05)。

圖4 Greenyellow(A)、Darkgrey(B)以及Darkgreen(C)模塊基因Top10 KEGG富集散點(diǎn)圖

2.5 代謝物共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵模塊鑒定

利用pickSoftThreshold函數(shù)篩選合適的軟閾值，當(dāng)power值為14時(shí)，R2>0.85(圖5A)，層次聚類后共構(gòu)建28個(gè)模塊(圖6A)。各模塊的代謝物數(shù)目如圖5B所示，其中Turquoise模塊內(nèi)的代謝物數(shù)目最多，共2 238個(gè)，White模塊內(nèi)的代謝物最少，為34個(gè)，其他模塊介于45～1 808之間。

A.確定最佳軟閾值；B.各模塊中的代謝物數(shù)目分布

代謝物模塊與IMF和剪切力的相關(guān)性如圖6B所示，基于|r|≥0.5及P<0.05選定關(guān)鍵模塊，其中Brown模塊(r=0.76，P=0.004)、Yellow模塊(r=-0.63，P=0.03)以及Darkgreen模塊(r=-0.72，P=0.008)與IMF顯著相關(guān)。Brown模塊(r=-0.79，P=0.002)、Lightcyan模塊(r=-0.71，P=0.01)、Yellow模塊(r=0.69，P=0.01)、Darkgreen模塊(r=0.7，P=0.01)以及Darkred模塊(r=0.71，P=0.01)與剪切力顯著相關(guān)。然而，關(guān)鍵模塊中的代謝物大部分無法識(shí)別，Brown、Yellow、Darkgreen、Lightcyan以及Darkred模塊中代謝物分別有1 645、944、68、98、77個(gè)，其中可識(shí)別的代謝物分別有171、55、7、11、3個(gè)。Brown模塊中的代謝物包括丙氨酰-賴氨酸、L-脯氨酰胺、L-酪氨酸、腺嘌呤、丙氨酰-亮氨酸、腺苷酸基琥珀酸等,Yellow模塊中的代謝物包括N-乙酰-L-組氨酸、肌肽、尿烷酸、荊芥內(nèi)酯、黃嘌呤酸8-O-硫酸鹽等。由于Darkgreen、Lightcyan以及Darkred模塊中可識(shí)別代謝物太少，因此本研究主要就Brown以及Yellow模塊進(jìn)行后續(xù)分析。

A.代謝物聚類及模塊劃分；B.IMF、剪切力與代謝物模塊特征向量的交匯結(jié)果

2.6 代謝物模塊HMDB化合物分類

將Brown和Yellow模塊注釋到HMDB數(shù)據(jù)庫，結(jié)果如圖7所示。Brown和Yellow模塊中脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子占比最多(分別占37.98%和35.00%)，其余的有機(jī)酸及其衍生物(分別占30.23%和25.00%)、有機(jī)雜環(huán)化合物(分別占12.40%和12.50%)以及有機(jī)氧化合物(分別占6.20%和15.00%)占比比較多。

圖7 Brown、Yellow模塊代謝物在HMDB數(shù)據(jù)庫中的分類

2.7 代謝物模塊KEGG功能富集分析

對(duì)Brown和Yellow模塊內(nèi)的代謝物進(jìn)行KEGG功能富集分析，圖8展示了各模塊富集前10的代謝通路。Brown模塊共富集到96條代謝通路，其中37條通路顯著富集(P<0.05)，主要有蛋白質(zhì)消化吸收、谷胱甘肽代謝、FoxO信號(hào)通路、檸檬酸循環(huán)、精氨酸和脯氨酸代謝、甘油磷脂代謝等。Yellow模塊共富集到28條通路，其中僅有甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、嘌呤代謝、β-丙氨酸代謝、甘油磷脂代謝、泛酸和輔酶A生物合成、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、組氨酸代謝、利什曼病和半胱氨酸和蛋氨酸代謝9條通路顯著富集(P<0.05)。

圖8 Brown、Yellow模塊代謝物Top10 KEGG富集散點(diǎn)圖

2.8 聯(lián)合KEGG通路分析

本研究對(duì)與IMF和剪切力相關(guān)模塊內(nèi)的基因及代謝物進(jìn)行KEGG通路共富集分析，基因模塊包括Darkgreen、Greenyellow及Daekgrey，共540個(gè)基因，代謝物模塊包括Brown、Lightcyan、Yellow、Darkgreen及Darkred，共247個(gè)代謝物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有81個(gè)共富集通路，其中8條(丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、GABA能突觸、谷氨酸能突觸、精氨酸和脯氨酸代謝、苯丙胺成癮、近端小管碳酸氫鹽回收、β-丙氨酸代謝以及PPAR信號(hào)通路)在KEGG通路中顯著富集(P<0.1)，其中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、β-丙氨酸代謝以及PPAR信號(hào)通路可能與驢肉的嫩度相關(guān)(表2)。

表2 模塊基因和代謝物聯(lián)合KEGG功能富集分析部分通路

2.9 模塊基因、代謝物相關(guān)性以及網(wǎng)絡(luò)圖分析

對(duì)4條KEGG共表達(dá)通路(丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、PPAR信號(hào)通路、β-丙氨酸代謝以及氨酸和脯氨酸代謝)中的基因與代謝物進(jìn)行相關(guān)性分析，將Pearson相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值大于0.5的基因與代謝物作為研究重點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)4條共富集通路中均存在相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值大于0.5的基因與代謝物，且各通路間具有連接性，圖9展示了共富集通路中基因與代謝物相關(guān)網(wǎng)絡(luò)。在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路中，腺苷酸基琥珀酸與PPAT、GAD1、NIT2基因正相關(guān)性強(qiáng)(圖9A)。在精氨酸和脯氨酸代謝通路中，AGMAT基因與代謝物L(fēng)-脯氨酸、L-谷氨酸以及高肌肽負(fù)相關(guān)，與肌酸正相關(guān)；CARNS1基因與代謝物肌酸正相關(guān)，與高肌肽負(fù)相關(guān)(圖9B)。在β-丙氨酸代謝通路中，代謝物泛酸與基因CARNS1、ACOXL負(fù)相關(guān)，與GAD1正相關(guān)；肌肽與CARNS1、ACOXL正相關(guān)，與GAD1負(fù)相關(guān)(圖9C)。在PPAR信號(hào)通路中，代謝物(9S)-羥基十八碳二烯酸與SORBS2、ACOXL基因負(fù)相關(guān)(圖9D)。

橢圓代表代謝物，菱形代基因，實(shí)線代表正相關(guān)，虛線代表負(fù)相關(guān)

3 討 論

嫩度評(píng)價(jià)指標(biāo)直接受剪切力的數(shù)據(jù)結(jié)果影響，IMF也是影響嫩度的重要因素。本研究以剪切力和IMF為表型，通過WGCNA技術(shù)篩選與嫩度相關(guān)的候選基因，共鑒定到3個(gè)與IMF和剪切力相關(guān)的模塊以及各模塊中的相關(guān)基因。3個(gè)模塊均與IMF正相關(guān)，Darkgreen模塊與剪切力負(fù)相關(guān)，符合IMF與剪切力負(fù)相關(guān)特性。Greenyellow和Darkgrey模塊內(nèi)的GO和KEGG均是與IMF相關(guān)的過程及通路，例如脂質(zhì)氧化、脂肪酸生物合成過程、花生四烯酸代謝等，而Darkgreen模塊在GO功能富集分析上主要涉及肌肉發(fā)育及大分子降解、鈣離子結(jié)合等與肌肉及鈣調(diào)控相關(guān)的過程，KEGG功能富集分析則涉及到脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等與IMF相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

通過WGCNA篩選與肉質(zhì)嫩度相關(guān)的代謝物信息和關(guān)鍵模塊，鑒定篩選到Brown、Yellow、Darkgreen、Lightcyan以及Darkred 5個(gè)關(guān)鍵模塊都與剪切力顯著相關(guān)，其中的Brown、Yellow、Darkgreen模塊與IMF顯著相關(guān)。但由于模塊中的大量代謝物無法進(jìn)行識(shí)別，因此只對(duì)識(shí)別出相對(duì)較多代謝物的Brown和Yellow模塊進(jìn)行后續(xù)分析。Brown模塊內(nèi)的代謝物主要有丙氨酰-賴氨酸、L-酪氨酸和腺嘌呤等。肉類的嘌呤含量相對(duì)較高，肉類攝入量增加與痛風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，Huang等[17]在研究中發(fā)現(xiàn)，豬肉中的次黃嘌呤和腺嘌呤(AH)的結(jié)合含量約占總嘌呤量的90%，AH含量與4種感官特征呈負(fù)相關(guān)，包括嫩度、多汁性、油性和總體喜好程度，降低肉中兩種尿酸嘌呤堿基的水平不僅有利于肉的營養(yǎng)價(jià)值，還能提高肉的感官接受度。Yellow模塊內(nèi)的代謝物主要有N-乙酰-L-組氨酸、肌肽以及尿烷酸等。動(dòng)物死后肉質(zhì)嫩化的主要原因是由于肉中較大蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)水解，因此肉中的氨基酸量可能用于指示蛋白質(zhì)的水解和肉質(zhì)嫩化的結(jié)果。Straadt等[18]在5種不同雜交豬種的代謝組學(xué)技術(shù)與豬肉感官知覺關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，丙氨酸、肌肽、酪氨酸等7種氨基酸含量與肉嫩度呈正相關(guān)。

通過WGCNA篩選的候選基因及代謝物結(jié)果與KEGG功能富集分析，發(fā)現(xiàn)了81條通路共富集，其中天冬氨酸、丙氨酸和谷氨酸代謝、PPAR信號(hào)通路、β-丙氨酸代謝以及精氨酸和脯氨酸代謝顯著富集且與廣靈驢肉質(zhì)嫩度相關(guān)，進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)在4個(gè)通路中均有相關(guān)的基因及代謝物。Antonelo等[19]研究了與牛肉嫩度相關(guān)代謝物及代謝途徑，發(fā)現(xiàn)高嫩度牛肉代謝物乙酰肉堿、腺嘌呤、β-丙氨酸、纈氨酸水平顯著高于低嫩度牛肉且與剪切力負(fù)相關(guān)，表示這些代謝物可能影響牛肉嫩度。在候選通路中，PPAR信號(hào)通路與哺乳動(dòng)物的肉質(zhì)顯著相關(guān)，F(xiàn)ang等[20]在豬PPAR信號(hào)通路中挖掘了77個(gè)潛在功能性單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)，其中有13個(gè)與豬肉品質(zhì)顯著相關(guān)的標(biāo)記SNPs，它們對(duì)脂肪含量、肉色、背膘等性狀有顯著影響。PPAR是核受體超家族成員，充當(dāng)配體誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，在葡萄糖和脂質(zhì)代謝中起著至關(guān)重要的作用[21]，而肌內(nèi)脂肪沉積直接影響肉質(zhì)嫩度，因此可以推測(cè)，PPAR信號(hào)通路可介導(dǎo)脂肪代謝相關(guān)途徑從而間接影響肉質(zhì)剪切力。

在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路中，腺苷酸基琥珀酸(adenylosuccinate, S-AMP)在相關(guān)性分子中與基因GAD1、NIT2、PPAT的表達(dá)水平正相關(guān)。腺苷酸基琥珀酸是嘌呤代謝中合成AMP的前體物質(zhì)，對(duì)β細(xì)胞功能障礙的逆轉(zhuǎn)有重要作用[22]。有研究發(fā)現(xiàn)，S-AMP與AMPKγ亞基通過形成復(fù)合體增強(qiáng)AMPK磷酸化水平，并提高甘油三酯脂肪酶和乙酰輔酶A羧化酶的表達(dá)量和磷酸化[23]。谷氨酸脫羧酶(glutamic acid decarboxylase, GAD)，是一種可催化谷氨酸脫羧轉(zhuǎn)化成γ-氨基丁酸的脫羧酶，其廣泛表達(dá)于脊椎動(dòng)物中樞神經(jīng)的神經(jīng)元中，同時(shí)GAD還具有刺激胰島素等激素分泌的作用，可增強(qiáng)動(dòng)物食欲，提高動(dòng)物機(jī)體的代謝率，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[24]。GAD受GAD1和GAD2基因相互調(diào)控，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在小鼠中GAD1是胰島細(xì)胞表達(dá)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的結(jié)構(gòu)形式，這跟γ-氨基丁酸可與神經(jīng)肽Y相互作用從而刺激食欲有關(guān)[25]，然而目前還并未發(fā)現(xiàn)其對(duì)肉質(zhì)影響的相關(guān)研究。同樣地，硝化酶樣蛋白2(nitrilase-like protein 2, NIT2)屬于硝化酶超家族成員之一，Krasnikov等[26]通過研究確定NIT2為ω-酰胺酶，可催化谷氨酰胺和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨生成α-酮戊二酸和α-酮琥珀酸，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨可以挽救非特異性轉(zhuǎn)氨酶所產(chǎn)生必需氨基酸的α-酮酸。Wu等[27]利用基因組關(guān)聯(lián)分析研究發(fā)現(xiàn)，PPAT基因在肝中的表達(dá)水平與雞腹脂率、腹脂重顯著相關(guān)。另有研究表明，在牛肉屠宰老化過程中，谷氨酰胺和丙氨酸主要集中在更嫩的牛肉中[28]。在精氨酸和脯氨酸代謝通路中，AGMAT基因與代謝物L(fēng)-脯氨酸、L-谷氨酸和高肌肽負(fù)相關(guān)，與肌酸正相關(guān)；CARNS1基因結(jié)果相反。羥脯氨酸作為膠原蛋白降解的最后一步，被用作判定膠原蛋白分解代謝的特定指標(biāo)[29]。在雞屠宰后，肉質(zhì)老化期間膠原溶解度、游離羥脯氨酸和蛋白水解率均增加，剪切力逐漸降低[30]。脯氨酸和谷氨酸與韓國黃牛肉質(zhì)嫩度、多汁性和整體可接受性顯著正相關(guān)[31]。肌酸影響著肌肉的能量代謝，補(bǔ)充肌酸能提升肌肉性能[32]。在此通路中L-脯氨酸、L-谷氨酸、高肌肽和肌酸可能與AGMAT、CARNS1相互作用進(jìn)而影響驢肉嫩度。

在β-丙氨酸代謝通路中，代謝物泛酸與基因CARNS1、ACOXL負(fù)相關(guān)，與GAD1正相關(guān)；肌肽與CARNS1、ACOXL正相關(guān)，與GAD1負(fù)相關(guān)。肌肽在肌肽合成酶(CARNS)作用下，將β-丙氨酸和L-組氨酸連接起來。β-丙氨酸是形成肌肽的限速因子，給育肥豬喂食β-丙氨酸能提高肌肉肌肽水平和運(yùn)動(dòng)能力[33]。肌肽參與調(diào)控機(jī)體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，有效喂食肌肽可提高豬的抗氧化能力和肉質(zhì)[34]。持續(xù)熱應(yīng)激破壞豬背最長(zhǎng)肌促氧化/抗氧化平衡，肌肽含量和CARNS1 mRNA表達(dá)在30 ℃下3周后顯著降低[35]。肌酸和肌肽在安格斯牛中具有中等遺傳性，肌肽與牛肉整體嫩度呈負(fù)相關(guān)，風(fēng)味研究發(fā)現(xiàn)魚腥味與肌酐和肌肽顯著負(fù)相關(guān)[36]。研究發(fā)現(xiàn)，輔酶A前體泛酸可以提高細(xì)胞的呼吸強(qiáng)度，推測(cè)泛酸可能通過提高線粒體輔酶A的含量進(jìn)而增加了ATP及谷胱甘肽的含量[37]。ACOXL即?；o酶A氧化酶樣蛋白，具有?；o酶A脫氫酶活性，是過氧化物酶體脂肪酸氧化的主要限速酶。李強(qiáng)[38]通過全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，ACOXLc.8C/T與大白豬第十肋骨處背膘厚顯著關(guān)聯(lián)。在PPAR信號(hào)通路中代謝物(9S)-羥基十八碳二烯酸與基因SORBS2和ACOXL負(fù)相關(guān)。SORBS2即SH3結(jié)構(gòu)域包含蛋白2，是一種與Abl/Arg非受體酪氨酸激酶途徑相關(guān)的支架蛋白，已知和肌動(dòng)蛋白及其他幾種不同類型的骨架蛋白相互作用。SORBS2可誘導(dǎo)原代人成纖維細(xì)胞衰老[39]。SORBS2可能通過影響細(xì)胞連接以及成纖維細(xì)胞衰老進(jìn)而影響肉質(zhì)嫩度。

4 結(jié) 論

本研究基于WGCNA技術(shù)篩選與嫩度相關(guān)的候選基因及代謝物，之后進(jìn)行KEGG功能富集聯(lián)合分析。發(fā)現(xiàn)嫩度候選基因及代謝物共富集在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、β-丙氨酸代謝以及PPAR信號(hào)通路上，說明這些通路可能對(duì)調(diào)控驢肉嫩度有重要作用。各通路上均存在Pearson相關(guān)系數(shù)大于0.5的基因及代謝物，GAD1、PPAT、NIT2、AGMAT、CARNS1、ACOXL、SORBS2以及腺苷酸基琥珀酸、L-脯氨酸、L-谷氨酸、肌酸、高肌肽、肌肽、泛酸、(9S)-羥基十八碳二烯酸可能是影響驢肉嫩度的候選基因及代謝物。本研究基于WGCNA技術(shù)以及KEGG共富集分析篩選了影響嫩度的候選基因及代謝物，為解析驢肉嫩度調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為驢肉分子改良提供了理論依據(jù)。