胡智輝，王 歡，衡 諾，鞏建飛，王 憶，王雅春，趙善江*，朱化彬*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物遺傳育種與繁殖(家禽)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京100193)

牛胚胎生產(chǎn)與移植技術(shù)可以充分利用優(yōu)秀種公牛和優(yōu)秀母牛的遺傳資源[1-2]，獲得大量具有高遺傳品質(zhì)的牛體內(nèi)、外胚胎，對(duì)于良種母牛繁殖潛力的挖掘、快速擴(kuò)繁以及種質(zhì)資源保護(hù)具有重要的價(jià)值。經(jīng)過(guò)不斷的研究和完善，牛體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)取得了巨大進(jìn)步，并在生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用[3-4]。國(guó)際胚胎移植協(xié)會(huì)最新數(shù)據(jù)顯示，2020年全球共生產(chǎn)可移植牛體內(nèi)胚胎約36萬(wàn)枚，與2019年相比總體下降。然而生產(chǎn)的牛體外胚胎總數(shù)卻逐年攀升，2020年已超115萬(wàn)枚[5]。隨著活體采卵-體外受精技術(shù)在我國(guó)乃至世界范圍的興起[6-7]，體外胚胎生產(chǎn)正在成為牧場(chǎng)優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源擴(kuò)繁的主要技術(shù)手段。但是，目前體外胚胎技術(shù)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用還存在成本高、移植妊娠率低等問(wèn)題[8-9]。在過(guò)去的15～20年里，體外胚胎移植妊娠率低這一現(xiàn)狀非但沒(méi)有得到改善甚至還在繼續(xù)下降[10-11]。

胚胎質(zhì)量是決定胚胎移植后妊娠率高低的關(guān)鍵[12-13]，如果能在植入前對(duì)胚胎進(jìn)行質(zhì)量鑒定，在排除一些自身存在染色體問(wèn)題的胚胎基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)對(duì)胚胎生產(chǎn)性能的評(píng)估，那么將大大提高胚胎移植后的受胎率和犢牛的價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)，體外胚胎染色體異常導(dǎo)致的胚胎發(fā)育能力異常是影響體外胚胎妊娠率最根本的原因[5, 14]。染色體異常與胚胎質(zhì)量、胚胎移植后妊娠率以及胎兒發(fā)育直接相關(guān)，同時(shí)也是導(dǎo)致早期胚胎死亡以及先天性缺陷疾病的主要原因[15]。當(dāng)下，人類(lèi)胚胎植入前檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到了較高的水平，可以實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)檢測(cè)，篩選優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植以保證受胎率和后代質(zhì)量[16-17]。但是，牛胚胎遺傳價(jià)值或生產(chǎn)性能的測(cè)定還處于起步階段，相應(yīng)的微創(chuàng)胚胎取樣技術(shù)、單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增和芯片檢測(cè)等相關(guān)工作尚未見(jiàn)在國(guó)內(nèi)開(kāi)展。因此，本研究以牛體內(nèi)外胚胎為研究材料，探究利用胚胎微創(chuàng)取樣技術(shù)對(duì)胚胎進(jìn)行生產(chǎn)性能測(cè)定的可行性，以期為進(jìn)口遺傳物質(zhì)監(jiān)管和胚胎質(zhì)量鑒定提供一套可行的操作方案。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用體內(nèi)胚胎為實(shí)驗(yàn)室自有胚胎，體外胚胎為實(shí)驗(yàn)室利用離體卵巢通過(guò)體外受精所生產(chǎn)的胚胎，離體卵巢來(lái)自河北省廊坊市大廠屠宰場(chǎng)，精液來(lái)自山東奧克斯公司。

1.2 主要試劑與儀器

所有體外胚胎生產(chǎn)相關(guān)試劑均購(gòu)自Sigma公司；MALBAC全基因組擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自?xún)|康醫(yī)療；胚胎培養(yǎng)皿購(gòu)自Thermo公司。CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo公司；體式顯微鏡購(gòu)自Nikon公司；胚胎切割儀購(gòu)自AB公司。

1.3 體外胚胎生產(chǎn)

1.3.1 卵母細(xì)胞采集及體外成熟 將屠宰場(chǎng)卵巢置于28～30 ℃滅菌生理鹽水中保存，2 h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。用加有雙抗的滅菌生理鹽水清洗3遍。用配有18號(hào)無(wú)菌針頭的真空蠕動(dòng)泵抽取卵巢上3～6 mm 卵泡，在體視顯微鏡下用口吸管挑選胞質(zhì)均勻、卵丘致密且包裹至少 3 層以上卵丘細(xì)胞的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，置于 38.5 ℃，5% CO2，飽和濕度的 CO2培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng) 22～24 h。

1.3.2 體外受精 卵母細(xì)胞處理：將體外成熟 22～24 h 后的COCs用受精液洗滌3次后，移入受精液微滴中，準(zhǔn)備進(jìn)行體外受精。精液處理：將冷凍精液在 38 ℃ 左右的水浴鍋中解凍，用洗精液洗滌精液，然后1 800 r·min-1離心 8 min，棄上清，重復(fù)兩次；用洗精液重新懸浮精子沉淀;用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)算精子密度，調(diào)整精子密度至每毫升 2×106個(gè)。體外受精：將精液重懸液加入含有COCs的受精液中，置于 38.5 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中精卵共孵育 8～18 h。

1.3.3 體外胚胎培養(yǎng) 將受精后的受精卵脫去顆粒細(xì)胞后移入前期液中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h 后觀察并記錄受精卵的卵裂情況。之后移入后期液中繼續(xù)培養(yǎng)，此后每 2 d 進(jìn)行一次半量換液，體外培養(yǎng) 7～8 d 后，觀察并記錄囊胚的發(fā)育情況。

1.4 胚胎切割取樣

用不含鈣、鎂的DPBS在平皿中做3個(gè)洗滴，將胚胎在洗滴中洗滌兩次后移入最后一個(gè)洗滴，此時(shí)胚胎可牢固的貼在底部，將平皿置于胚胎切割儀的顯微鏡下，通過(guò)操作臂快速切取少量滋養(yǎng)層細(xì)胞。用口吸管將滋養(yǎng)層細(xì)胞吸出并移入提前配制好的胚胎裂解液中(注意吸取過(guò)程應(yīng)盡可能少帶液)，每切割一枚胚胎要重新?lián)Q洗液，同時(shí)用酒精擦拭切割刀片，裂解液可直接進(jìn)行全基因組擴(kuò)增或暫存于-80 ℃。切割后剩余的胚胎移入后期液中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察胚胎是否繼續(xù)發(fā)育并計(jì)算切割發(fā)育率。

體外2細(xì)胞和8細(xì)胞切割取樣方法及注意事項(xiàng)與胚胎取樣基本一致，將胚胎透明帶切開(kāi)，推出卵裂球，吸取卵裂球放入胚胎裂解液中。

1.5 血液采集

選取11頭母牛，使用含EDTA的采血管進(jìn)行采血，全部采集牛尾根部血液，暫存于-20 ℃。

1.6 DNA提取及全基因組擴(kuò)增

對(duì)于胚胎樣品，使用億康醫(yī)療的MALBAC全基因組擴(kuò)增試劑盒。在 5 μL胚胎裂解產(chǎn)物中加入 30 μL 預(yù)擴(kuò)增混合液，放入PCR 儀中進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。預(yù)擴(kuò)增結(jié)束后在 35 μL 的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物中加入 30 μL 擴(kuò)增混合液，放入PCR儀中進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后使用NanoDrop 核酸測(cè)定儀檢測(cè)擴(kuò)增后DNA濃度及純度，將符合要求的DNA存于-80 ℃?zhèn)溆?，并?jì)算擴(kuò)增成功率，即擴(kuò)增后的DNA量大于1 000 ng且OD值在1.7～2.1之間。

對(duì)于血液樣品，使用磁珠法進(jìn)行全血基因組DNA提取，簡(jiǎn)單地說(shuō)就是向全血中加入裂解液、異丙醇、磁珠懸浮液，將離心管放于磁力架上待磁珠完全吸附于離心管側(cè)壁后徹底棄去溶液，使用漂洗液進(jìn)行兩次漂洗，使用洗脫液將DNA洗脫下來(lái)，存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7 芯片檢測(cè)

進(jìn)行DNA擴(kuò)增、酶促片段化、沉淀和重懸。隨后樣本過(guò)夜孵育的過(guò)程中與BeadChip雜交，DNA經(jīng)退火得到位點(diǎn)特異性的50-mer探針，與某種Infinium微珠類(lèi)型共價(jià)偶聯(lián)。Infinium XT工作流程繼續(xù)酶基延伸賦予等位基因特異性，然后進(jìn)行熒光染色。iScan系統(tǒng)檢測(cè)微珠的熒光強(qiáng)度，llumina軟件自動(dòng)執(zhí)行分析和基因型識(shí)別。

1.8 芯片數(shù)據(jù)分析

各組樣品命名如下：采集的牛全血樣品組命名為血液組(blood)、切取的半個(gè)體內(nèi)胚胎組命名為1/2體內(nèi)胚組(half-vivo)，體內(nèi)胚胎切取的滋養(yǎng)層組命名為體內(nèi)滋養(yǎng)層組(vivo-tec)、體外胚胎切取的滋養(yǎng)層組命名為體外滋養(yǎng)層組(vitro-tec)、體外獲得的2細(xì)胞切取的單個(gè)卵裂球組命名為體外2細(xì)胞組(2-cell)、體外獲得的8細(xì)胞切取的單個(gè)卵裂球組命名為體外8細(xì)胞組(8-cell)。

首先通過(guò)R語(yǔ)言將各組所有SNP缺失位點(diǎn)篩選出來(lái)，將至少3個(gè)連續(xù)SNPs缺失認(rèn)為染色體片段缺失[18]。為進(jìn)一步篩選各組在全基因組擴(kuò)增前染色體缺失情況，同時(shí)減小全基因擴(kuò)增隨機(jī)性導(dǎo)致的假片段缺失，試驗(yàn)最終以連續(xù)7個(gè)SNPs(含7個(gè))缺失認(rèn)為染色體片段缺失。

1.9 基因篩選、GO注釋和KEGG功能富集分析

本研究使用ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)(asia.ensembl.org)中的biomart 模塊將體內(nèi)滋養(yǎng)層組和體外滋養(yǎng)層組中連續(xù)7個(gè)及以上SNPs缺失的片段中包含的基因篩選出來(lái)，將篩選出的基因使用R語(yǔ)言進(jìn)行GO注釋和KEGG功能富集分析。

1.10 芯片數(shù)據(jù)填充及生產(chǎn)性能預(yù)測(cè)

本研究使用Beagle 5.1將Illumina 100K Bovine Bead chip芯片數(shù)據(jù)填充至Illumina 150K Bovine Bead chip。整合兩種不同密度芯片：100K芯片位點(diǎn)共計(jì)95 256個(gè)，150K芯片位點(diǎn)共計(jì)123 268個(gè)，根據(jù)位點(diǎn)名稱(chēng)進(jìn)行匹配，重合位點(diǎn)共計(jì)64 958個(gè)。使用Plink (https: //www.cog-genomics.org/plink2)處理軟件將原始文件轉(zhuǎn)化為VCF (variant call format)格式。使用Beagle 5.1軟件進(jìn)行基因定向和填充過(guò)程，計(jì)算填充準(zhǔn)確性。使用一步法進(jìn)行基因組育種值預(yù)測(cè)，結(jié)果共有3項(xiàng)：產(chǎn)奶量、乳脂量以及乳蛋白量。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，各組數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS 9.2進(jìn)行單因素方差分析及多重比較，不同字母代表組間差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 胚胎切割及發(fā)育率

試驗(yàn)分別對(duì)體內(nèi)囊胚、體外囊胚、體外2細(xì)胞和8細(xì)胞胚胎進(jìn)行切割取樣，分別切取體內(nèi)胚胎1/2(half-vivo)、一小部分滋養(yǎng)層(vivo-tec)，體外胚胎一小部分滋養(yǎng)層(vitro-tec)、體外2和8細(xì)胞胚胎的單個(gè)卵裂球(2-cell和8-cell組)，切割結(jié)果如圖1所示。本研究中，2-cell和8-cell組僅作為單細(xì)胞擴(kuò)增組，用于驗(yàn)證優(yōu)化擴(kuò)增程序，其余各組切割取樣后均繼續(xù)培養(yǎng)，觀察發(fā)育率。切割后發(fā)育率結(jié)果如圖2所示，vivo-tec組和vitro-tec組的切割發(fā)育率均大于90%((94.4±5.6)%vs.(90.5±6.6)%)，half-vivo組切割后的發(fā)育率為(22.2±14.7)%(2/9)。這說(shuō)明切取半個(gè)胚胎對(duì)胚胎的發(fā)育有較大影響，而切取少量滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)胚胎繼續(xù)發(fā)育影響較小，符合胚胎微創(chuàng)取樣要求，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

A.體內(nèi)囊胚；B.切割后的體內(nèi)囊胚；C.體內(nèi)囊胚切割后培養(yǎng)24 h；D.體外囊胚；E.切割后的體外囊胚；F.體外囊胚切割后培養(yǎng)24 h

圖2 各組胚胎切割后體外培養(yǎng)發(fā)育率

2.2 全基因組擴(kuò)增成功率

胚胎切割后各組樣品通過(guò)MALBAC法進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，當(dāng)擴(kuò)增后的DNA量大于1 000 ng且OD值在1.7～2.1之間時(shí)認(rèn)為擴(kuò)增成功。擴(kuò)增成功率如圖3所示，1/2體內(nèi)胚組和體外2細(xì)胞組DNA擴(kuò)增成功率為100%，與上述兩組相比，體內(nèi)滋養(yǎng)層組、體外滋養(yǎng)層組和體外8細(xì)胞組擴(kuò)增成功率呈依次下降趨勢(shì)，其中體外8細(xì)胞組擴(kuò)增成功率僅(60.0±24.5)%，為各組最低。這說(shuō)明在相同的擴(kuò)增條件下，全基因組擴(kuò)增成功率可能與起始DNA含量正相關(guān)，切割獲取的起始DNA量越多，擴(kuò)增成功率越高。

圖3 不同組擴(kuò)增成功率的差異

2.3 全基因組擴(kuò)增后DNA量

全基因組擴(kuò)增后各組DNA量如表1所示，1/2體內(nèi)胚組DNA量最高(3 277.69±105.41)，體外8細(xì)胞組最低(1 030.00±427.04)。與1/2體內(nèi)胚組相比，體內(nèi)滋養(yǎng)層組和體外滋養(yǎng)層組全基因組擴(kuò)增后DNA量均顯著下降 (P<0.05)，且體外滋養(yǎng)層組全基因組擴(kuò)增后DNA量顯著低于體內(nèi)滋養(yǎng)層組 (P<0.05)，與體外2細(xì)胞組相比，體外8細(xì)胞組全基因組擴(kuò)增后DNA量顯著下降 (P<0.05)。

表1 各組全基因組擴(kuò)增后DNA量

2.4 芯片檢出率

如圖4所示，與擴(kuò)增后DNA量一致，各組芯片檢出率呈現(xiàn)相同的規(guī)律，1/2體內(nèi)胚組的檢出率最高，可用于后續(xù)生產(chǎn)性能評(píng)估，其余各組依次下降。相較于1/2體內(nèi)胚組，體內(nèi)滋養(yǎng)層組和體外滋養(yǎng)層組的檢出率均顯著下降(P<0.05)，且檢出率均低于90%，芯片檢出率無(wú)法滿(mǎn)足后續(xù)生產(chǎn)性能評(píng)估要求，需要進(jìn)一步進(jìn)行芯片填充才能預(yù)測(cè)胚胎價(jià)值。體外2細(xì)胞組和8細(xì)胞組的檢出率也均低于90%，且8細(xì)胞組檢出率顯著低于其余各組(P<0.05)。進(jìn)一步對(duì)各組擴(kuò)增后DNA量與芯片檢出率進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，兩者相關(guān)度為0.709 5(圖5)，存在較高的相關(guān)性。綜上，起始DNA含量是影響DNA擴(kuò)增和芯片檢出率的關(guān)鍵，起始DNA含量越高(切割取樣量越大)，樣品全基因組擴(kuò)增效率和芯片檢出率越高。

圖4 不同組芯片檢出率的差異

圖5 DNA量與芯片檢出率的關(guān)系圖

2.5 不同組染色體片段缺失情況

為分析各組SNP缺失情況，尤其是檢出率低于90%的各組缺失情況，進(jìn)一步對(duì)各組30對(duì)染色體片段缺失情況進(jìn)行量化統(tǒng)計(jì)。2細(xì)胞和8細(xì)胞在實(shí)際生產(chǎn)中不會(huì)用于胚胎取樣，故本節(jié)重點(diǎn)分析體內(nèi)、外滋養(yǎng)層組的染色體片段缺失情況。此外，為更準(zhǔn)確地分析體內(nèi)、外滋養(yǎng)層組染色體片段缺失情況，試驗(yàn)引入荷斯坦奶牛尾根血芯片數(shù)據(jù)(檢出率均大于90%)作為試驗(yàn)對(duì)照組。對(duì)比分析1/2體內(nèi)胚組、體內(nèi)、外滋養(yǎng)層組與血液組在染色體片段缺失上的差異。

片段缺失標(biāo)準(zhǔn)參考Turner 等[18]的方法，以至少3個(gè)連續(xù)SNPs缺失認(rèn)為染色體片段缺失，統(tǒng)計(jì)各組染色體片段缺失情況。結(jié)果如表2所示，血液組染色體片段缺失量最低(34)，體內(nèi)滋養(yǎng)層組最高(5 982)，與血液組相比，1/2體內(nèi)胚組染色體片段缺失量增加了8.9倍，而與1/2體內(nèi)胚組相比，體內(nèi)滋養(yǎng)層組染色體片段缺失量增加了16.9倍，體外滋養(yǎng)層組染色體片段缺失量增加了14.5倍。這說(shuō)明滋養(yǎng)層取樣會(huì)帶來(lái)較大量的染色體片段缺失，而這一缺失是否會(huì)影響后續(xù)生產(chǎn)性能測(cè)定需要進(jìn)一步加大試驗(yàn)研究量。

表2 不同組染色體片段缺失情況

為進(jìn)一步篩選各組在全基因組擴(kuò)增前染色體缺失情況，同時(shí)減小全基因擴(kuò)增隨機(jī)性導(dǎo)致的假片段缺失，試驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)染色體缺失片段所包含的連續(xù)SNPs數(shù)量進(jìn)行了擴(kuò)大統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表3所示，當(dāng)連續(xù)缺失SNP≥7個(gè)時(shí)，1/2體內(nèi)胚組不再存在片段缺失，故將染色體片段缺失所包含的SNPs數(shù)量擴(kuò)大至7個(gè)用于后續(xù)試驗(yàn)分析。

表3 各組連續(xù)缺失7個(gè)及以上SNPs的片段數(shù)量

2.6 基因篩選、GO注釋和KEGG功能富集分析

進(jìn)一步分析了體外和體內(nèi)滋養(yǎng)層組連續(xù)缺失≥7個(gè)SNPs的染色體片段，分別在體外和體內(nèi)滋養(yǎng)層組發(fā)現(xiàn)了188和388個(gè)缺失片段。隨后用ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)(asia.ensembl.org)中的biomart對(duì)篩選到的缺失片段進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示在體外滋養(yǎng)層組發(fā)現(xiàn)46個(gè)基因，體內(nèi)滋養(yǎng)層組發(fā)現(xiàn)48個(gè)基因。為了確定這些基因是否影響胚胎發(fā)育，對(duì)篩選到的基因進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析。GO富集分析結(jié)果顯示，在體外和體內(nèi)滋養(yǎng)層組分別獲得340個(gè)和306個(gè)GO條目，其中排名前20的如圖6所示(按P值排序)。通過(guò)KEGG富集分析，在體外滋養(yǎng)層組發(fā)現(xiàn)了17條顯著的通路，在體內(nèi)滋養(yǎng)層組發(fā)現(xiàn)了13條顯著富集的通路。圖7顯示了TOP20的通路。

A.體內(nèi)滋養(yǎng)層組；B.體外滋養(yǎng)層組

A.體內(nèi)滋養(yǎng)層組；B.體外滋養(yǎng)層組

2.7 芯片填充準(zhǔn)確性及育種值估計(jì)

本研究填充準(zhǔn)確性是按等位基因一致性比率計(jì)算的，也就是正確填充基因型所占百分比，由R2表示。填充準(zhǔn)確性分布可見(jiàn)圖8，可以看出64 958個(gè)SNP填充位點(diǎn)中52 334個(gè)SNP填充位點(diǎn)的R2在0.99～1之間。本次填充的準(zhǔn)確性為91%。填充后育種值見(jiàn)表4，表中可以看出體內(nèi)滋養(yǎng)層組產(chǎn)奶量估計(jì)育種值最大值為203.94，最小值為61.69，平均值為127.68；乳脂量估計(jì)育種值最大值為3.36，最小值為0.88，平均值為2.39；乳蛋白量估計(jì)育種值最大值為1.13，最小值為-2.68，平均值為-0.84。體外滋養(yǎng)層組產(chǎn)奶量估計(jì)育種值最大值為55.59，最小值為-55.58，平均值為-6.07；乳脂量估計(jì)育種值最大值為9.04，最小值為-4.61，平均值為2.14；乳蛋白量估計(jì)育種值最大值為5.40，最小值為-3.75，平均值為0.47。從平均產(chǎn)奶量估計(jì)育種值看體內(nèi)滋養(yǎng)層組遠(yuǎn)高于體外滋養(yǎng)層組，可能是因?yàn)轶w內(nèi)胚胎在生產(chǎn)時(shí)選擇的是產(chǎn)奶量較高的母本，而體外胚胎所選擇的屠宰場(chǎng)卵巢并不知道生產(chǎn)性能，而且生產(chǎn)性能差的更容易被屠宰，這也說(shuō)明了為什么體外滋養(yǎng)層組的產(chǎn)奶量普遍偏低且有正有負(fù)。而1/2體內(nèi)胚組的母本為試驗(yàn)用牛且生產(chǎn)性能不高，所以獲得的3枚胚胎產(chǎn)奶量、乳脂量、乳蛋白量都偏低。

圖8 填充準(zhǔn)確性分布圖

表4 不同組估計(jì)育種值

3 討 論

自2008年啟動(dòng)奶牛群體遺傳改良計(jì)劃以來(lái)，我國(guó)奶牛群遺傳質(zhì)量明顯提升，DHI測(cè)定群成年母牛平均單產(chǎn)水平逼近10噸。在新一輪的種業(yè)振興大背景下，良種是現(xiàn)代奶業(yè)生產(chǎn)和發(fā)展的基礎(chǔ)，而引進(jìn)或者自產(chǎn)胚胎移植是培育種公牛和快速擴(kuò)充生產(chǎn)群非常有效的技術(shù)手段[19-20]。因此，胚胎的質(zhì)量直接決定著核心種源自主培育和奶牛良種快速擴(kuò)繁的進(jìn)程和速度。當(dāng)下，人類(lèi)胚胎植入前檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到了較高的水平，可以實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)檢測(cè)，篩選優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植以保證受胎率和后代質(zhì)量[16-17，21-22]。但是，牛胚胎遺傳價(jià)值或生產(chǎn)性能的測(cè)定還處于起步階段，相應(yīng)的取樣技術(shù)、微量DNA擴(kuò)增和芯片檢測(cè)等相關(guān)工作均未在國(guó)內(nèi)開(kāi)展。因此，本研究以體內(nèi)、外胚胎為研究材料，探究利用胚胎微創(chuàng)取樣技術(shù)對(duì)胚胎進(jìn)行生產(chǎn)性能測(cè)定的可行性，以期為進(jìn)口遺傳物質(zhì)監(jiān)管和胚胎質(zhì)量鑒定提供一套可行的操作方案。

近年來(lái)，隨著活體采卵-體外受精技術(shù)在我國(guó)乃至世界范圍的興起[23-24]，體外胚胎生產(chǎn)正在成為牧場(chǎng)優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源擴(kuò)繁的主要技術(shù)手段，但是體外胚胎受胎率和活犢率低仍然是當(dāng)前產(chǎn)業(yè)發(fā)展面臨的主要問(wèn)題[5, 8]。如果能在植入前對(duì)胚胎進(jìn)行質(zhì)量鑒定，在排除一些自身存在染色體問(wèn)題的胚胎基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)對(duì)胚胎生產(chǎn)性能的評(píng)估，那么將大大提高胚胎移植后的受胎率和犢牛的價(jià)值。因此，本研究通過(guò)胚胎切割技術(shù)對(duì)比分析了不同切割取樣大小對(duì)取樣后胚胎存活率、DNA擴(kuò)增等方面的影響，結(jié)果表明利用胚胎切割儀切取少量滋養(yǎng)層細(xì)胞后，90%以上的胚胎可以繼續(xù)發(fā)育孵化，提示這種取樣方法適用于胚胎微創(chuàng)取樣，這與Balvís等[25]的結(jié)果一致。

全基因組選擇方法是通過(guò)檢測(cè)芯片上SNP位點(diǎn)來(lái)評(píng)測(cè)個(gè)體的生產(chǎn)性能[26-27]，為保證芯片SNP檢測(cè)的準(zhǔn)確性，芯片上機(jī)檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析前分別對(duì)DNA量和芯片SNP檢出率都有明確規(guī)定，DNA量大于1 000 ng才能上機(jī)檢測(cè)，芯片檢出率高于90%才能進(jìn)行芯片數(shù)據(jù)分析。微創(chuàng)取樣的目的是盡可能減少對(duì)胚胎的損傷，但相應(yīng)的問(wèn)題就是細(xì)胞量少導(dǎo)致DNA初始含量過(guò)低，以至于無(wú)法應(yīng)用常規(guī)的全基因組擴(kuò)增方法進(jìn)行擴(kuò)增。為更均勻、準(zhǔn)確的獲得少量細(xì)胞的基因組結(jié)果，試驗(yàn)與中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)高帥課題組合作，使用MALBAC技術(shù)對(duì)切取的少量TE進(jìn)行擴(kuò)增，MALBAC是線(xiàn)性放大[28]，可以將獲取的極少量胚胎細(xì)胞中的DNA均勻擴(kuò)增上百萬(wàn)倍以滿(mǎn)足基因分析的需求[29]。MALBAC擴(kuò)增結(jié)果表明，各組擴(kuò)增后DNA含量和OD值均符合要求，這其中1/2體內(nèi)胚組和體外2細(xì)胞組DNA擴(kuò)增成功率最高，體內(nèi)滋養(yǎng)層組、體外滋養(yǎng)層組和8細(xì)胞組擴(kuò)增成功率呈依次下降趨勢(shì)。擴(kuò)增后各組DNA量與擴(kuò)增成功率趨勢(shì)大體一致，起始細(xì)胞量越少，擴(kuò)增后DNA量也越少。這說(shuō)明在相同的擴(kuò)增條件下，全基因組擴(kuò)增成功率可能與起始DNA含量正相關(guān)，切割獲取的起始DNA量越多，擴(kuò)增成功率越高，與此同時(shí)取樣細(xì)胞量與MALBAC擴(kuò)增后DNA量也呈正相關(guān)。DNA擴(kuò)增成功率與取樣后胚胎存活率呈負(fù)相關(guān)，1/2體內(nèi)胚組DNA擴(kuò)增成功率和DNA量均最高，說(shuō)明此擴(kuò)增方法適用于牛的全基因組擴(kuò)增，但是切取1/2胚胎對(duì)胚胎本身有較大損傷。為了減少切割造成的損傷，試驗(yàn)選擇切取體內(nèi)、外胚胎少量的滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，從DNA擴(kuò)增量水平分析，兩組擴(kuò)增結(jié)果均符合芯片檢測(cè)要求。

芯片檢出率是芯片數(shù)據(jù)分析質(zhì)控的另外一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)[30-31]，以100K芯片為例，當(dāng)芯片檢出率大于90%時(shí)，芯片檢測(cè)數(shù)據(jù)可以進(jìn)行后續(xù)的生產(chǎn)性能預(yù)測(cè)?？紤]到MALBAC技術(shù)的特殊性，試驗(yàn)在胚胎樣品之外又引入了荷斯坦奶牛全血樣本的芯片數(shù)據(jù)作為陽(yáng)性對(duì)照。與全血數(shù)據(jù)相比，胚胎各組芯片檢出率只有1/2體內(nèi)胚組無(wú)顯著性差異，且檢出率大于90%，其余各組均顯著下降且檢出率均低于90%，無(wú)法用于后續(xù)生產(chǎn)性能測(cè)定?；贛ALBAC擴(kuò)增的原理，推測(cè)這可能是因?yàn)槠鹗技?xì)胞量太少導(dǎo)致的，在低起始量的情況下[29]，擴(kuò)增容易出現(xiàn)偏差和非特異性擴(kuò)增。因此使用現(xiàn)有擴(kuò)增條件，在保證胚胎正常發(fā)育的前提下，需要增加取樣量。后續(xù)在取樣技術(shù)沒(méi)有突破之前，MALBAC技術(shù)的迭代尤其是針對(duì)牛的迭代更為重要。

試驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)檢出率低于90%各組SNP缺失情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示體內(nèi)、外滋養(yǎng)層組SNP缺失量比1/2體內(nèi)胚組均高出了15倍以上，這說(shuō)明微量取樣后通過(guò)MALBAC擴(kuò)增會(huì)導(dǎo)致更多的SNP缺失，而這些缺失的SNP是因?yàn)閿U(kuò)增導(dǎo)致還是因?yàn)楸旧戆l(fā)育所致需要進(jìn)一步分析。為減少因全基因組擴(kuò)增隨機(jī)性導(dǎo)致的假片段缺失，試驗(yàn)擴(kuò)大了染色體片段缺失所包含的連續(xù)SNPs數(shù)量，以SNP連續(xù)缺失7個(gè)(含7個(gè))以上作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)篩選到的缺失片段進(jìn)行染色體定位分析和富集分析。染色體定位分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組染色體發(fā)生片段缺失的情況均不相同，其中chr1在兩個(gè)試驗(yàn)組中均片段缺失量最多，這說(shuō)明胚胎發(fā)育過(guò)程中可能存在真實(shí)的染色體片段缺失情況，進(jìn)而導(dǎo)致了chr1在兩個(gè)試驗(yàn)組中染色體片段缺失量明顯上升。

胚胎工程技術(shù)的快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，極大提高了牧場(chǎng)中優(yōu)良個(gè)體的繁殖力[32]，但體外生產(chǎn)的胚胎常出現(xiàn)發(fā)育阻滯、胚胎質(zhì)量差等問(wèn)題[33-34]，Raudsepp和Chowdhary[15]研究發(fā)現(xiàn)，染色體異常與胚胎質(zhì)量、胚胎移植后妊娠率以及胎兒發(fā)育直接相關(guān)。染色體片段缺失是染色體異常較為常見(jiàn)的情況之一，缺失可能發(fā)生于任何一條染色體的任何位置，其發(fā)生原因情況較多，尤其在體外胚胎生產(chǎn)過(guò)程中，培養(yǎng)液、培養(yǎng)環(huán)境、人為操作等均可能對(duì)其造成影響。而且細(xì)胞骨架與細(xì)胞分裂時(shí)紡錘體形成、染色體運(yùn)動(dòng)、胞質(zhì)分裂等事件密切相關(guān)[35-38]。因此，本研究比較了體內(nèi)、外滋養(yǎng)層組的染色體缺失情況，并對(duì)缺失片段中包含的基因進(jìn)行功能富集分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，體外滋養(yǎng)層組排名前5的條目中有3個(gè)條目intermediate filament(GO:0005882)、keratin filament(GO:0045095)、intermediate filament cytoskeleton(GO:0045111)均與微絲蛋白和細(xì)胞骨架相關(guān)，共包括MARK2、SBNO2、GJA1等15個(gè)相關(guān)的基因(圖9)。其中MARK2(microtubule affinity regulating kinase 2)編碼的有絲分裂著絲粒相關(guān)蛋白能夠調(diào)控有絲分裂微管的形成和長(zhǎng)度[39]，同時(shí)在間期和有絲分裂過(guò)程中，MARK2還能調(diào)控肌動(dòng)蛋白和微管細(xì)胞骨架的變化，從而維持細(xì)胞的正常分裂[40]。值得注意的是，在體外滋養(yǎng)層組GO顯著富集排名前30的條目中發(fā)還現(xiàn)十余個(gè)與細(xì)胞分化相關(guān)的條目，如osteoclast differentiation(GO:0030316)、positive regulation of cell differentiation(GO:0045597)等。眾所周知，在胚胎發(fā)育過(guò)程中，調(diào)控細(xì)胞分化的任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題，都有可能導(dǎo)致胚胎質(zhì)量降低甚至直接導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常[38]。本研究中，體外滋養(yǎng)層組染色體缺失片段中涉及到多個(gè)基因(如MYOD1、PRXL2A、FOXO3等)均可參與細(xì)胞分化(圖9)。此外，體外滋養(yǎng)層組顯著富集的KEGG通路中包含多條參與調(diào)控細(xì)胞分化的信號(hào)通路，如Hedgehog signaling pathway(bta04340)、cAMP signaling pathway(bta04024)、MAPK signaling pathway(bta04010)等。而體內(nèi)滋養(yǎng)層組中發(fā)現(xiàn)的則更多的是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)離子通道等相關(guān)的通路，如p53 signaling pathway(bta04115)、Hippo signaling pathway(bta04390)、AMPK signaling pathway(bta04152)。這說(shuō)明KEGG的富集結(jié)果與GO富集結(jié)果是相符的。鑒于在本研究中體外滋養(yǎng)層組的缺失基因顯著富集到多個(gè)與細(xì)胞骨架和細(xì)胞分化相關(guān)的條目，推測(cè)體外胚質(zhì)量差可能是由于胚胎在體外培養(yǎng)的過(guò)程中受不利因素影響導(dǎo)致調(diào)控細(xì)胞骨架相關(guān)的基因異常表達(dá)，從而直接導(dǎo)致染色體出現(xiàn)片段缺失、基因拷貝數(shù)異常等現(xiàn)象，進(jìn)而影響胚胎發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞分化的有序進(jìn)行，最終影響胚胎的正常發(fā)育。

圖9 體外滋養(yǎng)層組GO分析結(jié)果示意圖

由于體內(nèi)滋養(yǎng)層組和體外滋養(yǎng)層組檢出率均小于90%，所以本研究對(duì)各組芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行了芯片填充，并估計(jì)其育種值。結(jié)果顯示，本研究使用芯片包含95 257個(gè)SNPs位點(diǎn)，共填充64 958個(gè)SNPs位點(diǎn)，其中填充準(zhǔn)確性在0.99～1之間的SNP位點(diǎn)有52 334 個(gè)。同時(shí)計(jì)算本次填充的準(zhǔn)確性為91%，說(shuō)明芯片填充效果較好，可用于育種值估計(jì)。同時(shí)，芯片填充后育種值估計(jì)能夠很好的反映各組估計(jì)育種值的差異，以1/2體內(nèi)胚組為例，樣本PTP57001的產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量的育種值都是最高的，從而可以判定胚胎PTP57001生產(chǎn)性能良好，可以用來(lái)移植。此外，從產(chǎn)奶量來(lái)看，體外滋養(yǎng)層組低于體內(nèi)滋養(yǎng)層組，并且組內(nèi)差異大，這可能是因?yàn)轶w內(nèi)胚胎生產(chǎn)過(guò)程中所選的父母本通常生產(chǎn)性能良好，而屠宰場(chǎng)的母本一般生產(chǎn)性能低且水平不同，進(jìn)而導(dǎo)致估計(jì)育種值低。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，利用胚胎切割、單細(xì)胞基因組擴(kuò)增和基因組芯片可在微創(chuàng)的前提下，實(shí)現(xiàn)對(duì)植入前早期胚胎染色體質(zhì)量和生產(chǎn)性能的評(píng)估；此外，通過(guò)對(duì)比分析體內(nèi)、外胚胎染色體片段缺失結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胚胎體外發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞骨架等基因異常表達(dá)可能是導(dǎo)致體外胚胎質(zhì)量差的原因之一。