韓鵬敏，張 然，邊世雄，李云雷，倪愛心，王園美，宗云鶴，趙金蒙，袁經(jīng)緯，孫研研，李建慧，陳繼蘭*，麻 慧*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物遺傳育種與繁殖(家禽)重點實驗室，北京 100193；2.山西農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，太谷 030801)

益生菌被認為是一類對宿主有益的活性微生物，能夠通過改善和塑造腸道微環(huán)境，有效抑制腸道病原菌的定植，使家禽保持健康[1]。益生菌自身產(chǎn)生的抗菌化合物，可對競爭性腸道病原菌發(fā)揮直接抗菌作用[2]。Abdel-Hamid等[3]在體外試驗中研究發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌產(chǎn)生的細菌素可以在體外抑制金黃色葡萄球菌的增殖，且該細菌素能夠減輕金黃色葡萄球菌感染大鼠后的組織器官損傷。已有研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌可改善肉雞的生長性能和免疫功能，并調(diào)節(jié)盲腸微生物菌群[4]。目前，家禽生產(chǎn)中常用的益生菌有乳酸菌、芽孢桿菌和腸球菌等[5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在健康成年鴿的嗉囊和腸道中存在大量屎腸球菌，且屎腸球菌在腸道內(nèi)具有較強的定植優(yōu)勢。屎腸球菌屬于革蘭陽性乳酸菌，兼性厭氧，無莢膜，無芽孢，是存在于人和動物腸道中的主要菌群之一[6-7]。屎腸球菌可在腸道表面黏附形成保護屏障，其代謝產(chǎn)生的有機酸、細菌素等能夠抑制或殺滅病原菌，從而發(fā)揮益生作用[8]?？莶菅挎邨U菌廣泛分布于土壤、植物等環(huán)境中，抗逆性較強，易于加工，因此，在商品化生產(chǎn)及動物生產(chǎn)中使用較為廣泛。研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌可提高動物胃腸道內(nèi)酶的活性，從而提高動物飼糧養(yǎng)分利用率[9]。目前，屎腸球菌和枯草芽孢桿菌對乳鴿的影響報道較少。因此，本研究旨在研究單獨添加屎腸球菌和枯草芽孢桿菌及二者混合添加對乳鴿生長性能、屠宰性能、免疫功能的影響，從而探究其調(diào)控乳鴿生長的作用機制，為益生菌在乳鴿生產(chǎn)中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用屎腸球菌菌粉和枯草芽孢桿菌112025菌粉均購自河北滄州華雨生物科技有限公司，活菌數(shù)分別為3×109、2×1010CFU·g-1。試驗種鴿及乳鴿品種為山西某肉鴿養(yǎng)殖企業(yè)飼養(yǎng)的白羽王鴿。試驗過程中涉及的動物飼養(yǎng)及乳鴿屠宰均遵照《Guide for the Care and Use of Agricultural Animals in Research and Teaching》中的原則和具體指南[10]，并經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所動物實驗福利倫理委員會批準(批準參考編號：IAS2021-98)。

1.2 試驗設(shè)計及飼糧配方

試驗選取240只12日齡、體重接近的健康白羽王鴿，公母各120只，隨機分為4組，每個組6個重復，每個重復10只乳鴿，試驗期16 d。人工哺育，對照組(A組)飼喂基礎(chǔ)飼糧(表1、表2)；屎腸球菌組(B組)在基礎(chǔ)飼糧中添加屎腸球菌，有效活菌數(shù)為1.11×107CFU·mL-1；枯草芽孢桿菌組(C組)在基礎(chǔ)飼糧中添加枯草芽孢桿菌，有效活菌數(shù)為7.4×107CFU·mL-1；混合組(D組)在基礎(chǔ)飼糧中添加屎腸球菌和枯草芽孢桿菌，屎腸球菌有效活菌數(shù)為1.11×107CFU·mL-1，枯草芽孢桿菌有效活菌數(shù)為7.4×107CFU·mL-1。基礎(chǔ)飼糧的組成和營養(yǎng)成分見表1和表2。鴿舍溫度維持在29～32 ℃，定期觀察鴿群精神狀況、病死情況并做記錄。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

表2 顆粒料主要原料及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

1.3 樣品采集

于乳鴿28日齡時，每個重復隨機屠宰2只乳鴿。血清：頸部采血并分離血清，將血清分裝至1.5 mL離心管中，迅速放入-20 ℃保存。

胸?。和涝缀?，采集左側(cè)胸肌保存于4 ℃冰箱中用于肌肉品質(zhì)指標測定。

肝：屠宰后，采集肝組織于液氮速凍后轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱保存。

免疫器官：處死乳鴿后迅速剖開腹腔，摘取胸腺、脾和法氏囊，剔除脂肪組織，吸干表面水分并稱重。

1.4 指標測定

1.4.1 平均日增重 分別于乳鴿12和28日齡稱重并記錄，以每個重復為單位，計算各組乳鴿的平均日增重(ADG)。

1.4.2 屠宰性能和肌肉品質(zhì) 剝離腹脂、雙側(cè)胸肌和腿肌并稱重，參照NY/T823—2020測定乳鴿屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、胸肌率、腿肌率。采集左側(cè)胸肌，參照朱麗慧等[11]的方法測定胸肌肉色、pH和滴水損失。

1.4.3 血清生化、免疫指標 血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)的含量使用相應試劑盒測定，并通過TP和ALB計算球蛋白(GLB)和白球比(A/G)。所用測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，具體測定步驟按照試劑盒說明書進行。

血清中免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白G(IgG)的含量采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定，委托北京萊博泰瑞科技發(fā)展有限公司測定。

1.4.4 肝組織抗氧化指標 肝中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量和總抗氧化能力(T-AOC)采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定，測定步驟按照試劑盒說明書進行。

1.4.5 免疫器官指數(shù) 根據(jù)公式：免疫器官指數(shù)(%)=[免疫器官重(g)/乳鴿活體重(g)]×100，計算胸腺、脾和法氏囊器官指數(shù)。

1.4.6 肝組織生長相關(guān)基因表達量 從-80 ℃冰箱中取出冷凍保存的肝組織樣品，按照TRIzol試劑盒(Invitrogen，USA)說明書步驟提取總RNA，用核酸定量儀NanoDrop ND 2000分光光度計(Thermo，USA)檢測RNA的濃度和質(zhì)量。cDNA反轉(zhuǎn)錄參照PrimeScript RT試劑盒(RR047a，TaKaRa，日本)說明書進行。按熒光定量測定，反應體系為10 μL：TB Green Premix EX Taq 5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，50(ROX Reference Dye 0.2 μL，cDNA 1.5 μL，加ddH2O至10 μL。擴增條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃ 3 s，60 ℃ 32 s，40次循環(huán)；熔解曲線95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。以對照組乳鴿肝的基因表達量為基準，以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算肝中生長相關(guān)基因生長激素(GH)、生長激素受體(GHR)、胰島素樣生長因子1(IGF-1)基因的相對表達量?；蛞镄蛄幸姳?，并由生工生物工程股份有限公司合成。

表3 PCR引物序列

1.5 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010分析后，采用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Tukey法進行多重比較。P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著，所有檢驗結(jié)果均以“平均值(標準差(Mean(SD)”表示。

2 結(jié) 果

2.1 乳鴿平均日增重

由圖1可知，與對照組相比，屎腸球菌組顯著提高了12～28日齡乳鴿平均日增重(P<0.05)，而枯草芽孢桿菌組顯著降低了乳鴿平均日增重(P<0.05)，混合組對乳鴿的平均日增重無顯著影響(P>0.05)。

A. 對照組；B. 屎腸球菌組；C. 枯草芽孢桿菌組；D. 混合組。圖柱上附不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.2 乳鴿屠宰性能和肉品質(zhì)

由表4可知，與對照組相比，3個處理組乳鴿的屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、腿肌率、胸肌率、腹脂率均無顯著影響(P>0.05)；由表5可知，與對照組相比，屎腸球菌組和混合組顯著提高了乳鴿胸肌亮度(P<0.05)，混合組還顯著提高了乳鴿胸肌紅度(P<0.05)，但乳鴿胸肌黃度、pH及滴水損失各組間無顯著差異(P>0.05)。

表4 屎腸球菌和枯草芽孢桿菌對乳鴿屠宰性能的影響

表5 屎腸球菌和枯草芽孢桿菌對乳鴿胸肌肉品質(zhì)的影響

2.3 乳鴿免疫功能

由表6可知，與對照組相比，3個處理組乳鴿血清中IgA含量有提高趨勢，但差異不顯著(P>0.05)；而屎腸球菌組、枯草芽孢桿菌組和混合組乳鴿血清中IgG含量顯著升高(P<0.05)。由表7可知，與對照組相比，混合組能夠顯著提高乳鴿胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)(P<0.05)，各組間的脾臟指數(shù)無顯著性差異(P>0.05)。

表6 屎腸球菌和枯草芽孢桿菌對乳鴿血清免疫球蛋白含量的影響

表7 屎腸球菌和枯草芽孢桿菌對乳鴿免疫器官指數(shù)的影響

2.4 乳鴿血清生化指標和肝組織抗氧化指標

由表8可知，與對照組相比，屎腸球菌組顯著提高乳鴿血清中GLB含量(P<0.05)，枯草芽孢桿菌組和混合組對乳鴿血清生化指標均無顯著影響(P>0.05)；由表9可知，屎腸球菌組乳鴿肝中SOD活性顯著高于對照組(P<0.05)，混合組肝中GSH-Px活性顯著高于對照組(P<0.05)，枯草芽孢桿菌組肝中CAT活性顯著高于對照組(P<0.05)，3個處理組對乳鴿肝中T-AOC和MDA的含量無顯著影響(P>0.05)。

表8 屎腸球菌和枯草芽孢桿菌對乳鴿血清生化指標的影響

表9 屎腸球菌和枯草芽孢桿菌對乳鴿肝組織抗氧化能力的影響

2.5 乳鴿肝組織生長相關(guān)基因的表達量

飼糧添加屎腸球菌和枯草芽孢桿菌對乳鴿肝組織GH、GHR、IGF-1基因相對表達量的影響如圖2所示，3個處理組的肝組織GH、IGF-1基因表達水平顯著高于對照組(P<0.05)，枯草芽孢桿菌組肝組織GHR基因表達水平顯著高于對照組(P<0.05)，屎腸球菌組和混合組的肝組織GHR基因表達水平與對照組差異不顯著(P>0.05)。

圖2 屎腸球菌和枯草芽孢桿菌對乳鴿肝組織GH、GHR和IGF-1基因相對表達量的影響

3 討 論

3.1 飼糧添加屎腸球菌和枯草芽孢桿菌對乳鴿生長性能的影響

乳鴿作為主要消費產(chǎn)品，其生長狀況受到廣泛關(guān)注。使用益生菌能夠幫助機體迅速在腸道中形成優(yōu)勢菌群，降低腸道疾病的發(fā)生，促進乳鴿健康生長。Han等[12]研究表明，飼糧中添加微囊化糞腸球菌CG1.0007可提高肉仔雞的生長性能，改善健康狀況。陶振陽等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在產(chǎn)蛋后期蛋雞飼糧中添加糞腸球菌可提高蛋雞的生產(chǎn)性能，改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)。袁文華等[14]研究表明，在種鴿飼糧中添加丁酸梭菌和乳酸菌能促進乳鴿生長，且丁酸梭菌和乳酸菌復合添加的效果優(yōu)于單一添加。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，屎腸球菌組乳鴿12～28日齡平均日增重顯著提高，與前人研究結(jié)果一致。這可能由于屎腸球菌在機體內(nèi)大量定植，改善動物的消化吸收能力，提高消化利用率，從而提高乳鴿平均日增重[15]。

貢筱[16]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加1×1010CFU·kg-1的枯草芽孢桿菌，藍狐的營養(yǎng)物質(zhì)消化率、氮沉積、凈蛋白質(zhì)利用率、蛋白質(zhì)生物學價值較為理想，且可獲得較好的生長性能。而本研究中添加枯草芽孢桿菌降低了乳鴿平均日增重，可能與其添加量或乳鴿特殊的消化系統(tǒng)有關(guān)。

3.2 飼糧添加屎腸球菌和枯草芽孢桿菌對乳鴿屠宰性能和肉品質(zhì)的影響

屠宰性能是反映肉用動物體內(nèi)不同組織及同一組織不同部位營養(yǎng)物質(zhì)沉積量的重要指標，直接影響乳鴿的銷售價值。Mao等[17]研究發(fā)現(xiàn)，DGAT2基因與鴿子的胴體性狀和肉質(zhì)性狀關(guān)系密切，G18398T和G22484C的SNPs可作為鴿子標記輔助育種的遺傳標記。樊海苗等[18]研究顯示，飼糧中添加復合益生菌對北京油雞的屠宰性能無顯著影響。Rehman等[19]在肉雞飼糧中添加益生菌發(fā)現(xiàn)，對屠宰率、胸肌率和腿肌率沒有顯著影響。本次試驗對乳鴿屠宰性能測定結(jié)果顯示，屎腸球菌和枯草芽孢桿菌對乳鴿的屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、腿肌率、胸肌率、腹脂率均無顯著影響，與前人研究結(jié)果一致。

肌肉pH與糖酵解速率有關(guān)，糖酵解越快，產(chǎn)生的乳酸越多，pH就越低。pH處于正常范圍內(nèi)，有助于增強肌肉風味。卜柱等[24]研究表明，鴿肉pH在5.90～6.05之間，屬于正常范圍，且乳鴿肉的pH略高于老鴿肉。而何翔等[27]報道21日齡白羽王鴿的pH為5.68。本研究中，屎腸球菌和枯草芽孢桿菌不影響乳鴿胸肌pH，乳鴿的pH均在5.70～5.80之間。滴水損失是評價肉品保水能力的重要衡量標準之一，與肌肉中結(jié)締組織含量有關(guān)，結(jié)締組織越豐富，肌肉保水能力越強。肌肉的保水性會直接影響肉的滋味和嫩度，具有重要的經(jīng)濟意義[28]。Nduku等[29]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加益生菌顯著降低了肉仔雞胸肌滴水損失率。而Park和Kim[30]在肉雞飼糧中添加枯草芽孢桿菌發(fā)現(xiàn)胸肌滴水損失增加，具體原因尚不清楚。本研究顯示，飼糧添加屎腸球菌和枯草芽孢桿菌對乳鴿胸肌滴水損失無顯著影響。

3.3 飼糧添加屎腸球菌和枯草芽孢桿菌對乳鴿免疫功能的影響

胃腸道中的微生物種類繁多，在黏膜免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用?？诜嫔軌蛲ㄟ^Toll樣受體與腸道上皮細胞或固有層相關(guān)免疫細胞相互作用，并減少細胞因子或趨化因子的產(chǎn)生[31]。IgG是血清濃度最高的免疫球蛋白，約占70%～80%，不僅含量多，作用時間也長，在抗體介導的防御反應中起主要作用[32]。IgA在血清中含量僅次于IgG，主要存在于黏膜組織。賀濛初等[33]研究表明，飼喂益生菌可提高肉仔雞血清中IgG、IgM的含量，并且通過Toll樣受體通路蛋白表達提高機體免疫力。陳功義和郝振芳[34]研究顯示，乳酸菌微生態(tài)制劑能夠提高白羽王鴿血清IgG含量。本研究發(fā)現(xiàn)，添加屎腸球菌和枯草芽孢桿菌均不同程度提高乳鴿血清中IgA和IgG的含量，與前人研究結(jié)果一致。

免疫器官的生長發(fā)育是判斷乳鴿免疫力強弱的重要指標，胸腺、脾和法氏囊的重量和相對重量越大，表明禽類機體的細胞免疫和體液免疫機能越高[35-36]。李龍等[37]研究表明，飼糧添加益生菌顯著提高了育肥期肉雞的脾臟指數(shù)。Chen等[38]研究發(fā)現(xiàn)，給肉仔雞飼喂干酪乳桿菌和植物乳桿菌可顯著提高胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)。史自濤等[39]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加1 000 mg·kg-1的糞腸球菌后斷奶仔豬脾臟指數(shù)比對照組提高19.70%。Guo等[40]研究結(jié)果顯示，飼糧中添加枯草芽孢桿菌顯著增加了櫻桃谷肉鴨的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)。本試驗結(jié)果表明，屎腸球菌和枯草芽孢桿菌可顯著提高乳鴿胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)，且混合添加效果優(yōu)于單一添加。

3.4 飼糧添加屎腸球菌和枯草芽孢桿菌對乳鴿血清生化指標的影響

血清總蛋白和白蛋白能夠反映肝的代謝能力以及對蛋白質(zhì)消化利用的程度。本研究表明，飼喂屎腸球菌和枯草芽孢桿菌對乳鴿血清總蛋白和白蛋白的含量無顯著影響，說明飼糧添加屎腸球菌和枯草芽孢桿菌不會對乳鴿肝組織造成損傷。俸祥仁等[41]研究顯示，乳鴿飲水中添加益生菌對血清總蛋白和白蛋白無顯著影響，與本研究結(jié)果一致。存在于動物血清中的球蛋白具有免疫作用，并且能夠反應機體對碳水化合物的吸收程度和營養(yǎng)水平。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加屎腸球菌可顯著提高乳鴿血清中球蛋白的含量，可能與其提高乳鴿血清中免疫球蛋白含量有直接關(guān)系，其余血清生化指標均無顯著變化。陳曉帥等[42]研究表明，飼糧中添加復合益生菌顯著降低了28～56日齡白羽王鴿血清總膽固醇、甘油三酯、白球比和尿素氮的含量。與本研究結(jié)果不一致，原因可能是飼喂方式、乳鴿日齡及益生菌添加的種類不同。

3.5 飼糧添加屎腸球菌和枯草芽孢桿菌對乳鴿肝組織抗氧化指標的影響

動物體內(nèi)SOD、GSH-Px、CAT、T-AOC和MDA含量或活性是衡量機體抗氧化能力的重要指標[43]。黃麗卿等[44]研究表明，飼糧添加屎腸球菌可緩解禽大腸桿菌O78感染導致的肉雞抗氧化狀態(tài)失衡。彭豫東等[45]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加枯草芽孢桿菌能夠顯著提高石門土雞血清中GSH-Px活性。袁文華等[46]通過在青年鴿飼糧中添加丁酸梭菌和乳酸菌發(fā)現(xiàn)，益生菌組顯著提高青年鴿肝組織中CAT、SOD、GSH-Px活性。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加屎腸球菌和枯草芽孢桿菌均不同程度提高乳鴿肝組織中SOD、GSH-Px、CAT活性，與前人研究結(jié)果一致。這可能是由于屎腸球菌和枯草芽孢桿菌能代謝產(chǎn)生SOD和GSH等抗氧化酶或非酶抗氧化劑，通過調(diào)節(jié)腸道內(nèi)環(huán)境清除體內(nèi)過量的自由基，但其具體作用機理有待進一步探究。

3.6 飼糧添加屎腸球菌和枯草芽孢桿菌對乳鴿肝組織生長相關(guān)基因表達量的影響

GH至IGF-1途徑是動物生長發(fā)育的中心環(huán)節(jié)，只有GH與靶細胞上的GHR結(jié)合，通過細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導機制，使靶細胞分泌IGF-1，通過血液運輸?shù)饺恚哉{(diào)控機體生長。肝是生長激素-胰島素樣生長因子軸(GH/IGF-1 axis)的載體，是GHR基因表達量最高的器官，也是IGF-1分泌的主要場所[47]。李天杰[48]對蛋雞的研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加戊糖片球菌可顯著提高蛋雞肝中GH和GHR的表達量，添加枯草芽孢桿菌顯著降低了蛋雞卵巢中PRLR的表達量和肝GHR的表達量。本試驗發(fā)現(xiàn)，乳鴿灌喂料中單一及混合添加屎腸球菌和枯草芽孢桿菌可顯著提高肝組織中GH和IGF-1基因表達水平，添加枯草芽孢桿菌顯著提高了乳鴿肝中GHR的基因表達量，可能與其提高肝中CAT活性和血清免疫球蛋白含量有關(guān)，具體作用機制有待進一步研究。Tanaka等[49]研究表明，雞肝中IGF-1基因表達呈GH依賴模式，而在其他組織中的表達并不依賴于GH的作用，本研究結(jié)果也顯示IGF-1基因的表達與GH表達量之間存在依賴關(guān)系。

4 結(jié) 論

本研究表明，飼糧添加屎腸球菌可顯著提高乳鴿平均日增重，而枯草芽孢桿菌的添加顯著降低了乳鴿的平均日增重；屎腸球菌能改善乳鴿肌肉品質(zhì)，提高乳鴿肝組織抗氧化能力，增強機體的免疫調(diào)節(jié)能力，從而促進乳鴿生長。