吳 婧，范菠菠，張學(xué)峰，宋金微, 房永雨，于 卓，閆秀秀，趙 彥，馬艷紅*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

轉(zhuǎn)錄因子(Transcription Factors，TFs)在植物中是一種最重要的一類調(diào)節(jié)基因，可與真核生物基因的啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性結(jié)合的DNA結(jié)合蛋白，通過(guò)與其他蛋白相互作用，激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄[1]。根據(jù)DNA結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)，將轉(zhuǎn)錄因子分為若干個(gè)家族，如WRKY，AP2/EREBP，NAC，MYB，BZIP，其中AP2/EREBP是植物中分布廣泛的一類轉(zhuǎn)錄因子[2]。根據(jù)AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域的不同，AP2/ERFBP家族被進(jìn)一步分為AP2，RAV，DREB，ERF和Soloist五個(gè)亞族[3]。ERF是AP2/ERFBP家族中最大的一類亞族[4]。ERF轉(zhuǎn)錄因子參與植物多種生物學(xué)過(guò)程，與非生物脅迫密切相關(guān)，如干旱[5-6]、低溫[7]、高鹽[8]、病害[9]。ERF轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)參與乙烯、脫落酸、茉莉酸和水楊酸等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)控下游基因的表達(dá)，從而綜合提高植物的抗逆性[10]。到目前為止，在PlantTFDB數(shù)據(jù)庫(kù)中，共收錄了166種作物的ERF轉(zhuǎn)錄因子，共有21 129個(gè)。

干旱是限制植物生長(zhǎng)的重要因素，會(huì)誘導(dǎo)植物發(fā)生滲透失衡等不良反應(yīng)，妨礙植物各階段的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝，進(jìn)而影響農(nóng)作物的產(chǎn)量[11]。大量研究表明，ERF轉(zhuǎn)錄因子參與干旱脅迫，如擬南芥(Arabidopsisthaliana)DREB2A基因的表達(dá)受脫水誘導(dǎo)引起植株矮化[12]。大豆(Glycinemax)在模擬干旱條件下，轉(zhuǎn)基因煙草GmERF3[13]過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致游離脯氨酸含量多于野生型煙草，可提高煙草的抗旱性，大豆GmERFb對(duì)干旱產(chǎn)生響應(yīng)[14]。小麥野生近緣植物纖毛鵝觀草(Roegneriaciliaris(Trin.)Nevski)中的RcDREB1基因?qū)Ω珊?、高鹽和重金屬非生物脅迫產(chǎn)生應(yīng)答[15]。小麥(Triticumaestivum)TaERF1在干旱脅迫和外源ABA、乙烯和水楊酸的誘導(dǎo)條件下，TaERF1過(guò)表達(dá)可激活與逆境相關(guān)的基因[16]。粳稻(Oryzasativa)中第Ⅶ亞族的ERF轉(zhuǎn)錄因子OsLG3通過(guò)誘導(dǎo)活性氧可提高旱稻的抗旱能力[17]，OsERF3基因其含有EAR抑制結(jié)構(gòu)域基序，對(duì)干旱脅迫起負(fù)調(diào)控作用[18]。

蒙古冰草(AgropyronmongolicumKeng)原名沙蘆草，抗逆性強(qiáng)，是優(yōu)質(zhì)的多年生二倍體禾本科牧草[19]。迄今，體內(nèi)的多種抗逆基因尚未被發(fā)現(xiàn)，作為小麥族牧草，研究蒙古冰草的抗逆基因?qū)δ敛菁胞滎惖倪z傳改良具有重要意義。ERF參與植物生長(zhǎng)和逆境脅迫響應(yīng)，但蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子的研究尚屬空白。本研究基于干旱脅迫下蒙古冰草的RNA-Seq，旨在篩選可能與抗旱相關(guān)的ERF轉(zhuǎn)錄因子，為下一步開展蒙古冰草抗旱基因功能解析奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

本試驗(yàn)材料為蒙古冰草(A.mongolicumKeng)，種子采自于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)薩拉齊牧草繁種基地。挑選顆粒飽滿的種子于室內(nèi)培養(yǎng)箱(BIC-300)水培生長(zhǎng)，溫度為(24±1)℃、光周期為16 h，在三葉一心時(shí)期用含25%的PEG-6000的1/5 Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行模擬干旱處理，同時(shí)設(shè)置對(duì)照處理(CK)，之后在干旱12 h，24 h，48 h，3 d，5 d，7 d及復(fù)水24 h取樣，每個(gè)處理時(shí)期3次重復(fù)，提取total RNA，委托杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序[20]。

1.2 蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子篩選

從干旱脅迫下蒙古冰草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中(NCBI Bioproject accession number PRJNA742257，SRA accession number SUB9924544 and SUB9990857)，根據(jù)功能注釋初步篩選出41個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子，利用notepad++軟件找到核苷酸序列，用NCBI中的ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)閱讀框?qū)⒑塑账嵝蛄蟹g成氨基酸序列，使用PlantTFDB中的Prediction(http://planttfdb.gao-lab.org/prediction.php)進(jìn)行分析，篩選出具有ERF結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，然后用該網(wǎng)站中的BLAST(http://planttfdb.gao-lab.org/blast.php)與所有的物種進(jìn)行同源比對(duì)，除去與其他物種無(wú)同源性的ERF蛋白序列。

1.3 蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子理化性質(zhì)分析及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位

利用在線分析軟件Expasy中的ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)[21]對(duì)篩選出的蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸數(shù)目、相對(duì)分子質(zhì)量、PI值、脂肪指數(shù)、親疏水性的理化性質(zhì)進(jìn)行分析；用Cell-PLOC 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)[22]對(duì)蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位預(yù)測(cè)。

1.4 蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子保守基序及序列比對(duì)

用在線分析軟件The MEME Suite中的MEME(https://meme-suite.org/meme/tools/meme)[23]對(duì)篩選出來(lái)的蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子的保守基序進(jìn)行分析；使用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，然后用WebLogo 3(http://weblogo.threeplusone.com/)[24]對(duì)蒙古冰草ERF保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.5 蒙古冰草ERF進(jìn)化關(guān)系分析

通過(guò)NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和UniProt(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)、PlantTFDB(http://planttfdb.gao-lab.org/index.php)的ERF數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出具有抗旱功能的13條擬南芥(Arabidopsisthaliana)、6條山羊草(Aegilopstauschii)、9條二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、4條大麥(Humuluslupulus)、5條秈稻(Oryzasativasubsp.indica)、8條粳稻(Oryzasativasubsp.japonica)、4條小麥(Triticumaestivum)的ERF氨基酸序列，并與蒙古冰草的ERF轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列用MEGA7.0[25]的Muscle進(jìn)行多序列比對(duì)，用相鄰連接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。設(shè)置校驗(yàn)參數(shù)Boostrap為1000，其他參數(shù)均設(shè)為默認(rèn)值。用EvolView(https://evolgenius.info//evolview-v2/#mytrees/1/2)[26]將進(jìn)化樹進(jìn)行美化。

表1 已報(bào)道抗旱相關(guān)ERF轉(zhuǎn)錄因子

1.6 蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page= npsa_ sopma.html)對(duì)蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，并用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)在線軟件的同源建模法對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

1.7 不同干旱處理蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子基因差異表達(dá)分析

蒙古冰草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)使用TPM(Transcripts per million)對(duì)樣本表達(dá)量進(jìn)行歸一化處理，利用DESeq2軟件分析不同處理間的差異基因。用軟件Heml對(duì)蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子的共表達(dá)模塊與性狀矩陣進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，并用Color Dialog對(duì)其進(jìn)行顏色處理，分析其在不同干旱處理下的差異表達(dá)情況。

1.8 蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子qRT-PCR

使用primer premier 5將篩選出的可能具有抗旱功能的蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子(AmERF053,AmERF1B,AmERF4-1,AmERF4-2)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，以U6作為內(nèi)參基因，(引物序列見(jiàn)表2)，然后將引物委托上海生工(Sangon，上海)進(jìn)行序列合成。

表2 蒙古冰草抗旱相關(guān)ERF基因qRT-PCR引物序列

使用Trizol法提取蒙古冰草CK，干旱處理1 d,3 d,5 d,7 d及復(fù)水24 h的總RNA，使用FastKing RT Kit(with gDNase)試劑盒將蒙古冰草處理組及對(duì)照組的Total RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用MonAmp SYBR Green qPCR Mix試劑盒(MQ10201S)進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)，每個(gè)處理4次生物學(xué)重復(fù)。qRT-PCR總反應(yīng)體系為20.0 μL，其中上下游引物(10 μM)各0.4 μL,cDNA模板1.2 μL,Nuclease-Free Water 8 μL,MonAmp SYBR Green qPCR Mix試劑10 μL。反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性95℃,30 s，變性95℃,10 s，退火61℃,10 s，延伸72℃,30 s，循環(huán)數(shù)為40，在FTC-3000P上運(yùn)行程序。按照2-ΔΔCT法[35]計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，并使用SPSS 26.0軟件對(duì)其差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒙古冰草ERF基因篩選

從蒙古冰草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中的41 793條Unigenes中篩選出41個(gè)ERF基因，通過(guò)ORF和結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析，獲得具有ERF結(jié)構(gòu)域的25個(gè)基因。BLAST序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，有18個(gè)與其他物種具有親緣關(guān)系，其中DN17657_c2_g1,DN22794_c0_g6,DN22189_c0_g1與山羊草(Aegilopstauschii)親緣關(guān)系最近，相似度在66%～84%之間；DN20439_c0_g14,DN22390_c0_g1,DN25557_c0_g6,DN23100_c2_g10,DN22189_c1_g2,DN19595_c1_g1與小麥(Triticumaestivum)親緣關(guān)系最近，相似度在61%～78%；DN26859_c0_g2,DN25557_c0_g4,DN25557_c0_g1,DN26859_c0_g7,DN22794_c0_g2與大麥(Hordeumvulgare)親緣關(guān)系最近，相似度在55%～70%之間；DN19955_c0_g1與二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)親緣關(guān)系最近，相似度為50%；DN26921_c0_g2與擬南芥(Arabidopsisthaliana)親緣關(guān)系最近，相似度為79%，表明從蒙古冰草的ERF轉(zhuǎn)錄因子基因結(jié)構(gòu)具有保守性，與山羊草(A.tauschii)、小麥(T.aestivum)、大麥(H.vulgare)同源性較高。

2.2 蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位分析

18個(gè)蒙古冰草的ERF轉(zhuǎn)錄因子氨基酸數(shù)目在70 aa～404 aa之間，相對(duì)分子質(zhì)量介于7 447.54～43 654.9之間；理論等電點(diǎn)(PI)在4.53～11.10之間，有11個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子理論等電點(diǎn)小于7、呈現(xiàn)酸性，有7個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子大于7、呈現(xiàn)堿性；脂肪族指數(shù)最小為47.61，最大為75.71；有16個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子總平均親水性小于0，為親水性蛋白，僅有兩個(gè)總平均親水性大于零，為疏水性蛋白(表3)。

蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子基因亞細(xì)胞定位分析，有13個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子定位在細(xì)胞核中，AmERF071,AmERF014定位在細(xì)胞質(zhì)中，AmERF008存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，AmERF3-2定位在細(xì)胞膜上，AmERF110-2定位在細(xì)胞外，表明ERF轉(zhuǎn)錄因子基因主要在細(xì)胞核中發(fā)揮功能(表3)，少數(shù)在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞外發(fā)揮功能。

表3 蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位

2.3 蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子基序分析

蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子保守基序分析發(fā)現(xiàn)7種motif(圖1)，有16個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列出現(xiàn)保守的motif，AmERF061-1和AmERF110-2轉(zhuǎn)錄因子不含有motif。在含有motif的序列中，有15個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子含有motif2、14個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子含有motif1、13個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子含有motif3、6個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子含有motif6、2個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子含有motif7、2個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子含有motif5，同時(shí)含有基序motif1，motif2，motif3的序列有12個(gè)，出現(xiàn)的次數(shù)最多。motif1特征基序的(x)GRR(x)EI、motif2基序(x)RWLG(x)AA(x)D和motif3基序(x)G(x)N(x)構(gòu)成AP2的結(jié)構(gòu)域特征序列，且motif1,motif2,motif3通常以串聯(lián)形式在一起，所以推測(cè)motif1,motif2,motif3基序?yàn)槊晒疟軪RF轉(zhuǎn)錄因子的保守基序(圖2)。

圖1 蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子基序分析

圖2 蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子的保守基序

通過(guò)DNAMAN軟件對(duì)18個(gè)蒙古冰草ERF基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)AmERF061-1,AmERF061-2,AmERF1,AmERF014,AmERF110-2不具有AP2結(jié)構(gòu)域，AmERF061-1和AmERF061-2氨基酸序列發(fā)生變化，AmERF1的C端發(fā)生缺失，AmERF014的N端發(fā)生缺失，AmERF110-2的N端發(fā)生變化、而C端發(fā)生缺失(圖3)。用WebLogo3分析18個(gè)蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子的保守性，其存在AP2結(jié)構(gòu)域特征序列(x)GRR(x)EI(x)RWLG(x)AA(x)D(x)G(x)N(x)，在第二個(gè)β-折疊中第14位氨基酸是丙氨酸(A)，19位是天冬氨酸(D)(圖3,圖4)。

圖3 蒙古冰草ERF家族基因的氨基酸序列比對(duì)

圖4 蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的保守結(jié)構(gòu)域

2.4 蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化關(guān)系分析

本研究將蒙古冰草ERF與玉米(Zeamays)ZmDREB160，大豆GmERF4,GmERF6，馬鈴薯(Solanumtuberosum)StERF1，小麥TaERF1等具有抗旱功能的轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果將ERF轉(zhuǎn)錄因子劃分為10個(gè)亞族，其中有5個(gè)亞族不含有蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子。第Ⅰ亞族和第Ⅴ亞族分別有1個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子，AmERF008劃分在第Ⅰ亞族，AmERF014劃分在第Ⅴ亞族；第Ⅱ亞族中有3個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子，分別是AmERF071,AmERF061-1,AmERF061-2,AmERF053和AmERF060兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子劃分在第Ⅵ亞族，其中AmERF053與擬南芥AT2G20880.1(AtERF53)聚為一個(gè)分支；第Ⅲ亞族是最大的亞族，共有10個(gè)蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子在此亞族中，其中AmERF3-1，AmERF4-3,AmERF1聚在一個(gè)分支，AmERF3-2,AmERF114,AmERF110,AmERF109聚在一個(gè)分支上，AmERF4-1與大豆GmERF6、馬鈴薯StERF1、擬南芥AtERF9在一個(gè)小分支，AmERF4-2與大豆GmERF4聚在一個(gè)小分支，AmERF1B與擬南芥AtERF11在一個(gè)分支。根據(jù)MEGA分族及各族的成員推測(cè)蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子的功能，StERF1,AtERF9,GmERF6,GmERF4,AtERF11,AtERF53這些轉(zhuǎn)錄因子均被證明與干旱脅迫相關(guān)，根據(jù)以上結(jié)果推測(cè)蒙古冰草AmERF4-1,AmERF4-2,AmERF1B,AmERF053也具有相似的功能，可能參與干旱脅迫響應(yīng)。

2.5 蒙古冰草ERF基因不同干旱處理表達(dá)模式分析

蒙古冰草在干旱處理 12 h,24 h,48 h,3 d,5 d,7 d、復(fù)水 24 h及對(duì)照(CK)情況下，其中15個(gè)ERF基因表達(dá)量呈顯著差異表達(dá)(圖6)?；虮磉_(dá)量的大小與數(shù)值有關(guān)，數(shù)值越大表達(dá)量越大，表達(dá)量越大越接近紅色，表達(dá)量越小越接近藍(lán)色。6個(gè)ERF基因表達(dá)量較高，其中AmERF3-1基因表達(dá)量最高。AmERF110和AmERF061-1兩個(gè)基因有表達(dá)，但是表達(dá)量較低在0～2之間，視為無(wú)效表達(dá)。隨著干旱處理時(shí)間延長(zhǎng)，AmERF053,AmERF4-1,AmERF3-1,AmERF3-2,AmERF109和AmERF114共6個(gè)基因表達(dá)量呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，AmERF1B,AmERF071,AmERF110-2,AmERF060共4個(gè)基因的表達(dá)量隨著干旱處理的進(jìn)程呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，復(fù)水24h上調(diào)，隨著干旱處理的進(jìn)程AmERF1基因表達(dá)量與CK相比較呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，AmERF4-2和AmERF061-2基因表達(dá)量隨著干旱處理過(guò)程中先升高后降低再升高。雖然都屬于ERF家族，但ERF轉(zhuǎn)錄因子在不同干旱處理下表達(dá)模式存在差異。

圖6 蒙古冰草ERF基因不同干旱表達(dá)模式

2.6 蒙古冰草抗旱相關(guān)的ERF轉(zhuǎn)錄因子二、三級(jí)結(jié)構(gòu)

對(duì)蒙古冰草AmERF053,AmERF1B,AmERF4-1和AmERF4-2轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，主要以無(wú)規(guī)則卷曲為主，分別占59.03%,51.85%,61.32%和51.05%，其次是α-螺旋，分別占26.65%,34.68%,22.22%和32.49%，延伸鏈分別占9.69%,9.43%,12.35%和10.97%，β-折疊分別占4.63%，4.04%,4.12%和5.49%，表明4個(gè)蒙古冰草抗旱相關(guān)的ERF轉(zhuǎn)錄因子的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋為主。

根據(jù)SWISS-MODEL的同源建模法對(duì)AmERF053,AmERF1B,AmERF4-1和AmERF4-2四個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子的三級(jí)結(jié)構(gòu)建模結(jié)果顯示(圖8)，4個(gè)ERF三級(jí)結(jié)構(gòu)都與擬南芥的ERF轉(zhuǎn)錄因子相匹配，含有AP2結(jié)構(gòu)域，符合ERF結(jié)構(gòu)域特征，三級(jí)結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)相吻合，且有1個(gè)α-螺旋，3個(gè)β-折疊的空間結(jié)構(gòu)。

圖7 蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖8 蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子三級(jí)結(jié)構(gòu)

2.7 蒙古冰草ERF基因的表達(dá)分析

對(duì)篩選出的與抗旱相關(guān)的蒙古冰草4個(gè)ERF基因進(jìn)行RT-qPCR分析，4個(gè)ERF基因?qū)Ω珊得{迫響應(yīng)程度不同，AmERF053,AmERF1B和AmERF4-1呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)；AmERF053和AmERF1B兩個(gè)基因在5 d表達(dá)量最高，AmERF4-1在3 d表達(dá)量最高；AmERF4-2各個(gè)處理組的表達(dá)量均低于CK，呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。在0.05水平上，4個(gè)ERF基因的處理組表達(dá)量均與CK的表達(dá)量存在顯著性差異，說(shuō)明蒙古冰草ERF家族基因參與蒙古冰草對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)。

圖9 干旱脅迫下蒙古冰草抗旱相關(guān)的ERF基因相對(duì)表達(dá)量

3 討論

為篩選蒙古冰草抗旱相關(guān)的ERF轉(zhuǎn)錄因子，本研究基于生物信息分析，篩選出25個(gè)具有ERF結(jié)構(gòu)域的基因，通過(guò)BLAST序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，18個(gè)序列與其他物種具有親緣關(guān)系，7個(gè)序列與其他物種無(wú)親緣關(guān)系，總共篩選出16個(gè)具有AP2保守結(jié)構(gòu)域的ERF轉(zhuǎn)錄因子。ERFs一般含有1個(gè)AP2保守結(jié)構(gòu)域，AP2結(jié)構(gòu)域由60～70個(gè)氨基酸殘基組成[36]，蒙古冰草ERF的AP2結(jié)構(gòu)域N端含有3個(gè)β-折疊片段，C端有1個(gè)α-螺旋片段，在N端含有YRG保守元件，呈堿性，C端含RAYD保守元件，這可能與其他蛋白互作有關(guān)[37]，蒙古冰草ERF的AP2序列與大豆[38]、油橄欖(Oleaeuropaea)[39]ERF家族氨基酸序列一致。在同一基因家族中，擁有共同的保守基序可能發(fā)揮相似的功能[40]。在蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子保守基序分析中，共出現(xiàn)了7個(gè)motif，其中motif1,motif2和motif3出現(xiàn)次數(shù)最多，通常以串聯(lián)形式出現(xiàn)，是其共同含有的保守基序，motif1含有YRG保守原件，motif2含有RAYD保守原件，與桃、蘋果、擬南芥ERF轉(zhuǎn)錄因子家族具有相似的結(jié)構(gòu)[41-43]。

通過(guò)對(duì)蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子的理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)大多數(shù)為親水性蛋白，與馬鈴薯StERF109的ERF蛋白親疏水性保持相似[44]。亞細(xì)胞定位表明蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子大多數(shù)在細(xì)胞核中發(fā)揮功能，少數(shù)在細(xì)胞質(zhì)和其他部位發(fā)揮功能，和木薯(Manihotesculenta)[45]、小麥[46]亞細(xì)胞定位情況相似。根據(jù)4個(gè)ERF蒙古冰草轉(zhuǎn)錄因子的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)果顯示，ERF主要以無(wú)規(guī)則卷曲為主，α-螺旋次之，與小黑楊(Populussimonii×P.nigra)ERF723[47]的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)相似，其三級(jí)結(jié)構(gòu)有些差異，可能其所處亞族不同，這些差異與α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲的長(zhǎng)度有關(guān)，這些差異會(huì)使其發(fā)揮不同的功能[48]。

ERF轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育和抵御外界脅迫發(fā)揮著不同的作用[49]。蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子和具有抗旱功能的ERF轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析，擬南芥AtERF9[33],AtERF11[34],AtERF53[32]與GCC box或下游基因啟動(dòng)子的脫水反應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)控干旱應(yīng)答基因的表達(dá)從而提高植株的抗旱能力。將大豆GmERF6[29]基因轉(zhuǎn)入到擬南芥中，經(jīng)過(guò)斷水處理與野生型植株相比較，轉(zhuǎn)基因植株的種子發(fā)芽率高且正常生長(zhǎng)、開花，在干旱脅迫下，GmERF4[28]在干旱處理后24 h內(nèi)基因表達(dá)量顯著增加。StERF1在干旱處理后SDR(短鏈脫氫酶)、游離脯氨酸、丙二醛(MDA)等含量明顯增加，轉(zhuǎn)基因植株的株高、莖高、根長(zhǎng)、鮮重等指標(biāo)都高于未轉(zhuǎn)基因的植株，過(guò)量表達(dá)的StERF1可提高馬鈴薯的抗旱能力[30]。這些均被證明與干旱脅迫響應(yīng)有關(guān)，且與蒙古冰草有較高的同源性，進(jìn)而推測(cè)蒙古冰草AmERF4-1,AmERF4-2,AmERF1B,AmERF053也具有相似的功能，可能參與干旱脅迫響應(yīng)。

經(jīng)過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證4個(gè)蒙古冰草ERF基因處理組的表達(dá)量與CK組相比較存在顯著性差異，既有正向調(diào)控又有負(fù)向調(diào)控，AmERF053,AmERF1B和AmERF4-1呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，與趙夢(mèng)雨研究結(jié)果一致，其通過(guò)qRT-PCR分析結(jié)果表明，苦蕎(Fagopyrumtataricum)FtDREB6轉(zhuǎn)錄因子在干旱脅迫下起正調(diào)控作用[50]，趙彥對(duì)蒙古冰草MwDREB3基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR，結(jié)果分析表明MwDREB3在干旱脅迫下表達(dá)量上調(diào)[51]。AmERF4-2呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，目前，關(guān)于ERF基因下調(diào)表達(dá)的研究較少較少，從水稻中發(fā)現(xiàn)OsERF109基因通過(guò)抑制乙烯的釋放從而對(duì)水稻的抗旱性起負(fù)調(diào)控作用[52]。

4 結(jié)論

本研究基于蒙古冰草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)篩選出41個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子，其中18個(gè)具有ERF結(jié)構(gòu)域特征，通過(guò)對(duì)其保守基序、保守結(jié)構(gòu)域、進(jìn)化關(guān)系及表達(dá)模式分析，獲得4個(gè)可能具有抗旱功能的蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子，其二、三結(jié)構(gòu)主要以無(wú)規(guī)則卷曲為主。對(duì)4個(gè)ERF基因進(jìn)行差異表達(dá)分析，qRT-PCR結(jié)果分析表明AmERF053,AmERF1B和AmERF4-1起正調(diào)控作用，AmERF4-2呈現(xiàn)負(fù)調(diào)控作用。