如孜萬古麗·依馬木，張愛蓮*，翁 翔，肖 鵬，曹 輝，吳道澄

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源與基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，室烏魯木齊 830046；2.天康生物股份有限公司，烏魯木齊 830000； 3.西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，西安 710000)

口蹄疫(food-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是嚴(yán)重危害動物健康的病毒性疾病。廣泛接種含有油乳劑ISA-206、ISA-201的口蹄疫滅活疫苗(foot-and-mouth disease inactivated vaccine, FMDV)是預(yù)防和控制FMD的有效策略。但是，F(xiàn)MDV誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)較弱，且疫苗中的油乳劑伴有較高的毒性，易造成注射部位膿腫、肉芽腫等不良反應(yīng)[1-2]。因此，研制能夠激發(fā)Th1/Th2免疫應(yīng)答的高效、低毒新型佐劑對于提高FMDV效力至為關(guān)鍵[3]。

中草藥及其活性成分具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用，例如菊粉、香菇、黨參、人參等多糖作為流感、COVID-19、艾滋病、乙肝、新城疫及禽流感等疫苗佐劑通過促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟、促進(jìn)T/B淋巴細(xì)胞增殖及CTL反應(yīng)等增強(qiáng)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)從而提高疫苗效力。中草藥因其具有低毒性、資源豐富等優(yōu)點(diǎn)而成為了新型疫苗佐劑的候選物[4-5]。同時(shí)，中草藥多糖成分也用于FMDV新型佐劑的研究中，例如川明參、馬齒莧等通過有效激活B細(xì)胞，促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)CTL反應(yīng)而提高FMDV效力，并具有良好的安全性[6-7]，在FMD預(yù)防中展現(xiàn)出應(yīng)用的潛力。

新疆一枝蒿(ArtemisiarupestrisL.)為菊科蒿屬植物，主要包括多糖、黃酮、生物堿等化學(xué)成分，多糖作為主要免疫活性成分具有抗病毒、抗炎等免疫調(diào)節(jié)作用，毒副作用少，臨床上常應(yīng)用于流感、過敏、蕁麻疹等疾病的治療[8]。本課題組前期發(fā)現(xiàn)野生一枝蒿水提物作為流感疫苗和FMDV的佐劑可以提高小鼠血清中IgG抗體水平，促進(jìn)脾中T細(xì)胞亞群的增殖及Th1/Th2型細(xì)胞因子的分泌[9-10]；栽培一枝蒿粗多糖配伍卵清白蛋白免疫小鼠能增強(qiáng)Th1/Th2反應(yīng)而表現(xiàn)出良好的佐劑活性[11]。中草藥的免疫調(diào)節(jié)活性受多種因素影響，如種類、來源和提取條件等。一枝蒿的化學(xué)成分分析表明，野生和栽培品種均含有黃酮、多糖、生物堿、揮發(fā)油等成分，在野生和栽培品種中這些化學(xué)成分的含量有所差異，例如，野生品種黃酮含量高于栽培品種，栽培品種多糖含量高于野生品種[12-13]。由于野生一枝蒿資源稀缺，栽培一枝蒿已經(jīng)成功種植并應(yīng)用于臨床。為進(jìn)一步探討栽培一枝蒿粗多糖作為疫苗佐劑的可行性，本試驗(yàn)通過肌肉途徑免疫ICR小鼠，比較栽培/野生一枝蒿粗多糖(cultivated/wildArtemisiarupestrisL. crude polysaccharides，CARCP/WARCP)作為FMDV佐劑對小鼠體液和細(xì)胞免疫的影響，探究CARCP/WARCP的佐劑活性和安全性，為栽培一枝蒿粗多糖作為FMDV新型佐劑的有效開發(fā)利用提供重要的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

CARCP/WARCP(多糖含量分別為32.53%、30.94%)[13]。口蹄疫滅活抗原(foot-and-mouth disease antigen, FMD-Ag 146S 5.63 μg·mL-1)O3/My098株、ISA-206油乳劑購自天康生物股份有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a與IgE購自Southbiotech公司；N-四甲基聯(lián)苯胺(Tetramethyl-benzidine, TMB)購自Sigma公司；CD3-PE、CD4-APC、CD8-FITC、CD8-APC、CD44-PE、CD62L-FITC等流式抗體均購自BD公司，其余試劑為國產(chǎn)純試劑。

1.2 動物及免疫分組

雌性ICR小鼠(體重 20～30 g)購于新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。30只ICR小鼠隨機(jī)分為6組，每組5只，分組如下：1)0.9% NaCl組(空白對照組)；2)FMDV組(146S 0.3 μg·只-1)；3)FMDV/CARCP1組(146S 0.3 μg·只-1，CARCP1 總物質(zhì)150 μg·只-1)；4)FMDV/WARCP1組(146S 0.3 μg·只-1，WARCP1總物質(zhì)150 μg·只-1)；5)FMDV/CARCP2組(146S 0.3 μg·只-1，CARCP2多糖含量150 μg·只-1)；6)FMDV/WARCP2組(146S 0.3 μg·只-1，WARCP2多糖含量150 μg·只-1)。根據(jù)文獻(xiàn)[10]制備疫苗，簡述如下：將FMD-Ag分別與CARCP/WARCP水劑和ISA-206油乳劑乳化制備成水包油包水(W/O/W)疫苗，經(jīng)肌肉途徑，于0、14 d免疫小鼠2次(120 μL·只-1)。

1.3 抗體及亞型水平檢測

ELISA檢測小鼠初次免疫后14～28 d血清中IgG及28 d IgG1和IgG2a水平[10]。簡述如下：FMD-Ag(1 μg·mL-1)包被于96孔板中4 ℃過夜。用含PBST(0.05%吐溫20)洗板后加入5%脫脂奶粉在37 ℃封閉60 min。加入檢測血清(1∶1 000)37 ℃孵育60 min后PBST洗板。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG、IgG1和IgG2a二抗(1∶10 000)37 ℃孵育60 min。TMB避光顯色10～20 min后終止顯色，酶標(biāo)儀450 nm檢測吸光度(Optimal density, OD)。

1.4 T細(xì)胞亞群檢測

加強(qiáng)免疫后14 d收集各組小鼠脾組織，裂解紅細(xì)胞后獲得脾單細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞濃度調(diào)到每毫升1×106個，離心7 min后，分別用CD3-PE/CD4-APC/CD8-FITC、CD4-APC/CD44-PE、CD8-APC/CD44-PE、CD62L-FITC/CD44-PE的熒光抗體進(jìn)行表面避光染色30 min，終止染色用流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)lowJo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5 安全性檢測

CARCP/WARCP免疫后定期稱量初次免疫后0、14、28 d小鼠體重，監(jiān)測臨床癥狀，觀察注射部位反應(yīng)，并進(jìn)行初次免疫后28 d血清中IgE水平檢測，進(jìn)行CARCP/WARCP對小鼠的安全性的初步評價(jià)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”展示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和Tukey’s多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 CARCP/WARCP對IgG抗體水平的影響

為了比較CARCP/WARCP對小鼠體液免疫的影響，ELISA檢測初次免疫后14～28 d小鼠血清中FMDV特異性IgG水平，結(jié)果如圖1所示，總物質(zhì)量一致時(shí)，CARCP1/WARCP1均能極顯著提高初次免疫后14～28 d小鼠血清IgG水平(P<0.01)。在14 和21 d時(shí)，CARCP1的增強(qiáng)效果顯著高于WARCP1(P<0.05)，在28 d時(shí)CARCP1/WARCP1 IgG水平之間差異不顯著(P>0.05)。多糖含量一致時(shí)，在14 d 時(shí)，與FMDV相比，CARCP2/WARCP2差異不顯著(P>0.05)，且CARCP2/WARCP2 IgG水平之間差異不顯著(P>0.05)。在21和28 d時(shí)，CARCP2/WARCP2均顯著增強(qiáng)了IgG水平(P<0.05)，且CARCP2和WARCP2之間差異不顯著(P>0.05)。

與FMDV相比，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001；CARCP1與WARCP1相比，CARCP2與WARCP2相比，#.P<0.05，ns. P>0.05。下同

2.2 CARCP/WARCP配伍FMDV對抗體亞型的影響

ELISA檢測初次免疫后28 d血清中抗體亞型水平，結(jié)果如圖2所示，總物質(zhì)量一致時(shí)，與FMDV相比，CARCP1/WARCP1均能顯著提高FMDV特異性IgG1水平(P<0.05)，且CARCP1/WARCP1之間差異不顯著(P>0.05)。CARCP1/WARCP1均能極顯著提高IgG2a水平(P<0.01)，且CARCP1組IgG2a水平高于WARCP1(P<0.05)。CARCP1/WARCP1均能顯著提高IgG2a/IgG1比值(P<0.01)，且CARCP1 IgG2a/IgG1比值顯著高于WARCP1(P<0.05)。多糖含量一致時(shí)，CARCP2/WARCP2均能顯著增強(qiáng)IgG2a水平(P<0.05)，極顯著提高IgG2a/IgG1比值(P<0.01)，CARCP2/WARCP2 IgG1水平與FMDV相比差異不顯著(P>0.05)，且CARCP2/WARCP2之間差異不顯著(P>0.05)。

A. 28 d血清中IgG1水平；B. 28 d IgG2a水平；C. IgG2a/IgG1比值

2.3 CARCP/WARCP配伍FMDV免疫對CD3+CD4+和CD3+CD8+T細(xì)胞的影響

加強(qiáng)免疫后14 d用流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾T細(xì)胞亞群的百分比，結(jié)果如圖3所示，總物質(zhì)量一致時(shí)，CARCP1/WARCP1均能極顯著促進(jìn)脾T細(xì)胞亞群CD3+CD4+百分比(P<0.01)，顯著促進(jìn)CD3+CD8+比例(P<0.05)，且CARCP1的增強(qiáng)效果顯著高于WARCP1(P<0.05)。多糖含量一致時(shí)，CARCP2/WARCP2對CD3+CD4+和CD3+CD8+T細(xì)胞的作用與FMDV相比差異不顯著(P>0.05)，且CARCP2/WARCP2之間差異不顯著(P>0.05)。

A. 脾CD3+CD4+T細(xì)胞百分比；B. 脾CD3+CD8+T細(xì)胞百分比

2.4 CARCP/WARCP配伍FMDV對CD4+CD44+和CD8+CD44+效應(yīng)T細(xì)胞的影響

加強(qiáng)免疫后14 d，流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾效應(yīng)T細(xì)胞亞群比例結(jié)果如圖4所示，總物質(zhì)量一致時(shí)，CARCP1/WARCP1均能極顯著提高CD4+CD44+(P<0.01)，顯著提高CD8+CD44+T細(xì)胞亞群比例(P<0.05)，且CARCP1增強(qiáng)效果高于WARCP1(P<0.05)。多糖含量一致時(shí)，CARCP2/WARCP2均能顯著提高CD4+CD44+比例(P<0.05)，且CARCP2/WARCP2之間差異不顯著(P>0.05)。CARCP2/WARCP2對CD8+CD44+比例與FMDV相比差異不顯著(P>0.05)，且CARCP2/WARCP2之間差異不顯著(P>0.05)。

A. 脾CD4+CD44+效應(yīng)T細(xì)胞百分比；B. 脾CD8+CD44+效應(yīng)T細(xì)胞百分比

2.5 CARCP/WARCP配伍FMDV對記憶T細(xì)胞CD8+CD44+CD62L+/CD62L-的影響

加強(qiáng)免疫后14 d小鼠脾記憶T細(xì)胞亞群水平檢測結(jié)果如圖5所示，總物質(zhì)量一致時(shí)，CARCP1/WARCP1均極顯著提高CD8+CD44+CD62L+比例(P<0.01)，顯著增強(qiáng)記憶T細(xì)胞CD8+CD44+CD62L-(P<0.05)比例，且CARCP1增強(qiáng)效果顯著高于WARCP1(P<0.05)。多糖含量一致時(shí)，CARCP2/WARCP2對CD8+CD44+CD62L-/CD62L+T細(xì)胞的作用與FMDV相比差異不顯著(P>0.05)，且CARCP2/WARCP2之間差異不顯著(P>0.05)。

A. 脾CD8+CD44+CD62L-記憶T細(xì)胞百分比；B. 脾CD8+CD44+CD62L+記憶T細(xì)胞百分比

2.6 CARCP/WARCP配伍FMDV對小鼠的安全性分析

小鼠免疫后每天觀察其臨床癥狀，整個免疫過程中沒有出現(xiàn)皮毛褶皺、肌肉抽搐、呼吸窘迫等癥狀。CARCP/WARCP佐劑FMDV免疫0、14、28 d后，同一時(shí)間點(diǎn)各組小鼠體重差異不顯著(圖6A，P>0.05)。初免后28 d，CARCP1/WARCP1配伍FMDV免疫組小鼠IgE抗體之間差異不顯著(P>0.05)。CARCP2/WARCP2之間差異不顯著(圖6B，P>0.05)。

A. 小鼠體重；B. 小鼠血清IgE水平

3 討 論

中草藥多糖作為新型疫苗佐劑在傳染病治療和預(yù)防方面具有良好的應(yīng)用前景[14]。安全有效的佐劑對于FMDV發(fā)揮免疫增強(qiáng)效應(yīng)具有重要的輔助作用，然而也會伴隨著一些副作用，如鋁佐劑能夠增強(qiáng)抗體產(chǎn)生，但是細(xì)胞反應(yīng)較弱且伴隨疼痛、腫脹等限制了其在FMDV中應(yīng)用[2]。前期研究表明，CARCP/WARCP具有良好佐劑活性[9-11]，為此，本研究選用CARCP/WARCP作為FMDV候選佐劑，基于總物質(zhì)量和多糖含量比較CARCP/WARCP對體液免疫及細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響，觀察CARCP/WARCP的免疫增強(qiáng)作用和安全性的異同。

CARCP/WARCP配伍FMDV免疫后小鼠注射部位沒有出現(xiàn)肉芽腫、膿腫等不良反應(yīng)，沒有出現(xiàn)食欲不振、脫毛、肌肉抽搐等癥狀，對各組小鼠生長沒有影響，也沒有引起過敏反應(yīng)，提示CARCP/WARCP作為FMDV佐劑具有較好的安全性。

有效的體液免疫反應(yīng)在抵御FMD病毒感染及提供長期保護(hù)中起至關(guān)重要的作用，IgG水平的高低是評價(jià)疫苗效力的間接指標(biāo)。菊粉多糖作為H1N1佐劑能夠提高體液免疫反應(yīng)[15]。因此，本研究以總物質(zhì)量和多糖含量為標(biāo)準(zhǔn)，比較CARCP/WARCP對FMDV免疫小鼠IgG水平的增強(qiáng)效果。初次免疫后14～28 d IgG結(jié)果表明，總物質(zhì)量一致時(shí)，CARCP1/WARCP1均能增強(qiáng)FMDV特異性IgG水平，且CARCP1效果高于WARCP1，這與CARCP多糖含量高于WARCP相關(guān)。多糖含量一致時(shí)，CARCP2/WARCP2均能提高IgG水平，且CARCP2/WARCP2增強(qiáng)作用相當(dāng)，這與CARCP2/WARCP2多糖含量相同相關(guān)。

有研究表明，馬齒莧、川明參等中草藥多糖作為FMDV佐劑可以誘導(dǎo)Th1/Th2反應(yīng)，尤其激發(fā)Th1反應(yīng)而增強(qiáng)了FMDV效力[6-7]。本研究中，初次免疫后28 d IgG1、IgG2a結(jié)果表明，總物質(zhì)量一致時(shí)，CARCP1/WARCP1均能提高FMDV特異性IgG2a(Th1)、IgG1(Th2)以及IgG2a/IgG1比值，且CARCP1增強(qiáng)效果高于WARCP1。多糖含量一致時(shí)，CARCP2/WARCP2均能增強(qiáng)IgG2a水平及IgG2a/IgG1比值，且CARCP2/WARCP2增強(qiáng)效果相當(dāng)。這些結(jié)果顯示，CARCP/WARCP均能促進(jìn)Th1/Th2反應(yīng)，尤其是Th1反應(yīng)，激發(fā)針對FMD的有效體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。

效應(yīng)及記憶T細(xì)胞活化對FMD防治具有重要意義[16-17]，黃芪等中草藥多糖能夠促進(jìn)效應(yīng)及記憶T細(xì)胞而增強(qiáng)了針對FMD的細(xì)胞免疫應(yīng)答[18]。為此，本研究為評估CARCP/WARCP對細(xì)胞免疫的影響，加強(qiáng)免疫后14 d檢測了脾中T細(xì)胞亞群，結(jié)果表明總物質(zhì)量一致時(shí)，CARCP1/WARCP1均能增強(qiáng)CD3+CD4+和CD3+CD8+及CD4+CD44+和CD8+CD44+效應(yīng)T細(xì)胞及CD8+CD44+CD62L-/CD62L+記憶T細(xì)胞比例，且CARCP1增強(qiáng)效果優(yōu)于WARCP1，這與CARCP1的多糖含量高于WARCP1相關(guān)。多糖含量一致時(shí)，CARCP2/WARCP2均能增強(qiáng)效應(yīng)T細(xì)胞及記憶T細(xì)胞比例，且CARCP2/WARCP2的作用沒有差異，表明CARCP2/WARCP2促進(jìn)效應(yīng)及記憶T細(xì)胞活化與多糖含量相同相關(guān)。

4 結(jié) 論

綜上所述，總物質(zhì)量一致時(shí)，CARCP1/WARCP1均能增強(qiáng)FMDV特異性體液和細(xì)胞免疫水平，尤其是Th1反應(yīng)，CARCP1效果優(yōu)于WARCP1，這與CARCP1的多糖含量高于WARCP1相關(guān)；多糖含量一致時(shí)，CARCP2/WARCP2佐劑效應(yīng)并無差異，表明CARCP2/WARCP2促進(jìn)FMDV特異性免疫反應(yīng)與多糖含量相同相關(guān)。這些研究結(jié)果提示，CARCP作為FMDV新型佐劑的有效性和安全性，也為探索中草藥多糖作為新型佐劑預(yù)防和控制其他傳染病提供試驗(yàn)借鑒。