郭振華，李 翔，翁茂洋，金前躍，郭軍慶，邢廣旭，張改平,,3*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100；3.江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009)

偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)是具有囊膜的雙鏈DNA病毒，基因組大小約140 kb，編碼至少70個(gè)蛋白，屬于α-皰疹病毒亞科(Alphaherpesvirinae)，水痘病毒屬(Varicellovirus)[1]。豬是PRV的唯一自然宿主，PRV感染豬后引起的疾病稱(chēng)為偽狂犬病(pseudorabies, PR)，常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)包括母豬繁殖障礙、仔豬神經(jīng)癥狀以及中大豬呼吸道癥狀等[2-3]。PRV在我國(guó)豬群中具有較高的流行率，是危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一。此外，PRV還可感染狗、貓、牛、羊、狐貍、水貂和狼等多種動(dòng)物，具有很廣的感染譜，且除了豬以外，其他動(dòng)物多在感染后24～48 h內(nèi)死亡[4]。

US3 蛋白是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，存在于所有的α-皰疹病毒亞科成員中，也是PRV的一個(gè)重要毒力蛋白[5]。研究顯示，US3可以誘導(dǎo)絲切蛋白(cofilin)去磷酸化和RhoA 蛋白的磷酸化，從而影響細(xì)胞骨架重排[6-7]；可以通過(guò)降解Bcl-2 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(Bcl-2 associated transcription factor 1，Bclaf1)和誘導(dǎo)IRF3 的高度磷酸化來(lái)抑制Ⅰ型干擾素信號(hào)[8]；通過(guò)激活PI3-K/Akt和NF-κB 信號(hào)通路來(lái)調(diào)控抗凋亡基因的表達(dá)等[9]。但目前對(duì)US3參與的生物學(xué)過(guò)程及其分子機(jī)理的揭示還很有限，有必要深入發(fā)掘鑒定新的和US3互作的宿主蛋白，從而進(jìn)一步拓展對(duì)US3 生物學(xué)功能的認(rèn)知。

膜聯(lián)蛋白A2(annexin A2，ANXA2)是一個(gè)具有多種生物學(xué)功能的鈣磷脂結(jié)合蛋白，參與囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞骨架膜動(dòng)力學(xué)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程[10-11]。在病毒感染過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用，有報(bào)道顯示，ANXA2可以和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的Nsp9互作，從而促進(jìn)PRRSV在MARC-145細(xì)胞上的增殖[11]；ANXA2還可以和宿主波形蛋白(vimentin)互作，來(lái)促進(jìn)PRRSV和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)的復(fù)制[12]；ANXA2可以和豬瘟病毒(CSFV)NS5A和E2蛋白互作，促進(jìn)CSFV在PK-15細(xì)胞上的增殖[13]。但目前尚沒(méi)有針對(duì)ANXA2是否影響PRV復(fù)制增殖的相關(guān)研究報(bào)道。

本研究中，作者通過(guò)免疫共沉淀和pull-down分析驗(yàn)證了US3和ANXA2的相互作用，發(fā)現(xiàn)抑制ANXA2的表達(dá)可以顯著影響PRV的增殖，過(guò)表達(dá)ANXA2對(duì)PRV和凋亡刺激劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有負(fù)調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

PK-15細(xì)胞和3D4/21細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；PRV毒株HeNLH/2017(GenBank：MT775883)由本實(shí)驗(yàn)室從臨床病料中分離鑒定[3]；小干擾RNA由上海吉瑪公司合成，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；pEGFP-C1、pEGFP-N1和pCMV-3xflag質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存；pEGFP-US3、pEGFP-ANXA2、pCMV-3xflag-US3、pCMV-3xflag-A2和pEASY-Blunt-UL54重組質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；Flag親和磁珠購(gòu)自ThermoFisher Scientific公司，GFP-Trap磁珠購(gòu)自ChromTek公司；PRV gE蛋白單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備、保存。

1.2 試劑

無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司；Q5超保真酶和限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自NEB公司；核酸提取試劑Mini Best Virus DNA/RNA Extraction kit和反轉(zhuǎn)錄試劑Prime ScriptTMRT reagent kit購(gòu)自TaKaRa公司；TRIzolRReagent購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司；RIPA細(xì)胞裂解液和細(xì)胞凋亡刺激劑(apoptotic stimulator)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；ECL超敏化學(xué)發(fā)光液(P10300)購(gòu)自新賽美公司；SYBR Green熒光定量試劑購(gòu)自Roche公司；ProteoSilverTMStain Kit銀染試劑購(gòu)自Sigma公司；GFP抗體(D5.1)、ANXA2抗體(D11G2)、Caspase-3抗體和Cleaved Caspase-3抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；Flag抗體和β-tubulin抗體購(gòu)自Abbkine公司；AnnexinV-APC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基生物公司。

1.3 US3潛在互作蛋白發(fā)掘

pEGFP-N1和pEGFP-US3分別轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，24 h后收取蛋白樣品，并用GFP-Trap磁珠進(jìn)行pull-down，制備的蛋白樣品跑SDS-PAGE，按照 ProteoSilverTMStain Kit銀染試劑的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行銀染，待加入終止液后，在白色背景板下比較銀染后的pEGFP-N1和pEGFP-US3組的樣品條帶，用干凈刀片切取差異性條帶，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行LC-MS質(zhì)譜分析。

1.4 免疫共沉淀和pull-down分析

pEGFP-ANXA2、pEGFP-N1、pCMV-3xflag和pCMV-3xflag-US3分別進(jìn)行兩兩組合，轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染36 h后，用Flag親和磁珠和GFP-Trap磁珠分別進(jìn)行免疫共沉淀分析。取pCMV-3xflag和pCMV-3xflag-US3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，36 h后收取蛋白樣品，用Flag親和磁珠進(jìn)行pull-down，用ANXA2和Flag抗體進(jìn)行免疫印跡分析。

1.5 熒光定量RT-PCR

利用TRIzolR法分別提取RNAi對(duì)照組和處理組細(xì)胞的總RNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以獲得的cDNA為模板，通過(guò)檢測(cè)ANXA2和內(nèi)參基因GAPDH的mRNA含量來(lái)驗(yàn)證ANXA2在轉(zhuǎn)錄水平的敲低效果；利用絕對(duì)熒光定量PCR評(píng)估敲低ANXA2的表達(dá)對(duì)PRV基因組復(fù)制的影響，按照病毒DNA/RNA提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNAi對(duì)照組和處理組病毒核酸的提取。然后以pEASY-Blunt-UL54質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，用建立的針對(duì)PRVUL54基因的熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算基因的拷貝數(shù)，用來(lái)代表各組中PRV DNA的含量。具體的引物和siRNA序列見(jiàn)表1。

表1 引物和siRNA序列信息

1.6 病毒滴度測(cè)定

采用半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量(50% tissue culture infective dose，TCID50)來(lái)進(jìn)行測(cè)定，將PK-15 細(xì)胞以1.0 ×104個(gè)細(xì)胞·孔-1鋪于 96 孔板，待每個(gè)孔的單層細(xì)胞長(zhǎng)至 90%的豐度時(shí)，棄去上清培養(yǎng)基，用PBS潤(rùn)洗3次；然后加入用DMEM細(xì)胞維持液(含2.0%FBS)10倍倍比稀釋的病毒液樣品，獲得稀釋度依次為 10-1～10-10的待測(cè)病毒稀釋液；96 孔板的第一列對(duì)應(yīng) 10-1稀釋度的混合液，第二列對(duì)應(yīng)10-2稀釋度的混合液，依次類(lèi)推，最后兩列作為空白組，加入無(wú)病毒液的維持液，每個(gè)稀釋度設(shè)8個(gè)重復(fù)。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)3～5 d，期間在顯微鏡下觀察PRV感染引起的細(xì)胞病變情況，記錄每個(gè)稀釋度發(fā)生細(xì)胞病變的孔數(shù)，用 Reed-Muench 法計(jì)算TCID50。

1.7 Western blot分析

利用RIPA細(xì)胞裂解液收取細(xì)胞蛋白樣品，制備的蛋白樣品經(jīng)變性處理后，取適量加到12.0%變性蛋白預(yù)制膠上樣孔中進(jìn)行電泳(SDS-PAGE)，然后經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)印將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用5.0%的脫脂奶粉(0.5%PBST配制)對(duì)膜進(jìn)行室溫封閉2 h，接著分別用特異性的一抗或二抗(見(jiàn)“1.2”)繼續(xù)室溫孵育1 h，最后將配制的ECL超敏化學(xué)發(fā)光液均勻加到PVDF膜上，置于凝膠成像掃描儀調(diào)整合適的曝光時(shí)間進(jìn)行觀察。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)

PRV感染或者凋亡刺激劑刺激PK-15細(xì)胞，在指定時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞，并用PBS進(jìn)行懸浮，按照說(shuō)明書(shū)用Annexin V-APC/PI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行避光染色5 min，然后使用Beckman CytoFLEX設(shè)備進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)分析，所有數(shù)據(jù)使用CytExpert軟件進(jìn)行分析處理。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

熒光定量PCR/RT-PCR、病毒滴度測(cè)定和細(xì)胞凋亡的流式分析試驗(yàn)均進(jìn)行了3次重復(fù)，各組數(shù)據(jù)用GraphPad Prism軟件中的t檢驗(yàn)或者ANOVA方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性分析。P<0.05(*)表示差異顯著，P<0.01(**)表示差異極顯著，ns表示無(wú)顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 US3潛在互作蛋白篩選

通過(guò)蛋白pull-down、銀染和串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS)分析，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與PRV US3蛋白具有潛在相互作用的宿主蛋白(表2)。

表2 LC-MS質(zhì)譜分析結(jié)果

2.2 ANXA2與PRV US3的相互作用

pEGFP-ANXA2與pCMV-3xflag-US3，pEGFP-N1與pCMV-3xflag-US3，pEGFP-ANXA2與pCMV-3xflag分別共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞，收取蛋白樣品后，用Flag親和磁珠或GFP-Trap磁珠分別進(jìn)行免疫共沉淀分析。結(jié)果如圖1所示，F(xiàn)lag親和磁珠進(jìn)行免疫沉淀分析時(shí)，可以檢測(cè)到特異的GFP-ANXA2條帶(圖1A)；GFP-Trap磁珠進(jìn)行免疫沉淀分析時(shí)，可以檢測(cè)到特異性的Flag-US3條帶(圖1B)。進(jìn)一步用pCMV-3xflag和pCMV-3xflag-US3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，36 h后收取蛋白樣品，用Flag親和磁珠進(jìn)行pull-down，分別用ANXA2和Flag抗體進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果顯示，US3可以和內(nèi)源性的ANXA2發(fā)生特異的相互作用(圖1C)。

A、B.免疫共沉淀驗(yàn)證外源性ANXA2和US3的互作；C.Pull-down分析US3和內(nèi)源性ANXA2的互作

2.3 敲低ANXA2的表達(dá)抑制PRV的增殖

PK-15細(xì)胞轉(zhuǎn)染小干擾RNA 36 h后，用相對(duì)熒光定量PCR和免疫印跡法檢測(cè)ANXA2轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的抑制效果，結(jié)果如圖2A和B所示，Si ANXA2-670#序列對(duì)的基因沉默效果最好，選擇該序列進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。為進(jìn)一步驗(yàn)證ANXA2對(duì)PRV增殖的影響，PK-15細(xì)胞轉(zhuǎn)染Si NC和Si ANXA2-670# 36 h后，用PRV進(jìn)行感染(MOI=0.1)，在指定的時(shí)間點(diǎn)收取樣品，通過(guò)分析基因拷貝數(shù)、病毒滴度和gE蛋白的表達(dá)水平(圖2C～E)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Si NC組相比較，敲低ANXA2的表達(dá)后顯著抑制了PRV在PK-15細(xì)胞上的復(fù)制增殖。

A、B. qRT-PCR和免疫印跡評(píng)估ANXA2的敲低效果；C. 病毒基因含量的檢測(cè)；D. 病毒滴度(TCID50)的檢測(cè)；E. 病毒蛋白表達(dá)水平分析；*. P<0.05, **. P<0.01, ***. P<0.001, ns. P>0.05

2.4 PRV感染可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是宿主細(xì)胞抵抗各種病原微生物感染的關(guān)鍵防御機(jī)制，作者分析了PRV感染對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果如圖3所示，3D4/21細(xì)胞(圖3A)和PK-15細(xì)胞(圖3B)感染PRV(MOI=0.1)的指定時(shí)間點(diǎn)收集蛋白樣品，通過(guò)免疫印跡檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，凋亡效應(yīng)蛋白Caspase-3發(fā)生了明顯的活化剪切；進(jìn)一步的利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Annexin V和PI染色細(xì)胞情況，發(fā)現(xiàn)PRV感染后，Annexin V和PI雙染的晚期凋亡細(xì)胞明顯增多(圖3C)。這些結(jié)果表明，PRV感染宿主細(xì)胞后會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

A、B. Western blot分析caspase-3剪切體蛋白水平的變化；C. 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況

2.5 ANXA2參與了PRV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡調(diào)控

有研究報(bào)道ANXA2可以抵抗X射線輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[14]，但ANXA2是否參與了病毒感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡調(diào)控尚不清楚。在PK-15細(xì)胞上分別過(guò)量或敲低ANXA2的表達(dá)，然后用PRV進(jìn)行感染(MOI=0.1)24 h，收取蛋白樣品進(jìn)行免疫印跡分析。其中PRV US3蛋白是已知的具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示，在過(guò)表達(dá)ANXA2的條件下(圖4A)，ANXA2對(duì)PRV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡顯示出了明顯的抑制效應(yīng)；而敲低ANXA2的表達(dá)后(圖4B)，則對(duì)PRV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有顯著的促進(jìn)作用。

A. 過(guò)表達(dá)ANXA2抑制PRV感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；B. 敲低ANXA2的表達(dá)促進(jìn)PRV感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

2.6 ANXA2對(duì)凋亡刺激劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證ANXA2對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，同樣在過(guò)表達(dá)或敲低ANXA2表達(dá)的條件下，用凋亡刺激劑刺激PK-15細(xì)胞10 h，然后收集樣品用對(duì)應(yīng)的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。結(jié)果如圖5A和B所示，ANXA2對(duì)凋亡刺激劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有顯著的抑制作用。

A. 過(guò)表達(dá)ANXA2抑制凋亡刺激劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；B. 敲低ANXA2的表達(dá)增強(qiáng)凋亡刺激劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

2.7 流式細(xì)胞術(shù)分析ANXA2對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

PK-15細(xì)胞在ANXA2敲低或過(guò)表達(dá)的條件下，用凋亡刺激劑刺激2 h后，收取細(xì)胞用Annexin V-APC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，然后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果如圖6A和B所示，敲低ANXA2的表達(dá)對(duì)凋亡刺激劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)出促進(jìn)效應(yīng)，而過(guò)表達(dá)ANXA2的條件下，則表現(xiàn)出顯著的抑制細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。

A. 過(guò)表達(dá)ANXA2抑制凋亡刺激劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；B. 敲低ANXA2的表達(dá)增強(qiáng)凋亡刺激劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。**.P<0.01

3 討 論

US3蛋白激酶是一個(gè)在α皰疹病毒中高度保守的蛋白，已有的研究顯示US3蛋白參與了細(xì)胞骨架重排、免疫調(diào)控和細(xì)胞凋亡等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程，是PRV進(jìn)入細(xì)胞后的入核和出核過(guò)程的重要調(diào)控蛋白[8,15-16]。關(guān)于US3互作蛋白的篩選鑒定將有助于更好地理解US3蛋白的生物學(xué)功能，如Jansens等[5]利用磷酸化組學(xué)分析了過(guò)表達(dá)US3的條件下對(duì)宿主蛋白磷酸化的影響，鑒定發(fā)現(xiàn)了14個(gè)顯著去磷酸化的蛋白和64個(gè)顯著磷酸化的蛋白。在前期試驗(yàn)中，通過(guò)在PK-15細(xì)胞過(guò)表達(dá)GFP-US3蛋白，然后利用GFP-Trap磁珠pull down，結(jié)合銀染和蛋白質(zhì)譜技術(shù)(LC/MS)，發(fā)現(xiàn)宿主ANXA2是一個(gè)潛在的與US3互作蛋白。在本研究中，作者通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)和pull-down技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了ANXA2和US3的相互作用。ANXA2作為一個(gè)新鑒定的和US3互作的宿主蛋白，拓展了對(duì)US3蛋白作用底物的認(rèn)識(shí)，其具體行使的生物學(xué)功能及分子機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

ANXA2在PRV感染過(guò)程中的作用尚不清楚。有研究顯示，PRV感染神經(jīng)細(xì)胞后，可以刺激軸突處局部的蛋白合成，豐度較高的蛋白有ANXA2 和外周蛋白 (peripherin)，這些蛋白參與了PRV在神經(jīng)細(xì)胞的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程[17]。在對(duì)PRV病毒粒子包含宿主蛋白成分的鑒定研究中，也發(fā)現(xiàn)了ANXA2存在于成熟的病毒粒子中[18]。本研究中，作者利用小RNA干擾技術(shù)來(lái)抑制ANXA2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)敲低ANXA2的表達(dá)，可以顯著抑制PRV在PK-15細(xì)胞上的復(fù)制增殖。結(jié)果提示ANXA2在PRV復(fù)制增殖的過(guò)程中發(fā)揮著一定的作用。

細(xì)胞凋亡是宿主細(xì)胞抵抗各種病原微生物感染的重要防御機(jī)制之一[19-20]。有報(bào)道顯示，US3可以通過(guò)激活PI3-K/Akt和NF-κB 信號(hào)通路來(lái)抑制PRV感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[9]；而也有報(bào)道顯示，在P53基因誘導(dǎo)的凋亡過(guò)程中，ANXA2的表達(dá)受到顯著抑制，ANXA2也可以抵抗X射線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[10]。本研究中，作者通過(guò)免疫印跡和流式細(xì)胞術(shù)，驗(yàn)證了過(guò)表達(dá)ANXA2對(duì)PRV和凋亡刺激劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響，確定了ANXA2具有負(fù)調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用，但其具體的分子機(jī)制尚需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

4 結(jié) 論

ANXA2是一個(gè)新的可以和PRV US3蛋白相互作用的宿主蛋白，PRV的復(fù)制增殖需要ANXA2的參與，ANXA2具有負(fù)調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用。