馬天文，呂良鈺，于 躍，賈麗娜，陳 鴻，湯繼浪，趙明超，王新宇，張建濤，高 利

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江省動物疾病致病機制與比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，哈爾濱 150030)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種退行性全關(guān)節(jié)疾病。早期階段動物表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹或跛行等臨床癥狀，病情加重后可出現(xiàn)關(guān)節(jié)僵硬、肌肉無力，功能障礙甚至致殘[1]。作為動物臨床高發(fā)的關(guān)節(jié)疾病，OA導(dǎo)致的跛行嚴重影響家畜使役，促使家畜過早淘汰，也影響動物健康和生活質(zhì)量[2]。目前，OA發(fā)病機制不明確且治療手段十分有限，獸醫(yī)臨床上使用非甾體抗炎藥、COX-2抑制劑等藥物僅能夠緩解疼痛。而且長期使用會導(dǎo)致胃腸道和心血管不良反應(yīng)以及肝功能損傷[3]。因此迫切需要一種有效、安全的策略來預(yù)防或治療OA。

齊墩果酸(oleanolic acid，OLA)是從女貞子果實等植物中分離的五環(huán)三萜類化合物。OLA具有抗炎、抗氧化和護肝等藥理作用。有研究表明，OLA通過miR-148-3p/FGF2通路減輕IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞功能障礙[5]。OLA可以激活SIRT3通過抑制成纖維細胞樣滑膜細胞中的NF-κB信號通路來抑制滑膜炎癥[6]，并且抑制OA大鼠軟骨MMP-3的表達。這些研究表明，OLA對OA軟骨和滑膜炎癥具有積極作用，但其對于OA導(dǎo)致的肌肉功能障礙和軟骨下骨異常骨重建的作用還有待于挖掘。

軟骨下骨異常骨重建是OA軟骨下骨的特征性病變，現(xiàn)有研究表明，其可能是OA發(fā)病的始發(fā)因素[8-9]，表現(xiàn)為軟骨下骨板厚度減少、孔隙率增加、軟骨下骨小梁退化、軟骨下骨囊腫、骨贅形成等特征。此外，OA患畜臨床表現(xiàn)的肌肉無力，主要影響股四頭肌[10]。股四頭肌功能障礙可能早于關(guān)節(jié)疼痛和影像學(xué)形態(tài)改變的發(fā)生[11]，并直接參與OA發(fā)病機制[12]。藏紅花素通過抑制肌肉氧化損傷和炎癥反應(yīng)，減輕大鼠關(guān)節(jié)疼痛和肌肉功能障礙[13]。同時大量報道顯示，靶向調(diào)控Nrf2/NQO1/HO-1通路抑制肌肉氧化損傷是治療OA的潛在策略[14-15]。因此本研究通過ACLT+PMMx方法建立大鼠OA模型，以闡述OLA對OA大鼠肌肉功能障礙和軟骨下骨異常骨重建的作用及可能的分子機制，為下一步的藥物研發(fā)和臨床應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Sprague-Dawley大鼠購自長春易思實驗動物技術(shù)有限公司。動物飼養(yǎng)管理和試驗操作均遵循東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物實驗倫理審查相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑

齊墩果酸(純度≥98%，CAS：508-02-1)購自成都曼思特生物科技有限公司。手術(shù)縫線購自上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司。異氟烷購自北京友誠盛達生物科技有限公司。大鼠CTX-Ⅰ、MHC、CS、OCN、IL-1和IL-6 ELISA試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。GAPDH抗體和NQO1抗體購于武漢愛博泰克生物科技有限公司，HO-1抗體購于沈陽萬類生物科技有限公司，Nrf2抗體購于Affinity公司，高敏型ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.3 主要儀器

外科顯微鏡(科奧達，中國)；Epoch酶標儀(BioTek，美國)；大鼠足底觸敏痛覺測試儀(UGO，意大利)；Micro-CT(Bruker，德國)。

1.4 大鼠OA模型的建立

將18只大鼠隨機分為3組：對照組(CON組)、模型組(OA組)和給藥組(OLA組)，每組6只。大鼠適應(yīng)1周后進行試驗，OA組和OLA組的大鼠通過ACLT+PMMx方法[16]建立OA模型：大鼠異氟烷吸入麻醉，在右膝內(nèi)側(cè)切開2～4 cm切口，髕骨外側(cè)脫位后膝關(guān)節(jié)完全屈曲，外科顯微鏡下切斷前十字韌帶，進行抽屜試驗確保韌帶完全切斷。并以前十字韌帶脛骨起點為圓點外旋45°切除內(nèi)側(cè)半月板的1/3，無菌生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔?？晌站€縫合傷口，消毒后放入籠內(nèi)自由活動。CON組進行假手術(shù)，只切開關(guān)節(jié)囊后縫合，避免損傷其他韌帶和半月板。術(shù)后大鼠連續(xù)3 d給予適量抗生素。

1.5 給藥及樣本采集

OLA組大鼠手術(shù)后每日灌胃50 mg·(kg·d)-1OLA，連續(xù)灌胃4周。OLA溶于含有20 mL·L-1Tween 80的無菌生理鹽水中，OLA劑量的選擇參考之前的研究[17]。CON組與OA組灌胃等體積的含20 mL·L-1Tween 80的無菌生理鹽水。所有大鼠分別于造模后第0、7、14和28天進行疼痛行為學(xué)測試。試驗第28天，采集大鼠血液樣本后1 000g離心20 min，收集上清液進行血清ELISA試驗。試驗第28天所有大鼠實施安樂死，收集各組大鼠右側(cè)包括股直肌在內(nèi)的股四頭肌樣本，注意避免包含任何脂肪組織或其他肌肉，進行Western blot和肌肉ELISA試驗。收集膝關(guān)節(jié)樣本，進行Micro-CT掃描。

1.6 疼痛行為學(xué)

1.6.1 伸膝發(fā)聲試驗 根據(jù)前人的方法[18]，通過大鼠發(fā)聲次數(shù)反映膝關(guān)節(jié)疼痛情況。從靜止姿勢、膝略微彎曲開始測試。首先保定大鼠，伸展膝關(guān)節(jié)，保證膝關(guān)節(jié)完全伸展，將膝蓋夾在大拇指和食指之間，在內(nèi)側(cè)方向?qū)οリP(guān)節(jié)擠壓，上下左右伸膝。大鼠發(fā)聲記“X”，不發(fā)聲記“O”，每次間隔5 min，共測5次，記錄發(fā)聲次數(shù)之和。

1.6.2 熱敏感試驗 根據(jù)前人的方法[19]。在每次試驗開始前，將大鼠放在玻璃板上方的不透明塑料室中15 min以適應(yīng)環(huán)境。將大鼠足底觸敏痛覺測試儀上的“十”字形標記置于大鼠左后跖足底中央，但避開足墊。接下來開啟儀器，從開始至大鼠出現(xiàn)抬腿回避的時間作為大鼠的足熱痛敏潛伏期(paw withdrawal latency, PWL)。每5 min重復(fù)1次，每只大鼠檢測3次取平均值。大鼠每次接受輻射熱刺激最長時間為20 s，以避免損傷其他組織。

1.7 ELISA試驗

采用ELISA試劑盒測定各組大鼠肌肉中檸檬酸合酶(citrate synthase, CS)、肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain, MHC)、白細胞介素1(interleukin 1, IL-1)和IL-6的水平，以及血清中骨鈣素(osteocalcin, OCN)和Ⅰ型膠原羧基末端肽(C-terminal typeⅠ collagen telopeptide, CTX-Ⅰ)的水平，嚴格按照ELISA試劑盒的說明書操作。

1.8 Micro-CT對軟骨下骨影像學(xué)的檢測與分析

分別對各組大鼠膝關(guān)節(jié)進行Micro-CT掃描，包括脛骨和股骨各5 mm，射線管電流200 μA，電壓85 kV，掃描分辨率10 μm，曝光時間384 ms。使用三維重建軟件NRecon(V1.7.4.2版本，德國Bruker公司)對原始圖像進行選擇區(qū)域的重建。使用CT Analyser(1.18.8.0版本，德國Bruker公司)對感興趣區(qū)域ROI進行分析。設(shè)定統(tǒng)一參數(shù)，由CT Analyser軟件計算出骨體積分數(shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨礦物質(zhì)密度(BMD)參數(shù)。

1.9 Western blot檢測目的蛋白

使用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液提取各組肌肉的總蛋白。用BCA蛋白分析試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品加入凝膠泳道電泳，然后使用300 mA恒流，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用50 g·L-1牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h后，在4 ℃下與一抗孵育過夜，一抗稀釋比：GAPDH(1∶2 000)、Nrf2(1∶2 000)、HO-1(1∶1 000)和NQO1(1∶2 000)。將膜與二抗(1∶3 000)室溫孵育1 h，使用高敏型ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影，用自動凝膠圖像分析系統(tǒng)顯示蛋白條帶，Image J軟件分析灰度值。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

本試驗數(shù)據(jù)使用SPSS軟件(Windows版本19.0，USA)進行分析。數(shù)據(jù)均采用“平均值±標準偏差(SD)”表示。組間采用單因素方差分析(ANOVA)，然后進行Tukey檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，制圖軟件為GraphPad Prism 8。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 OLA抑制OA大鼠的關(guān)節(jié)疼痛

如圖1A伸膝發(fā)聲行為學(xué)檢測結(jié)果顯示，與CON組比較，OA組造模28 d內(nèi)發(fā)聲次數(shù)極顯著增加(P<0.01)，與OA組比較，OLA組大鼠發(fā)生次數(shù)極顯著減少(P<0.01)。如圖1B所示，與CON組比較，OA組大鼠的PWL極顯著縮短(P<0.01)，與OA組比較，OLA組大鼠的PWL極顯著增加(P<0.01)。

A.伸膝發(fā)聲試驗；B.熱敏感試驗；*.P<0.05，**.P<0.01，下同

2.2 OLA通過Nrf2/NQO1/HO-1通路抑制OA大鼠肌肉氧化損傷

如圖2結(jié)果顯示，與CON組比較，OA組大鼠股四頭肌組織中Nrf2和NQO1蛋白表達極顯著下降(P<0.01)，OLA組中Nrf2和NQO1蛋白表達顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)升高。與OA組比較，OLA組中Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達水平極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)升高。綜上所述，OLA通過調(diào)控Nrf2/NQO1/HO-1通路抑制OA大鼠肌肉氧化損傷。

A.OLA干預(yù)對OA大鼠Nrf2/NQO1/HO-1蛋白表達的影響；B～D.各蛋白表達情況灰度分析

2.3 OLA能夠改善OA大鼠肌肉功能障礙

通過ELISA方法檢測大鼠股四頭肌組織中CS、MHC以及炎癥因子IL-1和IL-6含量變化。如圖3A～D結(jié)果顯示，與CON組比較，OA組大鼠肌肉組織中MHC和CS含量極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)降低，OLA組中CS和MHC含量無明顯變化。與OA組比較，OLA組中MHC和CS含量顯著增加(P<0.05)。此外，與CON組比較，OA組大鼠肌肉組織中IL-1和IL-6含量極顯著增加(P<0.01)，OLA組中IL-6含量極顯著降低(P<0.01)。與OA組比較，OLA組肌肉組織中IL-1和IL-6含量顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)降低。

圖3 OLA能夠改善OA大鼠肌肉功能障礙

2.4 OLA抑制OA大鼠軟骨下骨的異常骨重建

如圖4所示，與CON相比，OA組中Tb.Th、BMD和BV/TV顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)降低，OLA組中BV/TV極顯著降低(P<0.01)。與OA組相比，OLA組中Tb.Th、BMD和BV/TV顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)增加。Tb.N在CON組、OA組和OLA組的組間變化均不顯著。

A.各組大鼠右膝關(guān)節(jié)Micro-CT掃描代表性圖像；B. Tb.Th(骨小梁厚度)；C. BMD(骨礦物質(zhì)密度)；D. BV/TV(骨體積分數(shù))；E. Tb.N(骨小梁數(shù))

2.5 OLA抑制OA大鼠血清中骨代謝標志物OCN和CTX-Ⅰ的表達

如圖5所示，與CON組比較，OA組大鼠血清中OCN含量顯著升高(P<0.05)，CTX-Ⅰ濃度呈極顯著升高(P<0.01)，OLA組中OCN和CTX-Ⅰ無顯著變化。與OA組比較，OLA組大鼠血清中OCN和CTX-Ⅰ含量顯著降低(P<0.05)，其中CTX-Ⅰ濃度呈極顯著降低(P<0.01)。

圖5 OLA抑制骨關(guān)節(jié)炎大鼠血清中骨代謝標志物OCN和CTX-Ⅰ的表達

3 討 論

OLA是一種廣泛使用的植物三萜類化合物，具有很強的抗氧化活性。以往研究表明，OLA對OA具有積極作用，但具體作用機制不明確。肌肉功能障礙和軟骨下骨異常骨重建與OA病理有關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)OLA能夠有效減輕OA大鼠疼痛反應(yīng)，通過Nrf2/NQO1/HO-1通路抑制炎癥反應(yīng)和肌肉氧化損傷，并且抑制軟骨下骨的異常骨重建，這為OLA治療OA機制提供了新思路。

氧化應(yīng)激能夠參與OA肌肉功能障礙和炎癥的發(fā)病機制。肌肉氧化應(yīng)激會使Nrf2在細胞質(zhì)中積累，然后最終轉(zhuǎn)移到細胞核，啟動醌氧化還原酶-1(NQO1)和血紅素加氧酶1(HO-1)的基因轉(zhuǎn)錄。有研究表明，OA的肌肉Nrf2水平降低，而芝麻油能夠顯著增加肌肉Nrf2表達，抑制氧化應(yīng)激從而減輕早期關(guān)節(jié)疼痛。本研究發(fā)現(xiàn)OLA干預(yù)后大鼠股四頭肌中Nrf2、HO-1和NQO1蛋白水平較OA組顯著上升，從而誘導(dǎo)促炎因子IL-1和IL-6的產(chǎn)生，這說明OLA能夠調(diào)控Nrf2/NQO1/HO-1通路抑制OA大鼠肌肉氧化損傷。此外，與OA相關(guān)的股四頭肌無力的潛在機制已被闡明[24]，其中，MHC的改變在肌力中起主導(dǎo)作用[11]。細胞因子IL-1和IL-6以及CS與肌肉質(zhì)量和肌力損失有關(guān)[25]。本研究發(fā)現(xiàn)ACLT+PMMx大鼠肌肉中IL-1和IL-6增加，CS活性和MHC表達降低，表明OA大鼠肌無力，持續(xù)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致細胞膜的脂質(zhì)過氧化，損害細胞器的功能和細胞破壞最終導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，而OLA通過恢復(fù)CS活性和MHC含量可以改善OA中股四頭肌功能障礙。

OA是軟骨、軟骨下骨、韌帶和滑膜等所有關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)性疾病[26]。在OA中，軟骨下骨和關(guān)節(jié)軟骨之間進行信號交互。在OA早期，軟骨下骨板變薄、疏松，軟骨下骨小梁退化。在OA晚期，鈣化的軟骨和軟骨下骨板變厚，并伴有軟骨下骨小梁硬化等特征[28]。不同造模方法和造模時長軟骨下骨的變化時期有所不同。既往對OA軟骨下骨的研究大多通過切除前十字韌帶或半月板造成關(guān)節(jié)不穩(wěn)而建立OA模型[31]。本研究通過ACLT+PMMx方法誘導(dǎo)大鼠創(chuàng)傷性O(shè)A，以探討軟骨下骨力學(xué)結(jié)構(gòu)改變在OLA干預(yù)后的變化。有研究表明，在ACLT+MMx模型后兩周表現(xiàn)出顯著的軟骨下骨丟失，BV/TV下降，而在造模后6周BV/TV較對照組上升，呈現(xiàn)骨硬化。因此本試驗采取ACLT+PMMx模型造模4周，模擬OA早期階段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，造模后軟骨下骨BV/TV、BMD和Tb.Th均較CON組下降，而通過OLA干預(yù)后，BV/TV、BMD和Tb.Th參數(shù)顯著上升。此外，骨代謝標志物CTX-Ⅰ和CON分別是骨吸收過程中Ⅰ型膠原釋放入血的產(chǎn)物和成骨細胞分泌的非膠原蛋白[33]。在本研究中，OA大鼠血清中OCN和CTX-Ⅰ含量均顯著上升，OLA干預(yù)顯著降低了CTX-Ⅰ和OCN表達。這表明OLA參于OA導(dǎo)致的軟骨下骨異常骨重建，不僅可以改善OA發(fā)病早期階段關(guān)節(jié)軟骨下骨生物學(xué)損傷，還能夠調(diào)節(jié)其生物力學(xué)特性。OLA調(diào)節(jié)OA軟骨下骨代謝，抑制骨小梁三維結(jié)構(gòu)的破壞，并緩解OA大鼠的骨侵蝕，從而有效阻止OA病理過程中軟骨下骨異常骨重建和微結(jié)構(gòu)改變的可能性。但OLA如何參與軟骨下骨代謝的分子機制，以及對破骨細胞和成骨細胞的調(diào)控作用仍需進一步研究。

4 結(jié) 論

OLA可能夠抑制OA大鼠關(guān)節(jié)疼痛反應(yīng)，并通過調(diào)控Nrf2/NQO1/HO-1通路抑制OA大鼠肌肉功能障礙，改善OA早期軟骨下骨生物力學(xué)性能和微結(jié)構(gòu)改變，從而延緩OA大鼠軟骨下骨異常骨重建的發(fā)生。