李 婷 董雪娟 趙 霞 許艷秋 李 靖 吳春先

（1.四川省農(nóng)藥檢定所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（成都），成都 610045；2.四川百事東旺生物科技有限公司，成都 610300）

葡萄是一種深受人們喜愛的水果，其鮮美多汁，可生食和制干，還能釀酒，在我國廣泛種植[1]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，葡萄種植中易發(fā)生的病害主要為霜霉病和白粉病，使用較多的殺菌劑為苯醚甲環(huán)唑、烯酰嗎啉和吡唑醚菌酯[2]。目前，在我國登記用于防治葡萄白粉病的農(nóng)藥有50個(gè)品種、132個(gè)產(chǎn)品，主要為苯甲·吡唑酯、己唑醇、百菌清等[3]。吡唑醚菌酯和乙嘧酚磺酸酯是一種較新的混配殺菌劑。吡唑醚菌酯為甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，屬線粒體呼吸抑制劑，主要通過阻止細(xì)胞色素b和c1間電子傳遞而抑制線粒體呼吸作用，使線粒體不能產(chǎn)生和提供細(xì)胞正常代謝所需要的能量（ATP），最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。吡唑醚菌酯對子囊菌類、擔(dān)子菌類、半知菌類及卵菌類等植物病原菌有顯著的抗菌活性[4]。乙嘧酚磺酸酯為嘧啶類殺菌劑，主要用于防治刺梨、黃瓜和草莓等作物的白粉病[5～7]。吡唑醚菌酯、乙嘧酚磺酸酯是常見的農(nóng)藥品種，目前已有關(guān)于吡唑醚菌酯在草莓、西瓜、葡萄、蘋果、枇杷、楊梅、楊桃、香蕉等水果[8～15]上，以及乙嘧酚磺酸酯在黃瓜上的殘留行為[16]的研究。但尚未見針對吡唑醚菌酯與乙嘧酚磺酸酯的復(fù)配制劑在葡萄中殘留行為的研究報(bào)道，因此開展這2種化合物在葡萄中的消解規(guī)律研究以及制定相關(guān)合理使用準(zhǔn)則是十分必要的。

根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所發(fā)布的《農(nóng)藥登記殘留試驗(yàn)待測殘留物和膳食風(fēng)險(xiǎn)評估殘留定義目錄（征求意見稿）》，乙嘧酚磺酸酯的殘留代謝物和風(fēng)險(xiǎn)評估殘留物為乙嘧酚磺酸酯和乙嘧酚，因此本研究將乙嘧酚列入殘留及風(fēng)險(xiǎn)評估研究對象。乙嘧酚為一種雜環(huán)類殺菌劑，對瓜類作物上的白粉病有較好防治效果，有學(xué)者研究了乙嘧酚在冬瓜中的殘留行為及膳食風(fēng)險(xiǎn)評估[17]，而針對乙嘧酚在葡萄中的殘留消解行為的研究尚未見報(bào)道。

本研究使用吡唑醚菌酯·乙嘧酚磺酸酯微乳劑在葡萄白粉病發(fā)病初期噴霧施藥3次，施藥間隔10 d，基于建立的葡萄中吡唑醚菌酯、乙嘧酚磺酸酯、乙嘧酚的檢測方法，研究葡萄中吡唑醚菌酯、乙嘧酚磺酸酯和乙嘧酚的消解動態(tài)規(guī)律，并結(jié)合農(nóng)藥登記情況和我國居民人均膳食結(jié)構(gòu)，對葡萄中吡唑醚菌酯、乙嘧酚磺酸酯、乙嘧酚殘留進(jìn)行膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評估，以期為葡萄中吡唑醚菌酯、乙嘧酚磺酸酯、乙嘧酚殘留監(jiān)測提供科學(xué)方法，同時(shí)為該藥劑在葡萄上的合理使用及最大殘留限量的制定提供依據(jù)。

一、材料與方法

（一）儀器與試劑試驗(yàn)儀器：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（1100-6410A，安捷倫科技有限公司）；高速離心機(jī)（HC-2517，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；多管旋渦混合儀（Vortex-2500MT，上海力辰邦西儀器科技有限公司）；低速臺式離心機(jī)（TDL-40B，上海安亭科學(xué)儀器廠）。

試驗(yàn)試劑：吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)品［98.0%，國家農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（沈陽）］；乙嘧酚磺酸酯標(biāo)準(zhǔn)品 （95.94%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；乙嘧酚標(biāo)準(zhǔn)品（99.03%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；乙腈（色譜純，美國賽默飛世爾科技公司）；甲酸（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；氯化鈉（分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；N-丙基乙二胺（PSA）固相吸附劑（40～60 μm，博納艾杰爾科技有限公司）；無水硫酸鎂（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；25%吡唑醚菌酯·乙嘧酚磺酸酯微乳劑（四川百事東旺生物科技有限公司，吡唑醚菌酯5%，乙嘧酚磺酸酯20%）。

（二）田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)依據(jù)NY/T 788-2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》[18]，于2020年在內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市賽罕區(qū)、陜西省西安市長安區(qū)、北京市大興區(qū)、河北省石家莊市趙縣、河南省鞏義市、山東省泰安市岱岳區(qū)、江蘇省句容市寶華鎮(zhèn)、安徽省合肥市廬陽區(qū)、湖南省長沙市岳麓區(qū)、廣西壯族自治區(qū)南寧市西鄉(xiāng)塘區(qū)10地開展25%吡唑醚菌酯·乙嘧酚磺酸酯微乳劑在葡萄上的田間試驗(yàn)，其中陜西、北京、河南、江蘇4地同時(shí)進(jìn)行消解試驗(yàn)。田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)1個(gè)處理小區(qū)、1個(gè)對照小區(qū)，每小區(qū)葡萄樹不少于8株，小區(qū)間設(shè)隔離行。采用推薦的最高有效成分用藥量250 mg/kg，制劑1 000倍液，在葡萄白粉病發(fā)病初期施藥3次，施藥間隔10 d。

采集田間樣品應(yīng)按對照小區(qū)、處理小區(qū)的次序進(jìn)行。采樣時(shí)戴一次性塑料手套，每采集一個(gè)小區(qū)的樣品后，更換一次手套。小區(qū)的邊行和每行距離兩端0.5 m內(nèi)不采樣。按設(shè)計(jì)方案采樣時(shí)間要求，每次用隨機(jī)方法在處理小區(qū)內(nèi)采集2份獨(dú)立樣品，每份樣品為從不少于8個(gè)藤上采集的至少12串果實(shí)（需去除果柄）。在充分混勻樣品后，用四分法縮分，分取不少于150 g的樣品兩份（A、B樣），分別裝入封口樣品容器中，貼好標(biāo)簽，低溫（低于-18℃）保存。

殘留消解試驗(yàn)：于末次施藥后0、3、7、14、21 d分別采集葡萄樣品。最終殘留試驗(yàn)：于末次施藥后14、21 d分別采集葡萄樣品。

（三）樣品前處理準(zhǔn)確稱取5.0 g解凍勻漿后的葡萄樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈、3.0 g氯化鈉，渦旋5 min，再以3 800 r/min離心5 min。取1 mL上清液加入裝有50 mg PSA固相吸附劑和100 mg無水硫酸鎂的2 mL離心管中，渦旋30 s，再高速離心3 min，取上清液（乙腈相）過有機(jī)系濾膜于進(jìn)樣瓶中，待測。

（四）儀器檢測條件色譜條件：流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液（80∶20，體積比）；流速為0.3 mL/min；進(jìn) 樣 量 為2 μL；色 譜 柱 為Athena C18-WP（2.1 mm×50 mm×3 μm）；柱溫為30℃。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子模式；串聯(lián)四極桿質(zhì)量分析器；離子源溫度為100℃；干燥氣溫度為300℃；干燥氣流速為10 L/min；霧化氣壓力為275.8 kPa；多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式，其他質(zhì)譜信息見表1。

表1 吡唑醚菌酯、乙嘧酚磺酸酯和乙嘧酚質(zhì)譜采集信息

（五）添加回收試驗(yàn)在空白葡萄樣品中分別添加3個(gè)水平的吡唑醚菌酯、乙嘧酚磺酸酯、乙嘧酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，吡唑醚菌酯的添加水平為0.05、2、3 mg/kg，乙嘧酚磺酸酯和乙嘧酚的添加水平均為0.05、0.5、1 mg/kg，每個(gè)水平重復(fù)5次，用上述前處理方法處理樣品，測定回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

（六）長期膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評估膳食暴露評估結(jié)果由公式（1）和公式（2）[19]計(jì)算得出。

公式（1）和公式（2）中，NEDI為國家估算每日攝入量（mg）；STMRi為目標(biāo)化合物在葡萄和我國已登記的其他作物中的規(guī)范殘留試驗(yàn)中值（mg/kg），若計(jì)算NEDI時(shí)，沒有合適的STMRi，則使用相應(yīng)的最大殘留限量（MRL）；Fi為我國人均食品消費(fèi)量（kg）；ADI為可接受的每日攝入量（mg/kg bw）；bw為我國消費(fèi)者的平均體重（kg），按63 kg計(jì)；RQc為慢性風(fēng)險(xiǎn)商（%），若RQc＜100%，表示對消費(fèi)者的膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)可以接受，反之則表示對消費(fèi)者的風(fēng)險(xiǎn)不可接受。

二、結(jié)果與分析

（一）方法有效性評價(jià)采用基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量，將吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)母液用空白葡萄基質(zhì)溶液梯度稀釋為0.02、0.1、0.2、1、2 mg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，將乙嘧酚磺酸酯、乙嘧酚標(biāo)準(zhǔn)母液用空白葡萄基質(zhì)溶液均梯度稀釋為0.02、0.05、0.1、0.5、1 mg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程分別為y＝17 054x+718.98（吡唑醚菌酯）、y＝743 037x+9 680.5（乙嘧酚磺酸酯）、y＝112 269x-223.01（乙嘧酚），相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.994 7（吡唑醚菌酯）、0.998 0（乙嘧酚磺酸酯）、0.999 8（乙嘧酚）。

吡唑醚菌酯、乙嘧酚磺酸酯和乙嘧酚在葡萄中的添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）結(jié)果見表2。由表2可得，吡唑醚菌酯的平均回收率為93%～96%，RSD為2.0%～7.1%；乙嘧酚磺酸酯的平均回收率為98%～99%，RSD為0.7%～2.4%；乙嘧酚的平均回收率為99%～101%，RSD為1.6%～1.9%。吡唑醚菌酯、乙嘧酚磺酸酯和乙嘧酚在葡萄中的定量限均為0.05 mg/kg，符合殘留分析要求。

表2 吡唑醚菌酯、乙嘧酚磺酸酯和乙嘧酚在葡萄中的添加回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和定量限

綜上可得，方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍、準(zhǔn)確度、精密度和定量限均符合NY/T 788-2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》的要求，建立的葡萄中吡唑醚菌酯、乙嘧酚磺酸酯和乙嘧酚的殘留分析方法有效。

（二）殘留消解分析陜西、北京、河南、江蘇4地的殘留消解試驗(yàn)結(jié)果顯示，葡萄中吡唑醚菌酯的原始沉積量為0.14～0.18 mg/kg，末次施藥后14 d的吡唑醚菌酯殘留量均低于0.05 mg/kg；葡萄中乙嘧酚磺酸酯的原始沉積量為0.65～0.83 mg/kg，末次施藥后14 d的乙嘧酚磺酸酯殘留量均低于0.05 mg/kg；葡萄中乙嘧酚的原始沉積量為0.13～0.17 mg/kg，末次施藥后14 d的乙嘧酚殘留量均低于0.05 mg/kg；3者消解速率較快，均無法作出消解曲線。

（三）最終殘留分析10地的最終殘留試驗(yàn)結(jié)果顯示，采集的葡萄樣品中，末次施藥后14 d和21 d的吡唑醚菌酯、乙嘧酚磺酸酯和乙嘧酚的殘留量均低于0.05 mg/kg。

（四）長期膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評估根據(jù)GB 2763-2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[20]，吡唑醚菌酯的ADI為0.03 mg/kg bw，乙嘧酚磺酸酯的ADI為0.05 mg/kg bw，乙嘧酚的ADI為0.035 mg/kg bw。

結(jié)合我國農(nóng)藥登記情況和我國居民的人均膳食結(jié)構(gòu)，計(jì)算得到普通人群吡唑醚菌酯的膳食風(fēng)險(xiǎn)超過100%（見表3），主要是由深色蔬菜的殘留限量引起（我國制定蘿卜葉中吡唑醚菌酯的最大殘留限量為20 mg/kg，其對應(yīng)的攝入量為1.83 mg，膳食風(fēng)險(xiǎn)為96.8%）。而且我國已經(jīng)制定了吡唑醚菌酯在葡萄上的最大殘留限量為2 mg/kg（GB 2763-2021），本研究測得的推薦安全間隔期的最終殘留量低于0.05 mg/kg（＜2 mg/kg）。綜上表明，葡萄中殘留的吡唑醚菌酯對一般人群健康不會產(chǎn)生不可接受的風(fēng)險(xiǎn)。

表3 吡唑醚菌酯的膳食風(fēng)險(xiǎn)評估結(jié)果

普通人群乙嘧酚磺酸酯和乙嘧酚的國家估算每日攝入量均為0.186 0 mg，分別占日允許攝入量的5.9%和8.4%（見表4和表5），結(jié)果表明，乙嘧酚磺酸酯和乙嘧酚對一般人群健康不會產(chǎn)生不可接受的風(fēng)險(xiǎn)。

表4 乙嘧酚磺酸酯的膳食風(fēng)險(xiǎn)評估結(jié)果

表5 乙嘧酚的膳食風(fēng)險(xiǎn)評估結(jié)果

三、結(jié)論

為論證25%吡唑醚菌酯·乙嘧酚磺酸酯微乳劑在葡萄上的安全使用情況，本研究采用田間試驗(yàn)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測和膳食風(fēng)險(xiǎn)評估相結(jié)合的方法對該藥劑在葡萄上的殘留風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了評估。經(jīng)方法有效性評價(jià)得出，所建立的檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍、準(zhǔn)確度、精密度和定量限均滿足農(nóng)藥殘留檢測要求。殘留消解動態(tài)試驗(yàn)和最終殘留試驗(yàn)結(jié)果表明，吡唑醚菌酯、乙嘧酚磺酸酯和乙嘧酚消解速率較快，在末次施藥后14 d的殘留量均低于0.05 mg/kg，最終殘留量均低于0.05 mg/kg。膳食風(fēng)險(xiǎn)評估結(jié)果表明，葡萄中殘留的吡唑醚菌酯、乙嘧酚磺酸酯和乙嘧酚對一般人群健康不會產(chǎn)生不可接受的風(fēng)險(xiǎn)。建議使用25%吡唑醚菌酯·乙嘧酚磺酸酯微乳劑防治葡萄白粉病時(shí)，以最高有效成分用藥量250 mg/kg（制劑1 000倍液），在葡萄白粉病發(fā)病初期噴霧施藥3次，施藥間隔10 d，推薦安全間隔期為14 d。我國暫未制定乙嘧酚在葡萄上的最大殘留限量，根據(jù)《食品中農(nóng)藥最大殘留限量制定指南》，推薦乙嘧酚在葡萄上的最大殘留限量為0.5 mg/kg。