劉欣杰，吳曉雪，劉素平，袁利明，陳 寧，賽務加甫

(石河子大學動物科技學院，石河子 832003)

磷脂酰肌醇特異的磷脂酶C(phospholipase C，PLC)可使磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(PIP2)水解為第二信使肌醇-1，4，5-三磷酸(PIP3)和二酰甘油(DAG)[1-3]，在調節(jié)各種受體分子的細胞內信號轉導中起著關鍵作用。PIP3可使內質網(wǎng)鈣庫釋放出Ca2+[4-5]，使細胞內Ca2+的濃度升高[6-8]；DAG可激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，繼而引發(fā)下一步的信號傳遞[9-10]。PLC普遍存在于機體的各組織中，對機體多種生理活動做出了重要的調控[11-12]。PLCγ可作為一種傳遞信號參與受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)介導的細胞分裂、抗原抗體結合引起免疫反應及卵細胞受精[13]等過程。磷脂酶Cγ1(phospholipase C-γ1,PLC-γ1)作為PLC家族的成員，至今已發(fā)現(xiàn)13種哺乳動物PLC的同工酶，分為β、γ、ε和δ四大類型[14]，每一類型還有不同的亞型分支。PLC-γ1屬于PLCγ的一個亞型[15]。除參與細胞分裂外，RTK介導的PLC-γ1信號通路在細胞遷移、運動和分化中也有重要作用。通常過度表達RTK下游分子會引起腫瘤轉移，PLC-γ1也有這種作用[16-17]；一般認為，RTK的下游分子能刺激或抑制細胞分化，也有報道證明PLC-γ1能誘導培養(yǎng)的神經(jīng)細胞生長與分化[18-20]。Dittmar等[21]報道，表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)誘導乳腺癌細胞的遷移是由于PLC-γ1的短暫激活引起的。Smith等[22]報道，在小鼠3YI的纖維原細胞中PLC-γ1的過表達會導致細胞發(fā)生惡性轉化。Zhang等[23]運用基因敲除技術，通過降低PLC-γ1活性來抑制胚胎血管內皮生長因子的下游轉導，證明其對胚胎發(fā)育過程中血細胞的生成及血管內皮生長因子具有非常重要的調控作用。PLC-γ1蛋白在不同家畜、物種及進化過程中具有較高的序列保守性，對于細胞的生長、增殖、胚胎發(fā)育等都有著重要影響[24-25]。

本研究旨在獲得真核過表達蛋白PLC-γ1，并通過注射純化PLC-γ1蛋白制備多克隆抗體，以綿羊早期胚胎為模型研究PLC-γ1在其發(fā)育中的信號通路機制奠定基礎。本研究通過常規(guī)分子克隆技術擴增獲得PLC-γ1基因，構建pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1真核過表達載體后轉染HEK-293T細胞表達，高質量的鼠源IgG1重組抗體與納米磁珠共價偶聯(lián)制備的Anti-Flag免疫磁珠對PLC-γ1蛋白進行純化后混入弗氏佐劑免疫試驗兔，使用間接ELISA確定血清的效價，WB檢測抗體的特異性，飽和過硫酸銨對多克隆抗體進行純化。將已構建的綿羊PLC-γ1基因真核表達重組質粒顯微注射到綿羊MⅡ期卵母細胞胞質中以驗證PLC-γ1基因是否對綿羊胚胎發(fā)育具有影響，孤雌激活卵裂后分別在mRNA及蛋白水平上進行PLC-γ1表達檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株、載體、細胞及試驗動物：E.coliDH5α Electro-Cells購自TaKaRa有限公司，pcDNA3.1-EGFP(+)載體、Puc57-P2A-Flag-PLC-γ1菌株、HEK-293T細胞由本實驗室保存并提供；試驗兔(新西蘭大白兔)由石河子大學動物疾病防控兵團重點實驗室提供。

主要試劑：T4DNA連接酶、Hind Ⅲ限制性內切酶、pMD19-T載體、Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒均購自TaKaRa公司；Anti-Flag免疫磁珠、磁力架、SYBR購自Bimake公司；Trizol、AgeⅠ限制性內切酶、聚偏二氟乙烯膜、預染蛋白Marker、Ipofectamin TM2000 Reagent、Diethyl Pyrocar bonate均購自賽默飛世爾科技有限公司；Super DNA Marker、2xTaq PCR MasterMix、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、氨芐青霉素(Amp+)、卡那霉素(Kan+)、DAB顯色液、高純度無內毒素質粒小提試劑盒、無內毒素質粒大提試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；脫脂奶粉購自美國BD公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液、PMSF均購自北京索萊寶科技有限公司；Flag標簽一抗、β-actin一抗、羊抗兔辣根過氧化物酶標二抗均購自Abcam公司。

綿羊用割卵液、成熟培養(yǎng)液、SoFaa胚胎培養(yǎng)液配方(所用試劑均購自Sigma公司)：割卵液：PBS 95 mL、Heperin 0.005 g、Penicillin 0.008 g、Streptomycin 0.005 5 g、Phenol red 0.001 g、FBS 5 mL。成熟培養(yǎng)液：TCM199 0.92 g、NaHCO30.25 g、Hepes 0.246 3 g、Na-Py 0.033 g、Glutamine 0.005 g、0.075 IU·mL-1HMG 1 mL、1 μg·mL-117 β-雌二醇 1 mL、S/N 0.007 g、Phenol red 0.001 g、FBS 10 mL、無菌去離子水88 mL。SoFaa胚胎培養(yǎng)液：NaCl 0.632 5 g、KCl 0.048 2 g、KH2PO40.012 3 g、NaHCO30.265 1 g、Na-Py 0.003 6 g、L-Glutamine 0.015 8 g、BSA 0.8 g、CaCl2·2H2O 0.024 8 g、MgCl2·6H2O 0.01 g、BME(amino acids) 2 mL、MEM(amino acids) 1 mL、Sodium lactate 28.22 μL、Pencillin 0.008 g、Strep 0.005 5 g、Phenol red 0.001 g、無菌去離子水96.97 mL。

主要儀器：FormaTMSteri-CultTMCO2Incubators(SANYO)；PCR儀(TC400)；電泳儀(北京六一DYY-8C)；實時熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)；凝膠成像儀(英國Clearer公司)；紫外分光光度計(美國BioTek公司)；Protein simple成像儀(美國Protein Simple公司)。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 利用Primer Premier 5.0軟件以Puc57-P2A-Flag-PLC-γ1菌株為模板對所設計的引物上、下游分別引入Hind Ⅲ、AgeⅠ酶切位點。根據(jù)綿羊P2A-Flag-PLC-γ1基因序列和綿羊β-actin基因(登錄號：443052)設計實時熒光定量qPCR引物(表1)。由生工(上海)生物技術有限責任公司對所設計的引物進行合成。

表1 引物序列

1.2.2 pMD19-T-P2A-Flag-PLC-γ1克隆載體的構建 使用設計好的引物以Puc57-P2A-Flag-PLC-γ1為模板進行目的基因的擴增，擴增體系(25 μL)：2×GC Buffer Ⅰ 12.5 μL，ddH2O 6 μL，dNTP Mixture 4 μL，模板1 μL，上、下游引物(PLC-γ1)各0.5 μL，LA Taq酶0.5 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性2 min；94 ℃變性20 s，58 ℃退火1 min，68 ℃延伸4 min，30個循環(huán)；68 ℃再延伸10 min；4 ℃保存。1.0%瓊脂糖凝膠電泳(120 V 90 mA，45 min)對PCR產物進行驗證。

根據(jù)DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒產品的操作規(guī)范和說明書對符合目的片段大小的PCR產物進行回收試驗操作，膠回收產物通過核酸定量儀NanoDrop 2000c測定濃度，驗證合格的產物與T載體16 ℃過夜連接，連接體系(10 μL)：10×ligation buffer*12 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，T載體2 μL，插入DNA片段2 μL，ddH2O 3 μL。將過夜連接后的pMD19-T-P2A-Flag-PLC-γ1克隆載體轉入E.coliDH5α Electro-Cells后涂布于帶有氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上，挑取單菌株進行PCR鑒定(反應所需體系同上，退火溫度為56 ℃，上、下游引物為PLC-γ1-Yiyuan)，提取PCR鑒定的陽性克隆菌株的質粒，使用Hind Ⅲ和AgeⅠ進行雙酶切鑒定后測序。

1.2.3 pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1真核過表達載體的構建 使用Hind Ⅲ、AgeⅠ限制性內切酶酶切測序正確的陽性質粒pMD19-T-P2A-Flag-PLC-γ1及pcDNA3.1-EGFP(+)載體，回收P2A-Flag-PLC-γ1基因片段及載體片段，兩者16 ℃過夜連接，構建pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1真核過表達載體，在冰上轉入感受態(tài)細胞后涂布于帶有載體抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)，挑取單菌落進行菌液PCR檢測，陽性菌株提取質粒進行雙酶切鑒定后進行測序。

1.2.4 過表達載體轉染HEK-293T細胞 將含有重組質粒pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1的菌液接種于3 000 mL氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩過夜培養(yǎng)，然后根據(jù)天根公司無內毒素質粒大提試劑盒產品的操作規(guī)范和說明書對重組質粒進行提取試驗操作。Lipofectamin TM2000 Reagent包裹真核過表達載體pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1轉染HEK-293T細胞，轉染后37 ℃、5%CO2孵育4～6 h后更換新鮮培養(yǎng)液去除細胞毒性，24 h后，熒光顯微鏡觀測試驗結果，確定轉染效果以及PLC-γ1表達情況。

1.2.5 實時定量PCR檢測PLC-γ1 mRNA表達情況 在冰上對轉染后的293T細胞進行總RNA提取，進行反轉錄試驗，對反轉錄后的產物進行qPCR反應，反應體系(20 μL)：50×ROX Reference Dye(low Donc) 0.5 μL，ddH2O 6.5 μL，2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物(PLC-γ1-qPCR/β-actin-qPCR)各1 μL。qPCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，55個循環(huán)。每組樣品均重復3次試驗，反應結束后計算mRNA水平上PLC-γ1表達情況。

1.2.6 免疫印跡法檢測HEK-293T細胞中PLC-γ1蛋白表達 根據(jù)RIPA裂解液以及PMSF使用說明書提取轉染后293T細胞的總蛋白，對所提取的細胞總蛋白使用BCA試劑盒進行濃度測定，5×SDS蛋白上樣液煮沸變性，免疫印跡法(Flag抗體為一抗，羊抗兔辣根過氧化物酶標二抗)檢測PLC-γ1蛋白表達。

1.2.7 Anti-Flag免疫磁珠對PLC-γ1蛋白進行純化 取20 μL磁珠懸液至新離心管，500 μL TBS吹打重懸3次后移除上清；加入200 μL細胞裂解液，室溫孵育2.5 h后進行磁性分離，留取沉淀磁珠，移除上清用于陰性對照檢測；500 μL PBST吹打重懸，上下翻轉樣品5 min，磁性分離后移除上清，該過程進行3次；取pH為3的0.1 mol·L-1glycine HCl 100 μL在搖床上洗脫15 min；洗脫產物加入pH為8的1 mol·L-1Tris-HCL調節(jié)pH直至中性。

1.2.8 純化后的PLC-γ1蛋白進行SDS凝膠電泳及免疫印跡檢測 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳及WB(Flag抗體為一抗，稀釋后的羊抗兔辣根過氧化物酶標二抗為二抗)檢測純化后的PLC-γ1蛋白表達情況。

1.2.9 PLC-γ1多克隆抗體的制備 將純化的PLC-γ1蛋白混入弗氏佐劑免疫健康狀態(tài)良好的試驗兔，免疫程序：免疫前對2只健康且狀態(tài)良好的試驗兔耳緣靜脈抽血2 mL留作陰性對照；免疫第1天(第一次免疫)，純化的800 μg蛋白與完全佐劑等體積混合后形成穩(wěn)定的乳化劑，在試驗兔皮下采用五點法進行注射；第15天(第二次免疫)純化的800 μg蛋白與完全佐劑等體積混合注射；第29天(第三次免疫)純化的500 μg蛋白與不完全佐劑等體積混合注射；第36天耳動脈抽血2 mL，WB鑒定多克隆抗體產生情況，ELISA測其血清效價；第43天(第四次免疫)純化的500 μg蛋白與不完全佐劑等體積混合注射；第50天耳動脈抽血2 mL，WB鑒定克隆抗體產生情況，ELISA測其血清效價；第53天心動脈采血50 mL。

1.2.10 間接ELISA法檢測多抗血清效價 以純化后的PLC-γ1蛋白作為抗原，以100 μL·孔-1包被于96孔的ELISA反應板，4 ℃過夜；PBST洗板3次后5%脫脂奶粉封閉1 h；PBST洗板3次，以免疫前的兔血清為陰性對照，其余的加入梯度倍比稀釋的兔血清100 μL·孔-1，37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h，PBST洗板3次后100 μL·孔-1加入稀釋后的HRP標記的山羊抗兔IgG，培養(yǎng)箱內孵育1 h，PBST洗板3次；在避光環(huán)境下每孔100 μL的TMB底物顯色液孵育20 min后1.5 mol·L-1H2SO4終止反應，在OD450 nm條件下檢測吸光值，若陰性對照的吸光值小于或等于所測孔吸光值的2.1倍，則為陽性，重復試驗3次；并分別對每試驗組免疫后第0、36、50、53天的兔血清按上述方法進行間接ELISA檢測。

1.2.11 使用飽和硫酸銨法純化多克隆抗體 試驗兔的心動脈血在4 ℃離心機內13 000 r·min-1離心30 min；收集血清后與生理鹽水1∶1混合，緩慢滴加飽和硫酸銨(SAS)，并不斷攪拌下，4 ℃靜置10 h，使蛋白充分沉淀；13 000 r·min-1離心10 min后棄上清；沉淀中緩慢加入生理鹽水使其充分溶解后滴加SAS，4 ℃放置1 h；生理鹽水溶解沉淀并裝入透析袋放入盛有PBS的燒杯，于4 ℃冰箱數(shù)次更換透析液，-20 ℃保存。

1.2.12 WB鑒定多克隆抗體特異性 以稀釋后的兔血清為一抗，WB鑒定多克隆抗體特異性，DAB顯色后拍照留存。

1.2.13 卵母細胞的成熟培養(yǎng) 綿羊卵巢采自新疆石河子市屠宰場，在添加青鏈霉素(100 IU·mL-1)的38.5 ℃生理鹽水中保溫，2 h內運回實驗室。清理綿羊卵巢結締組織后用生理鹽水洗滌3次，在含2 mL割卵液的60 mm培養(yǎng)皿中收集胞質均勻、卵丘細胞包裹完整的卵丘-卵母細胞復合體(COCs)，在成熟培養(yǎng)液潤洗3次后成熟培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為38.5 ℃、5% CO2飽和濕度。將卵丘-卵母細胞復合體(COCs)體外成熟培養(yǎng)24 h后，在透明質酸酶(Sigma)中作用5 min除去顆粒細胞，然后在體視顯微鏡下挑選排出第一極體的成熟卵母細胞分組備用。

1.2.14 卵母細胞的孤雌激活 將成熟的卵母細胞隨機分為Ion-6D組、PLC-γ1組、空載組3組。PLC-γ1組的卵母細胞采用顯微注射pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1重組質粒的方式進行孤雌激活，空載組的卵母細胞進行顯微注射pcDNA3.1-EGFP質粒。將PLC-γ1組的卵母細胞置于100 μL操作溶液(CB)中，用1 mL石蠟油覆蓋制成微滴。在倒置熒光顯微操作儀上用內徑100 μm、外徑為120 μm的固定針固定卵母細胞，用內徑為5～7 μm的注入針吸取4 pL的[26]重組質粒pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1，注入針經(jīng)透明帶進入卵母細胞胞質內，緩慢將重組質粒注入胞質內，輕輕退出注入針完成顯微注射，全部卵母細胞的顯微注射操作于1 h內結束(圖1)；以相同的顯微注射方法，實現(xiàn)空載組卵母細胞的注入；Ion-6D組以離子霉素(Ion)結合6-DMAP發(fā)生孤雌激活，Ion-6D組的卵母細胞在離子霉素微滴中作用約5 min，后置于6-DMAP微滴中作用4 h。激活后將3組卵母細胞分別置于100 μL SoFaa培養(yǎng)液(自配，成分來自Sigma)微滴中培養(yǎng)48 h，后每隔48 h更換50 μL SoFaa培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。參考李昊[27]對不同時期綿羊早期胚胎的研究方法，對3組不同處理方式的卵母細胞在卵裂后不同時期(2細胞期、4細胞期、8細胞期、桑椹胚期)的綿羊早期胚胎進行收集，各時期100個細胞，重復試驗3次，對收集到的細胞進行總RNA提取及全蛋白提取。

A. 顯微注射pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1質粒；B. 顯微注射pcDNA3.1-EGFP質粒

1.2.15 實時定量PCR檢測綿羊早期胚胎發(fā)育各時期PLC-γ1 mRNA表達情況 使用GenEluteTM單細胞RNA純化試劑盒(Sigma)對綿羊早期胚胎發(fā)育各時期細胞進行總RNA提取，進行反轉錄試驗，對反轉錄后的產物進行qPCR反應，反應體系、條件同“1.2.5”，反應結束后，計算mRNA水平上PLC-γ1表達情況。

1.2.16 WB檢測綿羊早期胚胎發(fā)育各時期PLC-γ1蛋白表達情況 使用全蛋白提取試劑盒(Solarbio)對綿羊早期胚胎發(fā)育各時期細胞進行總蛋白提取，5×SDS蛋白上樣液煮沸變性，免疫印跡法(稀釋后的兔血清為一抗，稀釋后的羊抗兔辣根過氧化物酶標二抗為二抗)檢測PLC-γ1蛋白表達。

1.2.17 統(tǒng)計分析 采用GraphPad Prism 8.0繪制結果圖形。并采用IBM SPSS Statistics 26軟件對數(shù)據(jù)進行解析。各組之間的多重因素比較可以通過鄧肯檢驗加以評定。單因素方差分析(ANOVA)可以用來確定各組間的差異性。而兩組間差異性可以使用學生t檢測。數(shù)據(jù)以“平均值±SEM”表示。P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。每組數(shù)據(jù)中不同字母表示其平均值間有顯著差異(P<0.05)。

2 結 果

2.1 pMD19-T-P2A-Flag-PLC-γ1克隆載體的構建

以實驗室保存的Puc57-P2A-Flag-PLC-γ1菌株為模板，成功擴增出約3 960 bp的目的片段(圖2)，以PLC-γ1-Yiyuan為引物，經(jīng)過菌液PCR驗證，成功擴增出約330 bp基因片段(圖3)。篩選出陽性克隆測序，測序結果Blast后與NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，結果顯示與綿羊羊磷脂酶C γ1(PLCG1)轉錄本變體X3(登錄號:XM_027977197.2)基因同源性為100%，X1(登錄號:XM_027977196.2)的同源性達到98.56%，與轉錄本變體X2(登錄號:XM_042230134.1)的同源性達到98.35%。表明成功構建pMD19-T-P2A-Flag-PLC-γ1克隆載體。

M.DNA相對分子質量標準；1～2.PCR產物；N.陰性對照

M. DNA相對分子質量標準 (50～1 031 bp)；1～6. 菌液PCR產物；N. 陰性對照

2.2 pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1過表達載體的構建

將克隆后的基因片段連接至pcDNA3.1-EGFP載體，轉入大腸桿菌DH5α后，以PLC-γ1-Yiyuan為引物，經(jīng)過菌液PCR驗證，成功擴增出約330 bp基因片段(圖4)，雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳結果證實成功切出目的基因片段(圖5)，測序結果正確，以上結果均表明，成功構建了pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1過表達載體。

M. DNA相對分子質量標準(50～1 031 bp)；1～3. 菌液PCR產物；N. 陰性對照；4. pcDNA3.1-EGFP空載

M. DNA相對分子質量標準；1、3. pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1 Hind Ⅲ、Age Ⅰ雙酶切產物；N. 陰性對照

2.3 重組質粒pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1轉染HEK-293T細胞

轉染24 h后在熒光顯微鏡下觀察HEK-293T細胞，成功觀測到綠色熒光(圖6)。

A. 正常HEK-293T細胞(明場)；B. 正常HEK-293T細胞(暗場)；C. 正常HEK-293T細胞Merge圖；D. pcDNA3.1-EGFP轉染HEK-293T細胞(明場)；E. pcDNA3.1-EGFP轉染HEK-293T細胞(暗場)；F. pcDNA3.1-EGFP轉染HEK-293T細胞Merge圖；G. pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1轉染HEK-293T細胞(明場)；H. pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1轉染HEK-293T細胞(暗場)；I. pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1轉染HEK-293T細胞Merge圖

2.4 HEK-293T細胞PLC-γ1基因水平表達

轉染成功的HEK-293T細胞采用RT-qPCR檢測方法對細胞的PLC-γ1基因進行mRNA表達量的檢測，試驗結果顯示過表達組mRNA水平上PLC-γ1基因與Control組及空載組相比表達量明顯升高，差異極顯著(P< 0.01)。而空載組其表達量接近于Control組，因此兩者之間沒有差異(P> 0.05)(圖7)。

1.Control組；2.空載組；3.過表達組。*. P>0.05；**.P<0.05；***.P<0.01。下同

2.5 HEK-293T細胞PLC-γ1蛋白水平表達

對轉染成功后的HEK-293T細胞裂解收集總蛋白，同時設置正常HEK-293T細胞、空載體對照，進行WB分析。WB結果顯示在149 ku大小處有目標條帶(圖8)，分析結果顯示檢測目的蛋白大小與PLC-γ1蛋白一致，且蛋白表達量存在差異(圖9)。

1. HEK-293T細胞總蛋白；2. pcDNA3.1-EGFP轉染HEK-293T細胞總蛋白；3. pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1轉染HEK-293T細胞總蛋白

1. HEK-293T細胞總蛋白；2. pcDNA3.1-EGFP轉染HEK-293T細胞總蛋白；3. pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1轉染HEK-293T細胞總蛋白

2.6 重組蛋白pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1的純化及鑒定

經(jīng)Anti-Flag免疫磁珠純化后的蛋白及Flag-tag蛋白進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳及WB檢測，結果顯示使用Anti-Flag免疫磁珠成功純化出目的蛋白(149 ku)(圖10)。

M.蛋白相對分子質量標準；1、4. pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1轉染HEK-293T細胞總蛋白；2、5.經(jīng)Anti-Flag免疫磁珠純化的PLC-γ1蛋白；3、6. Flag-tag蛋白

2.7 間接ELISA法檢測多抗血清的效價

為制備特異性抗原肽，對2只新西蘭大白兔進行免疫，使用間接ELISA法檢測血清效價，重復試驗3次，取平均值(表2、圖11)。當制備的PLC-γ1多抗稀釋比例至1∶12 800時，Rabbit1的OD450 nm值為0.394，Rabbit2的OD450 nm值為0.262，其與陰性對照孔相比仍然都大于2.1倍，因此多抗血清效價為1∶12 800。

表2 ELISA初步檢測血清效價

圖11 多抗血清的ELISA效價檢測

2.8 多克隆抗體的鑒定

WB結果顯示，在約149 ku區(qū)域，PLC-γ1蛋白與制備的多克隆抗體成功結合(圖12)，這表明所制備的兔多克隆抗體具有很好的特異性。

1、2、4、5. pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1轉染HEK-293T細胞總蛋白；3、6. pcDNA3.1-EGFP轉染293T細胞總蛋白

2.9 孤雌激活后觀察胚胎發(fā)育狀況

Ion-6D孤雌激活的卵母細胞在激活后48 h開始卵裂；顯微注射pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1載體的卵母細胞在注射后48 h開始卵裂，熒光顯微鏡下觀察可成功觀測到綠色熒光(圖13)；注射空載體組的卵母細胞沒有卵裂現(xiàn)象，排除了顯微注射過程中機械刺激與pcDNA3.1-EGFP空載激活卵母細胞的可能性。綜上所述，說明PLC-γ1重組質?？稍诼涯讣毎邪l(fā)揮作用，且具有作為新的卵母細胞激活因子的潛能。

A. Ion-6D孤雌激活(明場)；B. Ion-6D孤雌激活(暗場)；C. Ion-6D孤雌激活Merge圖；D. 顯微注射pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1載體(明場)；E. 顯微注射pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1載體(暗場)；F. 顯微注射pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1載體Merge圖；G. 顯微注射pcDNA3.1-EGFP載體(明場)；H. 顯微注射pcDNA3.1-EGFP載體(暗場)；I. 顯微注射pcDNA3.1-EGFP載體Merge圖

2.10 綿羊早期胚胎發(fā)育各時期PLC-γ1基因水平表達

對Ion-6D激活及顯微注射處理后的兩組綿羊早期胚胎采用RT-qPCR方法檢測其發(fā)育過程中各細胞時期的PLC-γ1基因mRNA表達量，試驗結果顯示，兩組早期胚胎在發(fā)育過程中PLC-γ1基因mRNA表達量都存在先下降后上升的趨勢，且在桑葚胚時期表達量劇增；顯微注射組與Ion-6D激活組相比，除2細胞期外，其他時期表達量不斷升高，差異顯著性不斷增強(圖14)。

圖14 激活后綿羊早期胚胎發(fā)育各時期PLC-γ1基因mRNA表達量

2.11 綿羊早期胚胎發(fā)育各時期PLC-γ1蛋白水平表達

對孤雌激活后胚胎發(fā)育至2細胞期、4細胞期、8細胞期、桑椹胚期的細胞裂解收集總蛋白，進行WB分析。分析結果顯示，在149 ku處不同處理方式下不同時期的早期胚胎其蛋白表達量存在差異(圖15、圖16)。

1.成熟卵母細胞；2、4、6、8. Ion-6D激活后綿羊早期胚胎發(fā)育至2細胞期、4細胞期、8細胞期、桑葚胚期；3、5、7、9. 顯微注射后綿羊早期胚胎發(fā)育至2細胞期、4細胞期、8細胞期、桑葚胚期

圖16 綿羊早期胚胎發(fā)育各時期PLC-γ1蛋白相對豐度

3 討 論

研究表明，PLC-γ1在許多組織中都存在廣泛表達的現(xiàn)象，尤其是在神經(jīng)細胞組織中大量表達[28-29]，且對細胞的生長、繁殖，胚胎發(fā)育，癌癥的發(fā)生與凋亡[30-33]等方面起著至關重要的作用。PLC對綿羊卵母細胞胞質鈣振蕩和早期胚胎發(fā)育影響的研究中發(fā)現(xiàn)，PLC在卵母細胞激活時啟動Ca2+釋放，促進胚胎發(fā)育，而且在早期胚胎發(fā)育過程中也引起Ca2+波動，說明PLC對胚胎發(fā)育至關重要，因此PLCγ具有相同的作用，但是PLC不同亞型之間啟動不同的調控機制，實現(xiàn)其在信號轉導通路中復雜、精密、各異的調控功能。在卵細胞成熟過程中，PLC-γ1對顆粒細胞的發(fā)育[34-35]有著重要影響，且在轉基因研究上表明其調控小鼠[36]和斑馬魚[37-38]的胚胎發(fā)育，說明PLC-γ1在調控早期胚胎發(fā)育過程中有著重要作用。但其確切的作用機制仍不清楚，目前，隨著生命科學的迅速發(fā)展，PLC-γ1在生殖發(fā)育中發(fā)揮的作用逐漸引起了人們的關注，特別是其對精子的發(fā)生發(fā)育、卵子受精和胚胎發(fā)育影響的研究日益成為生殖發(fā)育領域的熱點。因此，對于PLC-γ1真核過表達載體的構建以及多克隆抗體的制備，都是上述研究開展的基礎。

在現(xiàn)代生物技術的支持下，很難從組織中獲取高純度可溶性、功能性蛋白質，且天然蛋白質來源較少，很難滿足生物試驗的要求，因此，需要引入基因工程來實現(xiàn)蛋白質的體外過表達。為大量獲取重組蛋白，越來越多研究人員選擇使用真核和原核系統(tǒng)表達獲取目的蛋白。本試驗為能夠快速靈活的制備高活性、多復雜修飾的純化綿羊PLC-γ1蛋白，選擇帶有綠色熒光標記的真核過表達系統(tǒng)pcDNA3.1-EGFP。為減少重組質粒上的熒光蛋白對目的蛋白活性的影響，在目的片段中引入P2A序列，由于綿羊PLC-γ1蛋白沒有相對應抗體，為方便鑒定，在目的片段中引入Flag標簽。最終構建了pcDNA3.1-EGFP-P2A-Flag-PLC-γ1真核過表達載體。通過轉染HEK-293T細胞成功表達PLC-γ1蛋白后使用Anti-Flag免疫磁珠純化蛋白以減少非特異吸附，將表達的PLC-γ1蛋白混入弗氏佐劑免疫試驗兔，ELISA測得血清效價可達1∶12 800。試驗所制備的多克隆抗體會對PLC-γ1蛋白產生特異性反應，表明筆者所用的高質量的鼠源IgG1重組抗體與納米磁珠共價偶聯(lián)制備的Anti-Flag免疫磁珠所純化的蛋白質具有良好的免疫原性，可誘導發(fā)生良好的體液免疫反應。通過與馬忠臣等[39]、楊義[40]的研究結果進行對比發(fā)現(xiàn)，抗體產生的速率與多種因素存在直接聯(lián)系，其與目的蛋白的特性，所混弗氏佐劑的劑量，所免疫試驗動物物種的特性都存在著一定的關系。這在一定程度上可為動物免疫試驗提供參考數(shù)據(jù)。本研究在綿羊早期胚胎細胞發(fā)育階段通過熒光顯微鏡可觀察到綠色熒光，表明PLC-γ1重組質?？稍诰d羊早期胚胎細胞中發(fā)揮作用。且提取綿羊各時期早期胚胎的mRNA及全蛋白進行RT-qPCR及WB檢測表明，PLC-γ1在綿羊早期胚胎各時期均有表達。且在綿羊早期胚胎細胞發(fā)育過程中PLC-γ1表達量在不同時期呈現(xiàn)出不同的趨勢，表明PLC-γ1在綿羊早期胚胎細胞不同的發(fā)育階段發(fā)揮著不同的作用。

綿羊是一種常見的家養(yǎng)動物，同時也經(jīng)常是人類某些疾病研究的動物模型，因此，接下來的研究重點將是以綿羊卵母細胞為研究對象，進一步探索PLC-γ1蛋白對早期胚胎發(fā)育的分子機制。筆者后期打算應用基因沉默、流式分選、共聚焦監(jiān)測鈣離子波動等技術和方法，篩選關鍵的作用因子和信號通路，為探索PLC-γ1在綿羊卵母細胞中蛋白表達的作用機理提供新的理論依據(jù)，也為探索PLC-γ1通過信號通路調節(jié)卵母細胞成熟的作用機理研究提供新的理論依據(jù)，為后續(xù)一系列揭示綿羊早期胚胎發(fā)育的分子機制試驗奠定基礎，對動物胚胎過程的發(fā)展及提高人類輔助生殖健康具有重要意義。

4 結 論

本研究成功構建了PLC-γ1真核過表達載體并制備了綿羊PLC-γ1多克隆抗體，通過顯微注射技術將重組質粒注入卵母細胞并實現(xiàn)表達，證明PLC-γ1在綿羊早期胚胎發(fā)育各時期均有表達，且具有作為新的卵母細胞激活因子的潛能。既為探索綿羊PLC-γ1基因對卵母細胞激活作用及早期胚胎發(fā)育的影響提供了科學依據(jù)，也為進一步提升綿羊的繁殖性能研究奠定了基礎。