蘇銀霞 姚 華

(新疆醫(yī)科大學(xué)1 醫(yī)學(xué)工程技術(shù)學(xué)院，2 健康管理中心，新疆烏魯木齊市 830000)

【提要】 2型糖尿病(T2DM)是致殘、致死的主要疾病之一，其生物學(xué)發(fā)病早于臨床癥狀的出現(xiàn)。因此，近年來(lái)與T2DM早期診斷生物標(biāo)志物的相關(guān)研究明顯增多。這些生物標(biāo)志物對(duì)于制定個(gè)性化的干預(yù)措施以預(yù)防或延緩T2DM進(jìn)展有著重要的意義。表觀遺傳修飾是基因、環(huán)境和生活方式之間的紐帶，越來(lái)越多的證據(jù)表明，在T2DM的發(fā)病機(jī)制中DNA甲基化是最具特征、研究最為廣泛的表觀遺傳機(jī)制。本文對(duì)差異甲基化基因作為T2DM生物標(biāo)志物的全基因組關(guān)聯(lián)研究的進(jìn)展進(jìn)行綜述。

糖尿病是全球范圍內(nèi)致殘、致死的主要疾病之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2021年全球約有5.36億人罹患糖尿病，預(yù)計(jì)到2045年糖尿病患者數(shù)量將增至7.83億人[1]。90%以上的糖尿病患者為2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)，隨著肥胖和胰島素抵抗者數(shù)量的不斷攀升，T2DM的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)不斷增高[2-3]。T2DM早期階段可因毫無(wú)癥狀而被忽視，但在此期間微血管、大血管并發(fā)癥可能已經(jīng)發(fā)生[4]。因此，尋找可靠、敏感和容易獲得的T2DM生物標(biāo)志物有助于患者的早期診斷、治療和管理。胰島素靶器官的表觀遺傳變化可以反映在血液中，因此血液中的DNA甲基化可能與T2DM的發(fā)生相關(guān)，相關(guān)差異甲基化基因可以作為T2DM潛在的候選生物標(biāo)志物[4-5]。隨著人類基因組學(xué)相關(guān)技術(shù)的進(jìn)步，表觀遺傳學(xué)研究的重點(diǎn)已經(jīng)從候選基因的研究轉(zhuǎn)移至高通量、全基因組關(guān)聯(lián)研究(epigenome-wide association study，EWAS)。近年來(lái)，隨著微陣列芯片和甲基化測(cè)序等技術(shù)的廣泛應(yīng)用，人們對(duì)與T2DM相關(guān)的DNA甲基化有了更深入的了解。本文對(duì)T2DM相關(guān)差異甲基化基因的EWAS進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 基于微陣列芯片甲基化分析發(fā)現(xiàn)的T2DM相關(guān)差異甲基化基因

基于微陣列芯片的甲基化分析是通過(guò)比較DNA樣本在被甲基化敏感性限制內(nèi)切酶消化前后與該內(nèi)切酶的雜交強(qiáng)度的比值，來(lái)定量DNA樣本的甲基化水平[6-7]，是最早用于分析T2DM相關(guān)全基因組甲基化改變的EWAS技術(shù)[8]。Toperoff等[9]基于微陣列芯片技術(shù)比較了710例T2DM患者和459例健康人的外周血DNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn)兩者的差異甲基化位點(diǎn)在已證實(shí)的T2DM相關(guān)易感基因中富集，其中差異性最顯著的甲基化位點(diǎn)位于以下基因：溶質(zhì)載體家族30成員8(solute carrier family 30,member 8,SLC30A8)、轉(zhuǎn)錄因子7類似物2(transcription factor 7-like 2，TCF7L2)、脂肪質(zhì)量和肥胖相關(guān)(fat mass and obesity-associated，F(xiàn)TO)基因、鉀通道蛋白1(potassium voltage-gated channel subfamily Q member 1，KCNQ1)基因、甲狀腺腺瘤相關(guān)基因及鄰接鋅指基因1。隨后，他們通過(guò)亞硫酸氫鹽測(cè)序法進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO基因第一個(gè)內(nèi)含子CpG位點(diǎn)的低甲基化水平與T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。這一結(jié)果與一項(xiàng)基于耶路撒冷青年人群樣本采用焦磷酸測(cè)序法的隊(duì)列研究結(jié)論一致，其中FTO第一內(nèi)含子CpG位點(diǎn)呈低甲基化的青年后來(lái)發(fā)展為T2DM患者[10]。上述研究結(jié)果表明，呈低甲基化的特定基因位點(diǎn)可能是反映T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的早期標(biāo)志物之一。

2 基于微珠陣列芯片甲基化分析發(fā)現(xiàn)的T2DM相關(guān)差異甲基化基因

基于微珠陣列芯片的DNA甲基化分析，旨在為多個(gè)樣本中特定的胞嘧啶提供單堿基分辨率分析和定量評(píng)價(jià)[11]。Infinium芯片是由Illumina公司研發(fā)的人甲基化芯片，可檢測(cè)超過(guò)485 000個(gè)甲基化位點(diǎn)，覆蓋了96%的CpG島(即CpG的高聚集狀態(tài))及CpG島岸(即CpG島兩側(cè)的2 kb區(qū)域)[12]。Chambers等[13]使用人甲基化450 微珠陣列芯片分析了印度亞裔人和歐洲人外周全血中與T2DM相關(guān)的DNA甲基化，并對(duì)其進(jìn)行隨訪，在最終發(fā)展為T2DM的患者中發(fā)現(xiàn)了差異甲基化的CpG位點(diǎn)，這些位點(diǎn)存在于包括已知的T2DM相關(guān)基因，如TCF7L2、FTO和KCNQ1；此外，該研究還發(fā)現(xiàn)CpG硫氧還蛋白互作蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)、磷酸腺苷盒式亞家族G成員1(ATP-binding cassette subfamily G member 1，ABCG1)、磷酸乙醇胺/膽堿磷酸磷酸酶1(phosphoethanolamine/phosphocholine phosphatase 1，PHOSPHO1)、抑制細(xì)胞因子信號(hào)3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1(sterol regulatory element binding transcription factor 1,SREBF1)的相關(guān)位點(diǎn)甲基化與T2DM的發(fā)生相關(guān)，這5個(gè)基因相關(guān)位點(diǎn)的聯(lián)合甲基化評(píng)分是T2DM發(fā)生的危險(xiǎn)因素，且獨(dú)立于已證實(shí)的T2DM危險(xiǎn)因素，如T2DM家族史、體育活動(dòng)、體質(zhì)指數(shù)、腰臀比、糖化血紅蛋白水平、葡萄糖和胰島素濃度等。

隨后，Dayeh等[14]應(yīng)用Infinium芯片評(píng)估了Chambers等[13]確定的位點(diǎn)，證實(shí)了全血DNA中ABCG1、PHOSPHO1基因相關(guān)位點(diǎn)的甲基化水平與T2DM患病風(fēng)險(xiǎn)之間存在關(guān)聯(lián)，而SOCS3、SREBF1或TXNIP基因相關(guān)位點(diǎn)甲基化水平與T2DM無(wú)關(guān)，且ABCG1基因相關(guān)位點(diǎn)甲基化水平與HbA1c和空腹胰島素水平呈正相關(guān)，而PHOSPHO1基因相關(guān)位點(diǎn)甲基化水平與HDL水平呈正相關(guān)，其高甲基化水平與T2DM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)。ABCG1基因相關(guān)位點(diǎn)甲基化水平與空腹血糖和胰島素水平之間的關(guān)系，在另外3項(xiàng)應(yīng)用微珠陣列芯片進(jìn)行甲基化分析的研究[15-17]中也得到印證。此外，有研究表明，ABCG1基因編碼ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員1，該蛋白參與巨噬細(xì)胞的膽固醇和磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)，并可能調(diào)節(jié)其他類型細(xì)胞的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)[18]。由于膽固醇異常是T2DM發(fā)病的危險(xiǎn)因素，因此推測(cè)ABCG1基因的高甲基化水平可能使膽固醇循環(huán)濃度異常，從而影響T2DM的發(fā)病和進(jìn)展，以及T2DM心血管并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[18]。

Al Muftah等[19]應(yīng)用Infinium芯片研究123例阿拉伯受試者的全血DNA甲基化水平，并驗(yàn)證了8個(gè)與T2DM患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的基因CpG位點(diǎn)，其中包括上文提到的TXNIP基因，在T2DM患者中TXNIP基因甲基化呈低水平，與相關(guān)研究結(jié)果[20]相似。TXNIP的表達(dá)是由葡萄糖來(lái)誘導(dǎo)的，因此TXNIP基因呈低甲基化狀態(tài)說(shuō)明TXNIP基因過(guò)表達(dá)，已有相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，在糖尿病動(dòng)物和患者中TXNIP基因呈過(guò)表達(dá)[20-23]。此外，TXNIP還可通過(guò)抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子來(lái)調(diào)節(jié)血管生成的能力，從而參與T2DM相關(guān)血管并發(fā)癥的發(fā)展[23]。Al Muftah等[19]在阿拉伯人群中還發(fā)現(xiàn)在一個(gè)與T2DM相關(guān)的新位點(diǎn)，即DEAQ框肽1(RNA依賴ATP酶)基因的一個(gè)CpG位點(diǎn)，其甲基化水平與T2DM的患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。DEAQ框肽1(RNA依賴ATP酶)是編碼一種ATP依賴性RNA螺旋酶的基因。該酶在肝臟和肌肉中高度表達(dá)，但其在T2DM中的作用仍有待探索[24]。

Kulkarni等[17]應(yīng)用Infinium芯片分析850例墨西哥裔美國(guó)人外周血中446 356個(gè)位點(diǎn)的DNA甲基化情況，發(fā)現(xiàn)了51個(gè)與T2DM發(fā)病顯著相關(guān)的差異性甲基化CpG位點(diǎn)，其中19個(gè)與空腹血糖水平相關(guān)，24個(gè)與胰島素抵抗指數(shù)相關(guān)，而與T2DM相關(guān)性最強(qiáng)的5個(gè)CpG位點(diǎn)位于3個(gè)基因上，包括前述的TXNIP和ABCG1基因，以及不育結(jié)構(gòu)域12基因(sterile alpha motif domain containing 12,SAMD12)。SAMD12基因已被確定為乳腺癌基因的融合靶點(diǎn)[25]，但其在T2DM發(fā)病中的作用仍有待探索。

Jeon等[26]基于韓國(guó)人群，開(kāi)展了一項(xiàng)為期10年的T2DM隊(duì)列研究和一項(xiàng)非T2DM和T2DM的橫斷面研究，探討外周血全基因組DNA甲基化水平改變與T2DM患者葡萄糖穩(wěn)態(tài)的關(guān)系，隊(duì)列研究采用Illumina芯片分析，隨后在橫斷面研究中采用靶向焦磷酸測(cè)序法加以驗(yàn)證；結(jié)果顯示，在外周全血和胰島細(xì)胞中均找到了382個(gè)差異甲基化位點(diǎn)，其中有3個(gè)位點(diǎn)與T2DM相關(guān)，這些位點(diǎn)由Musashi RNA結(jié)合蛋白2基因(Musashi RNA-binding protein 2，MSI2)和CXXC型鋅指蛋白4基因編碼，MSI2編碼的位點(diǎn)位于chr17:55484635區(qū)域，該位點(diǎn)與T2DM特征性指標(biāo)胰島素敏感指數(shù)和胰島素抵抗指數(shù)的相關(guān)性最強(qiáng)。而早在2011年，Szabat等[27]即發(fā)現(xiàn)脂肪毒性和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可上調(diào)MSI2的表達(dá)，而小鼠胰腺β細(xì)胞中MSI2的表達(dá)變化可顯著改變胰島素的表達(dá)，提示MSI2可能參與T2DM的發(fā)病，Jeon等[26]的研究結(jié)果進(jìn)一步印證該結(jié)論。

3 基于免疫沉淀反應(yīng)甲基化測(cè)序發(fā)現(xiàn)的T2DM相關(guān)差異甲基化基因

DNA甲基化免疫沉淀測(cè)序法是一種通用的、無(wú)偏倚的檢測(cè)DNA甲基化的方法，其使用一種可特異性識(shí)別5-甲基胞嘧啶的單克隆抗體來(lái)檢測(cè)DNA甲基化的富集情況，然后通過(guò)大規(guī)模測(cè)序分析免疫沉淀片段[28]。由于這種方法不需要進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換，且能夠區(qū)分5-甲基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶即5-甲基胞嘧啶的氧化產(chǎn)物，因此非常高效[28]。Liu等[29]采用了DNA甲基化免疫測(cè)序法研究ABCG1基因cg06500161位點(diǎn)甲基化在他汀類藥物增加T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)方面的作用，發(fā)現(xiàn)ABCG1基因cg06500161位點(diǎn)甲基化水平與T2DM相關(guān)指標(biāo)(空腹血糖和胰島素)呈正相關(guān)。其采用兩步孟德?tīng)栯S機(jī)化法證實(shí)了他汀類藥物對(duì)T2DM患病風(fēng)險(xiǎn)的影響是通過(guò)表觀遺傳機(jī)制實(shí)現(xiàn)的，特別是ABCG1基因cg06500161位點(diǎn)甲基化水平的改變?cè)黾恿薚2DM風(fēng)險(xiǎn)，并發(fā)現(xiàn)ABCG1基因甲基化位點(diǎn)cg06500161是他汀類藥物與T2DM風(fēng)險(xiǎn)之間聯(lián)系的媒介，為T2DM的預(yù)測(cè)和預(yù)防策略提供了新的思路。此外， Qie等[30]在中國(guó)洛陽(yáng)市20 194例受試者中開(kāi)展了為期6年的巢式隊(duì)列研究，最終匹配了286對(duì)非T2DM與T2DM受試者，通過(guò)DNA甲基化免疫沉淀測(cè)序法分析了ABCG1基因甲基化及其動(dòng)態(tài)變化與T2DM發(fā)病的關(guān)系；結(jié)果顯示，CpG13和CpG14的甲基化水平及CpG15位點(diǎn)的甲基化增益率與T2DM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)。由此可見(jiàn)，ABCG1基因甲基化及其動(dòng)態(tài)變化可用于預(yù)測(cè)T2DM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，有助于早期干預(yù)方案的制定。

Yuan等[31]采用高通量全基因組DNA甲基化免疫沉淀測(cè)序法檢測(cè)了27對(duì)同卵雙胞胎的全血表觀DNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn) 與T2DM相關(guān)性最高的甲基化位點(diǎn)是黏液相關(guān)淋巴組織淋巴瘤易位蛋白1(mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation protein 1,MALT1)基因的兩個(gè)部分區(qū)域重合的甲基化位點(diǎn)(chr18:56336501-56337000和chr18:56336751-56337250)，兩者均位于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的2 kb區(qū)域。MALT1是一種信號(hào)蛋白，通過(guò)核因子κB通路在抗原受體介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞活化中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并在B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的發(fā)育和功能、能量和胰島素的代謝中發(fā)揮重要作用[31]。核因子κB 在T2DM相關(guān)慢性炎癥中起重要作用，而MALT1的高甲基化和轉(zhuǎn)錄是否通過(guò)抑制核因子κB信號(hào)進(jìn)而導(dǎo)致炎癥，還有待進(jìn)一步探索[32]。

Matsha等[33]采用DNA甲基化免疫沉淀測(cè)序法對(duì)南非少數(shù)民族混合血統(tǒng)婦女外周血中的DNA甲基化進(jìn)行分析，包括3例T2DM患者、3例糖尿病前期患者和3例正常血糖者，其在T2DM患者與正常血糖者之間發(fā)現(xiàn)1 415個(gè)差異甲基化位點(diǎn)(均位于啟動(dòng)子區(qū)域)，其中超過(guò)80%的位點(diǎn)呈高甲基化，包括B細(xì)胞淋巴瘤3 、白細(xì)胞介素23亞單位α、F2R樣胰蛋白酶受體1、S100鈣結(jié)合蛋白A12、TNF受體超家族成員10b、 NIMA相關(guān)激酶6、環(huán)指蛋白31、溶質(zhì)載體家族成員35B2、白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶1結(jié)合蛋白1；根據(jù)染色體位置分組時(shí)發(fā)現(xiàn)，與正常血糖者和糖尿病前期患者相比，T2DM患者的3、6、11、13和17號(hào)染色體有更多的高甲基化區(qū)域，而1號(hào)染色體中有更多的低甲基化區(qū)域，其中這些高甲基化區(qū)域與T2DM相關(guān)通路相關(guān)，包括細(xì)胞表面信號(hào)通路、葡萄糖運(yùn)輸信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路、胰腺發(fā)育等，而低甲基化區(qū)域則與炎性核因子κB級(jí)聯(lián)、多不飽和ω-6脂肪酸、亞油酸及花生四烯酸等代謝途徑有關(guān)。有趣的是，過(guò)量攝入多不飽和脂肪酸，會(huì)導(dǎo)致炎癥增加，并導(dǎo)致包括肥胖和T2DM等慢性疾病的發(fā)生[34]。重要的是，Matsha等[33]還發(fā)現(xiàn)，正常血糖者與糖尿病前期患者之間的差異低甲基化區(qū)域與亞油酸和花生四烯酸代謝途徑相關(guān)，這表明這些區(qū)域的甲基化改變可能發(fā)生在T2DM發(fā)病之前。

4 小 結(jié)

綜上，基于EWAS技術(shù)篩選得到的TCF7L2、KCNQ1、ABCG1、TXNIP、PHOSPHO1、SREBF1、SLC30A8和FTO等基因，其相關(guān)位點(diǎn)的甲基化水平變化可能與T2DM有相關(guān)性，且其與T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性獨(dú)立于生活方式和環(huán)境因素之外，或可作為T2DM發(fā)病的潛在預(yù)測(cè)標(biāo)志物。以上基因相關(guān)位點(diǎn)的甲基化水平在T2DM的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，包括能量攝入和支出(FTO基因)、脂肪生成和糖酵解(SREBF1基因)、葡萄糖穩(wěn)態(tài)和碳水化合物代謝(TXNIP、TCF7L2基因)、脂質(zhì)運(yùn)輸(ABCG1基因)、胰腺胰島素分泌(SLC30A8、KCNQ1基因)和心血管相關(guān)并發(fā)癥(PHOSPHO1基因)。但上述結(jié)論仍需要論證強(qiáng)度更高的大樣本、前瞻性研究進(jìn)一步驗(yàn)證，未來(lái)應(yīng)開(kāi)展二代測(cè)序研究和相關(guān)縱向隊(duì)列研究以探尋與T2DM相關(guān)性更強(qiáng)的、更靈敏的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)標(biāo)志物。