楊云龍，馮永智，高 琦，鄭佳琛，王 衡，張桂紅,3，龔 浪*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 510642；2.國(guó)家非洲豬瘟區(qū)域?qū)嶒?yàn)室(廣州)/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)非洲豬瘟防控技術(shù)研究中心，廣州 510642；3.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，茂名 525000)

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病。近日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部報(bào)道，截至2022年4月7日，2022年發(fā)生的非洲豬瘟(African swine fever，ASF)疫情為野豬1 938起，家豬388起。ASFV是一種以軟蜱和豬分別作為中間宿主和終末宿主的DNA病毒[1-2]。ASF起源于非洲，并于1921年在肯尼亞首次被報(bào)道，隨后蔓延至歐洲、南美洲以及歐亞交界處等地區(qū)[3]。我國(guó)首例ASF病例于2018年8月3日被報(bào)告，在隨后幾個(gè)月內(nèi)蔓延至全國(guó)。此外，ASF在亞洲迅速蔓延，包括越南、韓國(guó)、柬埔寨、緬甸等，嚴(yán)重影響豬相關(guān)產(chǎn)品的生產(chǎn)和貿(mào)易與國(guó)家的社會(huì)經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)[4]。2022年，ASF疫情在全球持續(xù)蔓延，進(jìn)一步表明需要加強(qiáng)對(duì)ASF疫情的監(jiān)測(cè)。除了養(yǎng)豬企業(yè)應(yīng)對(duì)ASF實(shí)行防控外，還需要對(duì)野豬感染ASFV采取有效的防控措施，以防止疫情的進(jìn)一步蔓延。

ASFV是非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae)、非洲豬瘟病毒屬(Asfivirus)的成員，基因組長(zhǎng)度為170～190 kb，為雙鏈DNA病毒(dsDNA)。病毒在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)復(fù)制，病毒顆粒呈二十面體對(duì)稱(chēng)，直徑約為200 nm，具有同心結(jié)構(gòu)，編碼近200種蛋白質(zhì)[5-6]。CD2v是ASFV外膜蛋白中唯一的特征性病毒蛋白，它能介導(dǎo)RBC與病毒產(chǎn)生吸附現(xiàn)象。CD2v由ORF EP402R基因編碼，大小約45.3 ku，與T淋巴細(xì)胞表面的黏附受體CD2相似[7]。CD2v是一種糖蛋白，由一個(gè)信號(hào)肽、一個(gè)跨膜區(qū)和兩個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域組成，它具有與CD2相似的氨基酸序列[8-11]。此外，豬紅細(xì)胞(RBCs)表面有CD2受體，因此ASFV可以吸附豬RBCs。由于其他豬源病毒不能吸附RBCs，因此ASFV具有吸附RBCs的獨(dú)特特性[12]。已發(fā)現(xiàn)從ASFV基因組中刪除EP402R基因會(huì)降低ASFV引起的死亡率，并可以延緩病毒血癥的發(fā)生和病毒向組織的傳播，這表明CD2v介導(dǎo)的ASFV吸附RBCs的能力有助于病毒在宿主中的傳播[11,13]?；诖?，本研究擬探討ASFV吸附RBCs后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，以及ASFV吸附誘導(dǎo)RBCs發(fā)生凋亡后對(duì)豬外周血單核細(xì)胞(PBMs)吞噬能力的影響。

在這項(xiàng)研究中，作者通過(guò)感染ASFV的PAMs發(fā)現(xiàn)了血液吸附(haemadsorption，HAD)現(xiàn)象。進(jìn)一步研究表明，ASFV可誘導(dǎo)RBCs發(fā)生凋亡。還發(fā)現(xiàn)凋亡的RBCs可以促進(jìn)PBMs的吞噬作用，表明這種現(xiàn)象可能是加劇宿主ASFV感染傳播的另一種方式，為ASFV的感染傳播和致病機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和病毒

豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)、豬外周血單核細(xì)胞(PBMs)和豬紅細(xì)胞(RBCs)均取自4周齡的斷奶仔豬；高毒力的ASFV分離株GZ201801分離自中國(guó)廣州，為基因Ⅱ型。

1.2 主要試劑

胎牛血清(FBS)、RPMI-1640培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別青霉素和鏈霉素抗生素、0.25% EDTA-胰酶均購(gòu)自Gibco公司；十八烷基羅丹明B氯化物(R18)購(gòu)自Life Technologies公司；Annexin V-APC染色試劑盒，購(gòu)自Keygen Biotech公司；RIPA蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑、4×Laemmle SDS-PAGE緩沖液(含有 DL-二硫蘇糖醇)、DAPI染色液購(gòu)自Beyotime公司；Trans-Blot Turbo快速轉(zhuǎn)移系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad公司；Cleaved-caspase3、α-Tublin一抗購(gòu)自CST公司；IRDye?800CW二抗購(gòu)自LI-COR公司；Latex beads黃綠色熒光微球懸液購(gòu)自Sigma公司。

1.3 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購(gòu)自Countstar公司；倒置顯微鏡購(gòu)自Leica公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自Cytoflex公司；Odyssey成像系統(tǒng)購(gòu)自LI-COR公司；激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司。

1.4 方法

1.4.1 病毒感染 將ASFV分別接種在PAMs和RBCs細(xì)胞中，并補(bǔ)充10%胎牛血清、2 mmol·L-1L-谷氨酰胺、100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1鏈霉素和0.4 mmol·L-1非必需氨基酸的培養(yǎng)基，并將細(xì)胞放置于5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.2 病毒HAD50測(cè)定 參照Z(yǔ)hao等[14]的方法，將原代PAMs培養(yǎng)在96孔板中，并將病毒液進(jìn)行10倍被比稀釋為8個(gè)梯度，感染于96孔板中接種的PAMs，在含有5% CO2的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h后，棄掉上清液后換成10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，同時(shí)添加含有1%的豬RBCs，在7 d內(nèi)觀察HAD現(xiàn)象，并使用Reed和Muench方法計(jì)算ASFV的HAD50[15]。

1.4.3 病毒侵染檢測(cè)試驗(yàn) 將ASFV接種PAMs和豬RBCs，并采用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)檢測(cè)ASFV是否入侵豬RBCs。十八烷基羅丹明B(R18)是一種不溶于磷脂的親脂性探針，可插入病毒包膜[16]。當(dāng)R18插入脂質(zhì)膜后，R18的熒光會(huì)自猝滅，當(dāng)病毒囊膜與細(xì)胞膜融合時(shí)，探針逐漸被稀釋并釋放熒光信號(hào)(Ex/Em=560/590 nm)，采用流式細(xì)胞儀通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)可以判斷病毒對(duì)細(xì)胞的入侵[17]。本研究將5 mL ASFV (HAD50=10-5·0.1 mL-1)的病毒液與5 μL R18染料(3 μmol·L-1)混合并在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育20 min。隨后，將混合物接種至分別鋪有1×105細(xì)胞數(shù)的原代PAMs或豬RBCs的24孔板中，將其置于4 ℃冰箱中孵育1 h以使病毒黏附到細(xì)胞表面。接下來(lái)，將板轉(zhuǎn)移到37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h以使病毒進(jìn)入細(xì)胞。此外，將5 mL RPMI-1640培養(yǎng)基和5 μL R18混合并接種細(xì)胞作為陰性對(duì)照。孵育后，收集PAMs和RBCs并使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)入侵病毒的百分率。

1.4.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 使用Annexin Ⅴ-APC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒測(cè)定RBC凋亡情況，通過(guò)Cytoflex流式細(xì)胞儀和Cyexpert軟件進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果分析。作者在1、3、5和7 d的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)感染0.1、1、3 MOI ASFV的RBC凋亡情況。將接種5×105RBCs的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中上清液棄掉，用1 mL PBS沖洗后接種ASFV，4 ℃冰箱放置1 h后轉(zhuǎn)移至5% CO2的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中，孵育1 h后更換含有10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基；隨后，將細(xì)胞置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。在接種ASFV后的1、3、5和7 d收集紅細(xì)胞并使用Annexin V-APC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒處理細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)RBCs凋亡情況。

1.4.5 Western blot試驗(yàn) 將處理并收集的細(xì)胞在添加有蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液中裂解，并添加4×Laemmle SDS-PAGE緩沖液(含有 DL-二硫蘇糖醇)在100 ℃下加熱15 min變性。然后根據(jù)說(shuō)明書(shū)在 SDS-PAGE凝膠上分離蛋白質(zhì)并使用Trans-Blot Turbo快速轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜上。使用5%脫脂牛奶(溶解在 Tris 緩沖鹽水中)在 37 ℃下封閉NC膜1 h，然后與兔源Cleaved-Caspase3單克隆抗體室溫下孵育1 h或在4 ℃下孵育過(guò)夜。使用洗滌緩沖液(含0.1% Tween20的TBS)將膜洗滌3次(每次15 min)，并與 IRDye?800CW紅外山羊抗兔源二抗在37 ℃下孵育1 h。將NC膜在洗滌緩沖液中洗滌3次，并使用Odyssey成像系統(tǒng)成像以顯示蛋白質(zhì)條帶。α-Tublin蛋白用作蛋白上樣內(nèi)參。

1.4.6 PBMs吞噬能力檢測(cè) 分別將接種1 MOI ASFV 1、2、3、4、5、6和7 d的5×105RBCs與10 μL 黃綠色熒光微球懸浮液一起添加到接種有5×105PBMs的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，12 h后棄掉細(xì)胞上清液，并在孔板中加入1 mL PBS后放在室溫?fù)u床上進(jìn)行洗滌，共洗3次，每次15 min，以將未被吞入的黃綠色熒光微球充分清洗掉，使用DAPI對(duì)PBMs進(jìn)行細(xì)胞核染色，5 min后用PBS在室溫?fù)u床上洗滌3次，每次5 min，隨后通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察PBMs細(xì)胞對(duì)各組黃綠色熒光微球的吞噬數(shù)量。

2 結(jié) 果

2.1 ASFV誘導(dǎo)RBCs發(fā)生凋亡

為探討ASFV吸附RBCs后對(duì)RBCs的影響，本研究檢測(cè)了接種ASFV的RBCs的凋亡情況。參照Z(yǔ)hao等[14]的方法測(cè)得ASFV的HAD50結(jié)果為10-6.875·mL-1。使用0.1 MOI ASFV接種1、3、5和7 d后，RBCs的凋亡百分率分別為1.27%、3.23%、7.39%和8.56%。使用1 MOI ASFV接種1、3、5、7 d后細(xì)胞的凋亡百分率分別為1.54%、3.73%、8.46%和10.74%。使用3 MOI ASFV接種1、3、5和7 d后，細(xì)胞的凋亡百分率分別為2.65%、5.01%、12.44%和18.61%(圖1A)。接種0.1、1、3 MOI ASFV的1、3、5、7 d后，檢測(cè)RBCs中Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)隨著接種劑量和時(shí)間的增加，細(xì)胞凋亡Cleaved-caspase3蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)(圖1B)。以上結(jié)果表明，ASFV以劑量和時(shí)間依賴(lài)性誘導(dǎo)RBCs發(fā)生凋亡。

A.將RBCs分別接種0.1、1、3 MOI ASFV的1、3、5、7 d后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)RBCs凋亡情況；B.檢測(cè)凋亡蛋白Cleaved-Caspase3的表達(dá)水平

2.2 感染ASFV的PAMs產(chǎn)生HAD現(xiàn)象

在接種GZ201801-ASFV后，即使在接種了100倍稀釋病毒的孔中PAMs也顯示出明顯的HAD現(xiàn)象(圖2)。證實(shí)基因Ⅱ型ASFV具有吸附RBCs的能力。

圖2 ASFV感染PAMs產(chǎn)生HAD現(xiàn)象

2.3 ASFV侵染PAMs而非RBCs

本研究以ASFV易感PAMs為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)檢測(cè)ASFV病毒囊膜和細(xì)胞膜的融合來(lái)判斷ASFV是否侵入RBCs。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)R18在細(xì)胞膜表面的熒光，結(jié)果顯示，ASFV感染的PAMs中具42.14%的細(xì)胞檢測(cè)到熒光，表明ASFV可以有效侵入PAMs；而ASFV處理的RBCs中未檢測(cè)到有熒光的細(xì)胞(0.2%在儀器誤差范圍內(nèi))，表明ASFV不具有侵染RBCs的能力(圖3)。

A. ASFV侵染PAMs的百分比；B. ASFV侵染RBCs的百分比

2.4 凋亡RBCs促進(jìn)PBMs的吞噬作用

為確定凋亡的RBCs是否影響PBMs的吞噬能力，使用黃綠色熒光微球浮液來(lái)檢測(cè)PBMs吞噬能力的變化。用1 MOI ASFV處理RBCs 1、2、3、4、5、6和7 d后收集RBCs，并將處理的RBCs與黃綠色熒光微球懸浮液一起添加到PBMs中。12 h后，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察PBMs對(duì)黃綠色熒光微球的吞噬數(shù)量。結(jié)果顯示，隨著ASFV對(duì)RBCs處理的時(shí)間增加，被PBMs吞噬的黃綠色熒光微球數(shù)逐漸增加(圖4)，藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色為熒光微球。通過(guò)對(duì)接種ASFV的RBCs和PBMs進(jìn)行吉姆薩染色，紅色箭頭為加入培養(yǎng)PBMs中的RBCs，發(fā)現(xiàn)隨著ASFV處理RBCs時(shí)間的增加，PBMs吞噬RBCs數(shù)逐漸增加(圖5)。結(jié)果表明，隨著ASFV誘導(dǎo)RBCs凋亡數(shù)的增加，PBMs的吞噬能力也顯著增強(qiáng)。

圖4 通過(guò)熒光微球觀察ASFV處理RBCs的Control和1、2、3、4、5、6、7 dpi組的PBMs吞噬紅細(xì)胞的能力

3 討 論

RBCs是血液中最豐富的血細(xì)胞類(lèi)型，它們也是無(wú)脊椎動(dòng)物通過(guò)血液運(yùn)輸氧氣的最重要介質(zhì)，并且具有重要的免疫功能。RBCs程序性死亡的正常生理過(guò)程受多種內(nèi)外因素影響，如氧化應(yīng)激、滲透性休克、病原體感染、供能不足等。這些內(nèi)在或外在因素對(duì)RBCs造成一定程度的損傷后，機(jī)體會(huì)加速受損RBCs程序性死亡，避免受損細(xì)胞破裂溶血，進(jìn)一步引發(fā)炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)ASFV可誘導(dǎo)RBCs發(fā)生凋亡，凋亡的RBCs能促進(jìn)PBMs的吞噬作用。因此，研究ASFV誘導(dǎo)RBCs凋亡的機(jī)制，將有助于更深入地了解ASFV的致病機(jī)制。紅細(xì)胞膜由雙層磷脂組成，內(nèi)層含有磷脂酰絲氨酸(PS)，細(xì)胞發(fā)生凋亡后，PS外翻到細(xì)胞膜外并被攜帶PS受體的巨噬細(xì)胞迅速識(shí)別，從而吞噬凋亡的RBCs[18]。RBCs暴露于Ca2+離子載體離子霉素后誘導(dǎo)細(xì)胞皺縮、細(xì)胞膜起泡形成凋亡小體和PS外翻，隨后在細(xì)胞表面暴露PS，發(fā)生細(xì)胞凋亡，PS暴露在細(xì)胞膜外表面會(huì)刺激吞噬細(xì)胞吞噬凋亡的RBCs[19],迅速將凋亡的RBCs從血液循環(huán)中清除，從而避免血液循環(huán)中存在有害的RBCs發(fā)生溶血和血紅蛋白(Hb)釋放[20]。PBMs是ASFV的靶細(xì)胞，當(dāng)ASFV侵染豬體內(nèi)后病毒進(jìn)入血液感染PBMs，ASFV能誘導(dǎo)血液中RBCs發(fā)生凋亡并促進(jìn)PBMs的吞噬功能，導(dǎo)致PBMs吞噬和感染病毒的數(shù)量增加。因此猜測(cè)ASFV誘導(dǎo)RBCs發(fā)生凋亡并促進(jìn)單核細(xì)胞的吞噬功能是ASFV感染靶細(xì)胞的另一種方式。當(dāng)ASFV感染PBMs時(shí)，受感染的PBMs會(huì)失去吞噬血液中凋亡RBCs的能力[21]，這種現(xiàn)象可能與ASFV感染引起的溶血性貧血癥狀有關(guān)。此外，PS外翻后會(huì)增加紅細(xì)胞之間的黏附程度，增大了紅細(xì)胞與血管壁之間的摩擦力，并增加了細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的RBCs細(xì)胞膜的通透性，從而導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)釋放的Ca2+激活纖維蛋白和血小板，活化血小板產(chǎn)生纖維蛋白[22]，這導(dǎo)致細(xì)胞黏附和聚集成明顯的絲狀發(fā)射狀態(tài)，從而增加全血的黏度導(dǎo)致血管阻塞和血栓形成。

綜上所述，雖然ASFV在感染豬后會(huì)吸附于RBCs，加速病毒在全身的傳播，但ASFV不能侵染RBCs。說(shuō)明RBCs不能成為潛在的ASFV靶細(xì)胞，然而ASFV可誘導(dǎo)RBCs發(fā)生凋亡并提升PBMs的吞噬能力。因此，阻止ASFV吸附RBCs可能會(huì)下調(diào)ASFV引起的RBCs凋亡水平，從而降低ASF感染引發(fā)的自身免疫性溶血性貧血的發(fā)生率。深入研究ASFV誘導(dǎo)RBCs細(xì)胞膜的脂質(zhì)代謝、離子通道的激活等，可為ASF的防治提供更全面的理論依據(jù)。盡管針對(duì)ASF的疫苗正處于研發(fā)階段，但仍需要對(duì)ASFV的致病機(jī)制進(jìn)行深入研究。因此，通過(guò)闡明ASFV與宿主細(xì)胞的相互作用，可以對(duì)ASF實(shí)施更有效的預(yù)防、控制和治療措施，以降低ASF對(duì)養(yǎng)豬業(yè)和國(guó)民經(jīng)濟(jì)造成的危害。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)檢測(cè)ASFV對(duì)RBCs的作用，發(fā)現(xiàn)ASFV不能入侵RBCs，但以時(shí)間和劑量依賴(lài)性方式誘導(dǎo)RBCs發(fā)生凋亡。同時(shí)，通過(guò)吉姆薩染色試驗(yàn)和綠色熒光微球的處理發(fā)現(xiàn)，凋亡的RBCs可以增加PBMs的吞噬功能，ASFV誘導(dǎo)RBCs凋亡的百分比越高，PBMs的吞噬能力越強(qiáng)，表明這種現(xiàn)象是加劇宿主ASFV感染傳播的另一種方式。本研究為ASFV的感染傳播和致病機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ)。