張靖羚 楊雅靜 周留林

(蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬泰興市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇省泰興市 225400)

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤，以腺癌多見。2020年，全球子宮內(nèi)膜癌新發(fā)病例數(shù)和死亡病例數(shù)分別為417 367例、97 370例[1]。子宮內(nèi)膜癌起病較為隱匿，早期臨床癥狀不典型，易被忽視，導(dǎo)致患者不能及時(shí)就診而預(yù)后不佳。目前子宮內(nèi)膜癌的治療方法主要有手術(shù)、放療、藥物(化學(xué)藥物及激素)治療、靶向治療。手術(shù)治療的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)式多為全子宮、雙附件切除及盆腹淋巴結(jié)清掃。目前子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病人群呈年輕化趨勢(shì)[2]，而年輕且要求保留生育功能的子宮內(nèi)膜癌患者對(duì)傳統(tǒng)手術(shù)治療較為抵觸[3]。因此，如何實(shí)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌的早期診治成為目前臨床上亟待解決的難題，而尋找新型的生物標(biāo)志物對(duì)于子宮內(nèi)膜癌的早期診斷、靶向治療及預(yù)后評(píng)估具有重要意義。

八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(octamer-binding transcription factor 4，OCT4)參與胚胎干細(xì)胞的分化和調(diào)節(jié)，其主要表達(dá)于胚胎時(shí)期[4]。研究表明， OCT4基因缺失時(shí)，胚胎干細(xì)胞會(huì)失去自我更新的能力，并向胚胎外的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞分化[5]。OCT4還表達(dá)于生殖細(xì)胞腫瘤，如男性泌尿生殖細(xì)胞來源的惡性腫瘤或胚胎癌[6-7]。此外，在某些與原始細(xì)胞生殖及發(fā)育關(guān)聯(lián)不密切的腫瘤細(xì)胞和組織中也可以檢測(cè)到OCT4，如膀胱癌、肺癌、乳腺癌等[8-10]。研究發(fā)現(xiàn)OCT4在部分女性生殖系統(tǒng)的惡性腫瘤中異常表達(dá)，如卵巢癌、宮頸癌等[11-12]。但OCT4在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)情況尚不明確，且其在子宮內(nèi)膜癌中的具體作用尚不清楚。假基因是與編碼基因序列高度同源的非編碼基因，由于重復(fù)基因的反復(fù)拷貝，導(dǎo)致其失去原有的功能。既往研究認(rèn)為假基因是進(jìn)化過程中被淘汰的基因片段[13]。然而近年來有研究表明假基因具有重要的遺傳功能。POU結(jié)構(gòu)域5類轉(zhuǎn)錄因子1B(POU domain class 5 transcription factor 1B，POU5F1B)，即OCT4假基因5，與親本基因OCT4有95%的同源性，是一種OCT4假基因。POU5F1B可作為一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，如食管癌、胃癌等[14-15]。有研究顯示，POU5F1B在宮頸癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，沉默假基因POU5F1B會(huì)導(dǎo)致其親本基因OCT4的表達(dá)量下降[16]。這說明在部分腫瘤中POU5F1B與OCT4的表達(dá)存在一定的關(guān)聯(lián)性。但是目前尚無關(guān)于兩者在子宮內(nèi)膜癌中的生物學(xué)作用的研究。本研究探討兩者在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)情況及其與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，旨在為子宮內(nèi)膜癌患者的疾病診斷及病情評(píng)估提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 納入2018年1月至2020年11月蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬泰興市人民醫(yī)院收治的62例子宮內(nèi)膜腺癌患者(觀察組)和50例子宮內(nèi)膜良性病變患者(對(duì)照組)。收集觀察組患者手術(shù)切除的子宮內(nèi)膜腺癌組織標(biāo)本及對(duì)照組患者手術(shù)切除的增生期子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本，兩類組織均包括石蠟標(biāo)本(主要用于免疫組化檢測(cè))和臨床新鮮組織標(biāo)本，其中新鮮標(biāo)本組織在離體30 min內(nèi)取材，置于-80 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆?主要用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)觀察組患者均經(jīng)病理證實(shí)為子宮內(nèi)膜腺癌，對(duì)照組患者均因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)，且術(shù)后病理證實(shí)子宮內(nèi)膜為增生期；(2)所有患者均為初始治療；(3)所有患者的臨床病理資料完整，并知情同意參加本次研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前接受放化療治療的患者；(2)合并其他部位的惡性腫瘤患者；(3)影像學(xué)資料、病例資料不完善的患者。觀察組患者年齡48～70(57.04±5.86)歲；國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期為Ⅰ期32例，Ⅱ～Ⅳ期30例，其中ⅠA期患者均行全子宮+雙附件切除，ⅠB期及以上患者均行子宮內(nèi)膜癌全面分期手術(shù)；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移共33例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移共29例；浸潤(rùn)肌層深度≤1/2共34例，浸潤(rùn)肌層深度>1/2共28例；分化程度為高分化共36例，中低分化共26例。對(duì)照組患者年齡45～63(53.07±5.71)歲。由2名以上的主任醫(yī)師進(jìn)行臨床診斷，由2名病理科主任醫(yī)師進(jìn)行病理診斷。本研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器 兔抗人OCT4多克隆抗體(批號(hào)：ab19857)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidin-peroxidase，SP)法即用型試劑盒(批號(hào)：SV0002)、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色劑(批號(hào)：AR1022)、乙二胺四乙酸抗原修復(fù)液(批號(hào)：AR0023)均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。TRIzol試劑(批號(hào)：15596026)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：DRR06A)、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(批號(hào)：DRR081A)購(gòu)自日本TaKaRa公司。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)OCT4蛋白表達(dá)情況 常規(guī)制備組織石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后，于乙二胺四乙酸中進(jìn)行抗原熱修復(fù)，然后于3%過氧化氫中孵育10 min消除內(nèi)源過氧化酶活性，添加5%的山羊血清，37 ℃下封閉1 h后，加入OCT4一抗(用抗原稀釋液按1 ∶500的比例稀釋)100 μL，于4 ℃下孵育過夜。以PBS作為陰性對(duì)照，添加兔抗人IgG(武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：SV0002)100 μL，37 ℃下孵育30 min后，用PBS洗滌3次，5 min/次，行DAB顯色后，于光學(xué)顯微鏡(Olympus公司)下觀察圖像。OCT4蛋白主要定位在細(xì)胞核內(nèi)，呈棕黃色至深棕色。根據(jù)著色細(xì)胞數(shù)及染色程度確定OCT4的表達(dá)情況：著色細(xì)胞數(shù)<10%或未染色，記(-)；著色細(xì)胞占10%～20%且染色弱至中等，記(+)；著色細(xì)胞占10%～20%且染色強(qiáng)，或著色細(xì)胞占 20%～50%且染色弱至中等，記(++)；著色細(xì)胞占20%～50%且染色強(qiáng)，或著色細(xì)胞>50%，記(+++)。其中(-)和(+)定義為低表達(dá)，(++)和(+++)定義為高表達(dá)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)OCT4 mRNA和POU5F1B mRNA的表達(dá)水平 從-80 ℃冰箱中取出新鮮組織標(biāo)本，切取約100 mg組織轉(zhuǎn)入研磨器中并加入液氮磨碎，加入1 mL TRIzol試劑，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理，樣本的體積不超過TRIzol試劑的10%。按照 TRIzol試劑說明書的方法提取組織總RNA，采用核酸蛋白檢測(cè)儀(Bio-Rad公司，型號(hào)：CFX96)檢測(cè)RNA濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的操作步驟將總RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后采用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒試劑盒檢測(cè)POU5F1B、OCT4的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)(見表1)?？偡磻?yīng)體系為25 μL，包括SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ12.5 μL、cDNA 2 μL、上下游引物各1 μL，加 Nase Free H2O 8.5 μL。每個(gè)樣本均設(shè)置 3個(gè)復(fù)孔。POU5F1B反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 30 s；變性95 ℃ 5 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。OCT4反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 30 s；變性95 ℃ 5 s，退火64 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GADPH作為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算POU5F1B mRNA、OCT4 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 目的基因PCR的引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0、Microsoft Office Excel、GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及繪圖。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組組織中POU5F1B mRNA和OCT4 mRNA表達(dá)水平的比較 觀察組組織中的POU5F1B mRNA、OCT4 mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組(均P<0.05)，見表2。

表2 兩組組織中POU5F1B mRNA和OCT4 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

2.2 兩組組織中OCT4蛋白表達(dá)情況的比較 免疫組織化學(xué)分析結(jié)果顯示，正常組、觀察組組織中OCT4蛋白的高表達(dá)率分別為38.0%(19/50)、61.3%(38/62)，觀察組組織中的OCT4蛋白高表達(dá)率高于對(duì)照組(χ2=6.007，P=0.014)。見表3和圖1。

表3 兩組OCT4蛋白表達(dá)情況的比較(n)

2.3 觀察組患者子宮內(nèi)膜腺癌組織OCT4蛋白表達(dá)情況與其臨床病理特征的關(guān)系 不同年齡、分化程度的子宮內(nèi)膜腺癌患者的OCT4蛋白表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；而臨床分期為Ⅱ～Ⅳ期、肌層浸潤(rùn)深度>1/2、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜腺癌患者的OCT4蛋白高表達(dá)率分別高于臨床分期為Ⅰ期、肌層浸潤(rùn)深度≤1/2、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(均P<0.05)。見表4。

表4 OCT4蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n(%)]

3 討 論

OCT4基因不僅可在胚胎發(fā)育過程中維持脂肪干細(xì)胞的多能性和自我更新性，還可在腫瘤干細(xì)胞的增殖分化過程中起到調(diào)控作用[17]。大量研究顯示OCT4表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)，如胃癌[18]、結(jié)直腸癌[19]。此外，OCT4在鑒別子宮內(nèi)膜與卵巢雙發(fā)惡性腫瘤的原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中有一定的價(jià)值[20]。本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜腺癌組織中的OCT4 mRNA表達(dá)水平和蛋白高表達(dá)率均高于增生期子宮內(nèi)膜組織(均P<0.05)，提示OCT4表達(dá)上調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌變。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，臨床分期為Ⅱ～Ⅳ期、肌層浸潤(rùn)深度>1/2、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜腺癌患者的OCT4蛋白高表達(dá)率分別高于臨床分期為Ⅰ期、肌層浸潤(rùn)深度≤1/2、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(均P<0.05)。這提示OCT4蛋白的表達(dá)情況可能與子宮內(nèi)膜腺癌的病情嚴(yán)重程度有關(guān)。由此推測(cè)，子宮內(nèi)膜癌組織中OCT4的異常表達(dá)可能促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的遷移、侵襲，進(jìn)而參與子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)展。此外，OCT4蛋白在Ⅱ～Ⅳ期子宮內(nèi)膜腺癌患者中的高表達(dá)率高于Ⅰ期子宮內(nèi)膜腺癌患者，提示OCT4在晚期子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)可能更高，雖然OCT4不能替代手術(shù)病理分期成為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是其或許可以作為評(píng)估晚期子宮內(nèi)膜癌的潛在分子標(biāo)志物。

假基因與其親本基因具有高度的同源性，但它們長(zhǎng)期以來一直被認(rèn)為是無功能的，并被認(rèn)為是隨機(jī)突變的[21]，經(jīng)常被用于作為校準(zhǔn)分子進(jìn)化中各種模型的參數(shù)，如中性突變率的估計(jì)。近年來有大量研究表明，假基因?qū)蚣暗鞍姿降恼{(diào)控作用不容忽視，例如磷酸酶-張力蛋白同源性基因假基因1是磷酸酶-張力同源性基因的假基因，磷酸酶-張力蛋白同源性基因假基因1可以通過某些微小RNA發(fā)揮作用，從而影響磷酸酶-張力同源性基因的表達(dá)，這在乳腺癌[22]、骨質(zhì)疏松癥[23]的發(fā)生和/或發(fā)展中發(fā)揮一定的作用。POU5F1B作為OCT4的假基因，對(duì)腫瘤的進(jìn)展既可以發(fā)揮正向調(diào)控作用，也可以發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用，例如，在宮頸癌細(xì)胞中下調(diào)假基因POU5F1B后，腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力均下降，親本基因的表達(dá)量也明顯降低[16]；POU5F1B在食管癌[13]、胃癌[14]、肝癌[24]中充當(dāng)原癌基因促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，而在急性髓性白血病中POU5F1B則是作為一種負(fù)向調(diào)節(jié)因子抑制腫瘤進(jìn)展[25]。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)POU5F1B mRNA在子宮內(nèi)膜腺癌組織中的表達(dá)情況，以初步了解POU5F1B在子宮內(nèi)膜腺癌中的作用。結(jié)果顯示POU5F1B mRNA在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)水平高于增生期子宮內(nèi)膜組織(均P<0.05)，提示POU5F1B有可能會(huì)促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和進(jìn)展，屬于促癌因子。關(guān)于假基因的作用機(jī)制，Hu等[26]研究發(fā)現(xiàn)，假基因可以在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控親本基因的表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄水平上，假基因可能會(huì)與基因的啟動(dòng)子相互作用，例如，由假基因產(chǎn)生的反義RNA可以與同源親本基因的正義鏈mRNA結(jié)合，從而抑制翻譯或形成能夠抑制親本基因表達(dá)的小干擾RNA序列，另外假基因還可以作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA，通過競(jìng)爭(zhēng)共享的miRNA來調(diào)節(jié)親本基因mRNA的表達(dá)水平。假基因POU5F1B可能就是通過調(diào)控miRNA的表達(dá)來調(diào)節(jié)OCT4的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展[27]。POU5F1B與OCT4基因在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)均升高，結(jié)合上述研究結(jié)果，推測(cè)POU5F1B異常表達(dá)可能與OCT4表達(dá)異常有關(guān)聯(lián)，假基因POU5F1B可能是通過調(diào)控OCT4的表達(dá)來參與子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生和發(fā)展，兩者共同參與子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生和發(fā)展，但是目前其具體的調(diào)控機(jī)制尚不明確。

綜上所述，OCT4及其假基因POU5F1B在子宮內(nèi)膜腺癌組織中高表達(dá)，并且OCT4蛋白的表達(dá)情況與子宮內(nèi)膜腺癌患者的臨床分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。假基因POU5F1B可能通過調(diào)控OCT4來影響子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生和發(fā)展，兩者或可作為診斷子宮內(nèi)膜癌的潛在分子標(biāo)志物，對(duì)評(píng)估子宮內(nèi)膜癌患者的病情有一定參考價(jià)值。但是兩者的具體調(diào)控機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究探討。