郭妍妍，梁燦新，李錦群，董欣怡，廖 明，曹偉勝

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，人獸共患病防控制劑國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642)

禽白血病病毒(avian leukosis virus，ALV)是一類可導(dǎo)致禽類多器官腫瘤和免疫抑制的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其誘發(fā)的腫瘤主要包括淋巴白血病、血管瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等[1-2]。根據(jù)病毒表面囊膜糖蛋白gp85抗原性，可將ALV分為A～K共11個(gè)亞群，其中，感染雞的為A～E、J和K亞群，A、B、J亞群為臨床上常見的可引起雞腫瘤的外源性ALV，C、D亞群在雞群中很少分離到，而ALV-E屬于內(nèi)源性ALV，對(duì)雞無致病作用[2-3]。ALV-K是王鑫等于2012年從我國(guó)蘆花雞的腫瘤病例中首次分離鑒定的，其gp85與已知的各亞群明顯不同，但與日本可引起禽膠質(zhì)瘤的毒株Sp-53、Km_5844等和我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)土著雞分離株TW-3593等相似性超過90%[4-5]。近年來，江蘇、山東、廣東等地陸續(xù)有ALV-K分離鑒定的報(bào)道[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)ALV-K復(fù)制能力和致病性弱，因此容易長(zhǎng)期在雞群中潛伏傳播[8]。廣東作為養(yǎng)禽大省，擁有很多優(yōu)質(zhì)地方品種雞，而許多地方品種雞ALV凈化進(jìn)展相對(duì)緩慢。此外，由于ALV基因組易于突變，近來，不斷有ALV-K基因組突變或與其他外源性ALV發(fā)生重組的報(bào)道，且有毒力增強(qiáng)的趨勢(shì)[9-12]。因此，了解當(dāng)前廣東地區(qū)ALV-K流行株的分子特征十分必要。本研究旨在對(duì)廣東規(guī)?；N禽場(chǎng)進(jìn)行ALV-K分子流行病學(xué)調(diào)查，并進(jìn)一步探究分離株gag基因12 bp的規(guī)律性缺失對(duì)病毒體外復(fù)制能力的影響，以期為這些種禽場(chǎng)改進(jìn)AL凈化方案提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品、細(xì)胞及主要試劑

2020年6月—2021年11月，從廣東7家規(guī)模化種禽場(chǎng)(A～G)核心群采集抗凝血樣品共8 042份；雞胚成纖維細(xì)胞系(DF-1細(xì)胞)由本實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶是美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品；SQ Tissue DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、去內(nèi)毒素質(zhì)粒中量提取試劑盒是美國(guó)OMEGA公司產(chǎn)品；pBluescript II SK(+)載體購(gòu)自淼靈質(zhì)粒平臺(tái)；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、ClonExpress?MultiS One Step Cloning kit購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；EcoRⅠ、KpnⅠ限制性內(nèi)切酶為NEB公司產(chǎn)品；LipofectaminTM3000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自上海Invitrigen公司；ALV p27單克隆抗體由美國(guó)ADOL實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗購(gòu)自北京全式金有限公司；禽白血病ELISA抗原檢測(cè)試劑盒為美國(guó)IDEXX公司產(chǎn)品。

1.2 病毒分離與鑒定

將無菌操作采集的抗凝血樣品于4 ℃、2 000 r·min-1離心6 min，分離上層血漿。取80 μL血漿樣品接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的DF-1細(xì)胞懸液中，于37 ℃、5.0%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，換成含1.0%FBS的新鮮培養(yǎng)液，維持9 d。細(xì)胞板于-80 ℃反復(fù)凍融3次，取100 μL細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行ALV p27抗原檢測(cè)。對(duì)ELISA結(jié)果S/P值0.2～0.6的150份陽性樣品，離心收集細(xì)胞沉淀，提取細(xì)胞DNA。參考文獻(xiàn)[13]，合成ALV-K特異性引物ALV-K-gp85-F/R(表1)，以前病毒DNA為模板進(jìn)行亞群鑒定。

表1 本試驗(yàn)所用引物序列

1.3 前病毒全基因組擴(kuò)增、測(cè)序及序列分析

參考相關(guān)論文，合成擴(kuò)增gag、pol、env、UTR區(qū)引物[14](表1)。以ALV-K前病毒DNA為模板，進(jìn)行全基因組分段擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物連接至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α，隨機(jī)各挑取3個(gè)陽性菌株送上海生工公司進(jìn)行測(cè)序。利用MEGA 7軟件Neighbor-joining方法分別構(gòu)建gp85和LTR基因遺傳進(jìn)化樹，Bootstrap值為1 000；用DNASTAR 7.1軟件中MegAlign程序的Clustal W方法對(duì)分離株gag、pol、gp85、gp37、LTR等與ALV各亞群參考株進(jìn)行多序列比對(duì)，相似性以及突變分析。ALV各亞群毒株信息及GenBank登錄號(hào)見表2。

表2 ALV各亞群參考毒株信息表

1.4 GD20 JM10和GD20 JM10 A12感染性克隆的構(gòu)建

構(gòu)建策略如圖1所示，以pBluescript II SK(+)質(zhì)粒為載體，選取KpnⅠ、EcoRⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，基于GD20 JM10全基因組序列，設(shè)計(jì)6條分段克隆引物(表3)，其中AF/A1R、A2F/AR為回補(bǔ)擴(kuò)增引物。通過AF/R、BF/R分A、B兩段擴(kuò)增全長(zhǎng)，AF/A1R、A2F/AR擴(kuò)增A1、A2段。A、B兩段和A1、A2、B 3段回收純化后，分別經(jīng)同源重組克隆至pBluescript II SK(+)線性化載體中，所得的重組質(zhì)粒分別命名為p-rGD20 JM10(原缺失質(zhì)粒)和p-rGD20 JM10 A12(回補(bǔ)質(zhì)粒)，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

圖1 GD20 JM10和GD20 JM10 A12感染性克隆構(gòu)建示意圖

表3 同源重組引物

1.5 病毒拯救和鑒定及TCID50測(cè)定

在LipofectaminTM3000介導(dǎo)下，將測(cè)序鑒定正確的兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，5 h后棄去轉(zhuǎn)染液，換成含1.0%FBS的DMEM培養(yǎng)基，隔天進(jìn)行傳代培養(yǎng)，盲傳3代后，維持培養(yǎng)9 d，收集病毒液，通過ELISA檢測(cè)p27抗原。進(jìn)一步將病毒液接種DF-1細(xì)胞，5 d后，以ALV p27單克隆抗體為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，對(duì)感染的DF-1細(xì)胞進(jìn)行IFA鑒定，并設(shè)置陰性對(duì)照，拯救成功的病毒分別命名為rGD20 JM10(原缺失株)和rGD20 JM10 A12(回補(bǔ)株)。同時(shí)測(cè)定病毒的滴度，將病毒液按10-1～10-6進(jìn)行倍比稀釋，每個(gè)稀釋度8個(gè)重復(fù)，并接種至96孔板的DF-1細(xì)胞表面，孵育3 h后棄去病毒液，換成含1.0%FBS的DMEM培養(yǎng)液維持9 d，通過ELISA測(cè)定p27抗原，根據(jù)Reed-Muench方法計(jì)算TCID50值，進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)。

1.6 rGD20 JM10和rGD20 JM10 A12體外復(fù)制能力比較

將DF-1細(xì)胞均勻接種于7塊6孔細(xì)胞板中，將兩株病毒分別以MOI=0.01感染DF-1細(xì)胞，每個(gè)病毒設(shè)置3個(gè)重復(fù)，連續(xù)7 d每天取一塊細(xì)胞板凍存于-80 ℃。通過ELISA檢測(cè)每天細(xì)胞培養(yǎng)上清的OD650 nm值，并計(jì)算S/P值，繪制病毒生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié) 果

2.1 病毒分離與亞群鑒定

8 042份抗凝血樣品經(jīng)病毒分離鑒定，共檢出357份陽性，陽性率為4.4%(357/8 042)，其中，A場(chǎng)陽性率為0.7%(7/1 000)，B場(chǎng)陽性率為1.8%(27/1 515)，C場(chǎng)陽性率為3.9%(27/695)，D場(chǎng)陽性率為6.8%(198/2 907)，E場(chǎng)陽性率為8.6%(63/736)，F(xiàn)場(chǎng)陽性率為1.0%(10/1 048)，G場(chǎng)陽性率為17.7%(25/141)。經(jīng)亞群鑒定和env基因測(cè)序分析共分離到32株ALV-K(表4)，根據(jù)env中的gp85核苷酸序列構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(圖2A)，所有分離株均和ALV-K參考株在同一進(jìn)化分支上，但進(jìn)一步可以劃分為3個(gè)小的拓?fù)淙?，將其命名為Group 1～Group 3，其中，15.6%(5/32)的分離株與日本毒株Sp-53等位于Group 1分支，46.9%(15/32)的分離株與廣東分離株GDFX0601等位于Group 2分支，37.5%(12/32)的分離株與ALV-K原型株JS11C1等位于Group 3分支。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，B場(chǎng)和D場(chǎng)的毒株在3個(gè)分支上均有分布，表明這兩個(gè)場(chǎng)的毒株遺傳背景復(fù)雜多樣化，并且不同種禽場(chǎng)存在序列相似性很高的毒株，這意味著同一毒株可能會(huì)以不同方式進(jìn)入不同場(chǎng)。

表4 32個(gè)ALV-K分離株背景信息

2.2 前病毒全基因組測(cè)序及序列分析

為進(jìn)一步分析ALV-K分離株的分子特征，選取16株進(jìn)行全基因組測(cè)序分析。16個(gè)分離株全長(zhǎng)為7 481～7 496 bp，所有毒株基因組均符合5′-LTR-UTR-gag-pol-env-UTR-LTR-3′典型的反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)，其中，未發(fā)現(xiàn)已知病毒致癌基因。就全基因組而言，分離株間序列相似性很高(97.7%～99.8%)，與NCBI已收錄毒株序列BLAST比對(duì)分析顯示，Group 1分支的分離株與廣東分離株GD1701相似性最高(99.30%～99.63%)，Group 2分支的分離株與河北分離株DT190906相似性最高，為99.40%～99.65%，而Group 3分支毒株與廣東分離株GDFX0601相似性最高，為99.08%～99.44%。

分離株的gag、pol基因在亞群內(nèi)及亞群間均比較保守，與各亞群參考株核苷酸相似性>95%(表5)。16個(gè)分離株中有5株的gag基因全長(zhǎng)為2 094 bp，其他11株gag基因全長(zhǎng)均為2 106 bp，該12 bp的缺失位于gag基因第373—384核苷酸位點(diǎn)，屬于gag基因編碼的p19蛋白區(qū)域，并且該缺失在河北分離株DT190101和江蘇分離株JS13LY19也有報(bào)道。

ALV的env基因編碼gp85和gp37蛋白，分離株gp85基因全長(zhǎng)為1 002或1 005 bp。分離株間gp85核苷酸序列相似性很高(95.1%～99.9%)，與J亞群的相似性最低，在50%左右，與A～E亞群相似性在82.6%～88.8%，而與ALV-K參考株GD1701、GDFX0601和DT190906等相似性最高(95.2%～99.6%)(表5)。分離株的gp37基因均為609 bp，亦高度保守。

表5 各分支代表毒株與不同亞群參考毒株核苷酸序列比較

位于ALV前病毒基因組兩端的LTR，由U3、R和U5組成。對(duì)LTR基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹構(gòu)建(圖2B)，結(jié)果顯示，16個(gè)分離株的LTR均與ALV-E和大多數(shù)ALV-K參考株GDFX0601、TW-3593等在一個(gè)進(jìn)化分支上，相似性為91.4%～99.5%，而與其他亞群及ALV-K原型株JS11C1親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。16個(gè)分離株的LTR長(zhǎng)度為274～281 bp，分離株間LTR相似性為92.1%～100.0%，其中，R和U5區(qū)高度保守，分別為21和78 bp，U3區(qū)在175～182 bp，不同毒株間的主要區(qū)別在U3區(qū)，該區(qū)存在堿基缺失或突變。分離株和各亞群參考株U3區(qū)序列比對(duì)結(jié)果顯示(圖3)，16個(gè)分離株與內(nèi)源性ALV具有相似的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，均只包含1個(gè)CAAT LTR Enhancer[T(T/G)NNG(C/T)AA(T/G)]、CArG Box[CC(A/T)6GG]、Y Box(ATTGG)、PRE Box(GGTGG)、TATA Box(TATT/ATAA)和poly A(AATAAA)。與大多數(shù)外源性ALV相比，由于個(gè)別堿基突變導(dǎo)致缺失了位于U3區(qū)5′端上游的CAAT LTR Enhancer、1個(gè)CAAT Box、PRE Box、CArG Box和Y Box。不同毒株在U3轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件區(qū)和非調(diào)控元件區(qū)均存在個(gè)別堿基的突變、缺失及插入，與參考毒株ev-1、GDFX0601相比，16個(gè)分離株中有13株在U3區(qū)第13-16位存在AGGA/C四堿基的插入，在第123-125位存在CTG三堿基的插入，這些位點(diǎn)的插入現(xiàn)象與JS13LY19參考株一致，關(guān)于其是否會(huì)影響病毒的生物學(xué)特性有待進(jìn)一步研究。

A.32個(gè)ALV分離株與各亞群參考毒株gp85核苷酸序列遺傳進(jìn)化樹;B.16個(gè)ALV-K分離株和參考毒株LTR核苷酸序列遺傳進(jìn)化樹?！?、◆表示本研究的分離毒株

點(diǎn)“.”表示序列一致；橫杠“-”表示堿基缺失；字母表示堿基突變；方框?yàn)橥茰y(cè)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件

2.3 拯救病毒IFA鑒定及TCID50測(cè)定

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，盲傳3代后維持7～9 d，收取細(xì)胞上清，通過ELISA檢測(cè)p27抗原，計(jì)算S/P值分別為2.369和2.438，表明兩株病毒拯救成功。IFA結(jié)果顯示，感染組均能觀察到特異性綠色熒光，而陰性對(duì)照DF-1細(xì)胞無熒光出現(xiàn)(圖4a)。通過Reed-Muench方法計(jì)算TCID50值，重復(fù)測(cè)定3次，如圖4b所示，rGD20 JM10的滴度為103.56TCID50·0.1 mL-1，rGD20 JM10 A12的滴度為103.52TCID50·0.1 mL-1。

ns. P>0.05

2.4 rGD20 JM10和rGD20 JM10 A12體外復(fù)制動(dòng)力學(xué)比較

為評(píng)估拯救病毒的體外復(fù)制特性，以MOI=0.01感染DF-1細(xì)胞，連續(xù)7 d收集細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測(cè)p27抗原，結(jié)果顯示(圖5)，兩株毒株在體外復(fù)制無顯著差異(P>0.05)。

圖5 拯救病毒的體外復(fù)制動(dòng)力學(xué)曲線

3 討 論

近十年來，ALV-K不斷在我國(guó)地方品種雞群中流行，為進(jìn)一步了解近幾年廣東地方品種雞ALV-K流行株的分子特征，本研究于2020-2021年，從廣東7個(gè)種禽場(chǎng)采集的抗凝血樣品中共分離到32株ALV-K，對(duì)其中16株的全基因組序列分析顯示，基因組全長(zhǎng)為7 481～7 496 bp，與廣東黃羽肉雞分離株GD1701、GDFX0601以及河北分離株DT190906相似性最高(99.08%～99.65%)，推測(cè)這些毒株可能具有共同的祖先。

gp85基因是ALV基因組中突變率最高的基因，且與宿主范圍、病毒與細(xì)胞受體結(jié)合及不同亞群分類密切相關(guān)[15-16]。分離株gp85基因遺傳進(jìn)化分析表明，其與日本禽膠質(zhì)瘤病毒突變株Sp-53、中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)分離株TW-3593及大陸ALV-K分離株處于一個(gè)大的進(jìn)化分支上，進(jìn)一步證實(shí)，ALV-K已在我國(guó)大陸地方品種雞群中廣泛流行，并且已在我國(guó)乃至東亞地區(qū)存在很長(zhǎng)一段時(shí)間，很可能擁有共同的祖先[5]。與以往的廣東分離株GDFX0601、GD1701等相比，相似性>95.3%，無特殊缺失或插入出現(xiàn)。這表明近幾年廣東地區(qū)流行的ALV-K在分子特征上較為穩(wěn)定，未見特殊突變。

ALV的LTR也是較易發(fā)生突變的基因，不同亞群間及同一亞群內(nèi)均存在差異[17]。本研究中分離株的LTR基因與ALV-K參考株JS11C1、Km_5845和Km_6249等分屬于不同的進(jìn)化分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其中，JS11C1分離自患有肝腫瘤的蘆花雞，Km_5845和Km_6249分離自患有禽膠質(zhì)瘤的日本本土雞，而本研究分離株均來自臨床表現(xiàn)健康的雞群。這些毒株的env基因具有較高的相似性，感染雞后的臨床表現(xiàn)差異卻很大，推測(cè)與其LTR的差異有關(guān)。在內(nèi)外源性LTR中，U3區(qū)的差異最大，其含有多種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，與病毒的復(fù)制、組織細(xì)胞嗜性和致瘤能力密切相關(guān)[18]。本研究分離株的LTR基因與內(nèi)源性ALV相似，U3區(qū)具有相同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，內(nèi)源性LTR啟動(dòng)子活性弱，而大多數(shù)ALV-K攜帶內(nèi)源性LTR。Zhao等[8]研究發(fā)現(xiàn)，華南地區(qū)黃羽肉雞群分離到的6株攜帶內(nèi)源性LTR的ALV-K的復(fù)制能力顯著低于其他外源性毒株，且致病性較低。因此，可以推測(cè)本研究分離株很可能為低致病性毒株，后續(xù)可以通過反向遺傳技術(shù)進(jìn)行體內(nèi)外試驗(yàn)加以驗(yàn)證。

成熟的gag蛋白在RNA病毒復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用，特別是在病毒粒子組裝、未成熟粒子的出芽和釋放過程中[19]。其編碼多種非糖基化蛋白，其中，p19蛋白負(fù)責(zé)介導(dǎo)gag與細(xì)胞膜的結(jié)合，并誘導(dǎo)病毒釋放。雞Viperin蛋白通過與p19蛋白相互作用，從而抑制ALV-J的復(fù)制[20]。因此，gag基因的突變可能會(huì)影響影響病毒的復(fù)制，且p19蛋白發(fā)揮重要作用。gag基因在ALV各亞群中均較為保守，其中p19的突變相對(duì)較高，本研究發(fā)現(xiàn)B、D、E 3個(gè)場(chǎng)的部分凈化分離株在p19蛋白區(qū)域出現(xiàn)12 bp的規(guī)律性缺失，進(jìn)而導(dǎo)致gag基因編碼第125-128位甘氨酸-谷氨酸-谷氨酸-纈氨酸(G-E-E-V)4個(gè)氨基酸的缺失。猜測(cè)這種缺失可能具有宿主特異性，病毒在復(fù)制過程中朝著有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的方向進(jìn)化，發(fā)生的突變才能穩(wěn)定遺傳?；诖?，利用反向遺傳技術(shù)并通過同源重組的方法構(gòu)建了原缺失株和回補(bǔ)株的感染性克隆，并成功拯救了病毒。通過反向遺傳技術(shù)拯救出的分子克隆化病毒克服了天然毒株遺傳背景及分子水平上的差異，可以單一起源上對(duì)病毒的復(fù)制和致病特性等進(jìn)行研究，且同源重組法構(gòu)建感染性克隆相比于經(jīng)典酶切法更為快速方便，不需要考慮酶切位點(diǎn)。進(jìn)一步的體外試驗(yàn)表明，該缺失不影響病毒的體外復(fù)制能力，但其對(duì)雞體內(nèi)致病性的影響還有待進(jìn)一步研究。

盡管目前臨床上大多數(shù)ALV-K分離株，復(fù)制能力和致病性弱，而容易被忽略，加上RNA病毒遺傳不穩(wěn)定，故ALV基因組容易突變或發(fā)生亞群間重組，可能會(huì)導(dǎo)致ALV-K毒力增強(qiáng)。已陸續(xù)有很多關(guān)于ALV不同亞群間的重組報(bào)道，包括攜帶J亞群env、內(nèi)源性ALV LTR的重組株[21]；ALV-A、ALV-E和ALV-J重組毒株[22]；具有ALV-J U3區(qū)的ALV-K/E/J多重重組毒株，并且該毒株可誘導(dǎo)感染雞大腦皮層膠質(zhì)細(xì)胞增殖，且伴有嗜神經(jīng)現(xiàn)象[12]；攜帶ALV-J LTR和U3區(qū)、ALV-Bgp85、ALV-C 5′UTR和ALV-Egp37的新型重組株[23]；以及含有部分ALV-Bgp85區(qū)域的ALV-E重組株[24]。Su等[10]分離到pol基因突變的ALV-K，該突變導(dǎo)致了病毒的復(fù)制和垂直傳播能力均顯著增強(qiáng)。故ALV不同亞群間的自然重組頻繁發(fā)生，ALV-K也可能會(huì)導(dǎo)致復(fù)雜的臨床表現(xiàn)，加強(qiáng)對(duì)其分子特征監(jiān)測(cè)十分必要。

4 結(jié) 論

所調(diào)查的廣東7個(gè)種禽場(chǎng)均存在ALV-K感染，且均流行攜帶內(nèi)源性LTR的ALV-K，其分子特征較為穩(wěn)定。故種禽場(chǎng)在實(shí)施AL凈化時(shí)，應(yīng)注重采用更敏感的檢測(cè)技術(shù)，此外，gag基因第373—384位的規(guī)律性缺失對(duì)病毒的體外復(fù)制能力無顯著影響。