丁文歡， 李 潔， 張雪佳， 樊思恩， 徐海燕*

(1.新疆醫(yī)科大學中心實驗室，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥學部，新疆 烏魯木齊 830054；3.中國藥科大學中藥學院，江蘇 南京 211198；4.新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院，新疆 烏魯木齊 830054)

紫草被譽為“涼血之圣藥”，活性成分為紫草素及其衍生物，有抗炎、抗菌、抗病毒等作用[1-7]，為紫草科植物新疆紫草Arnebiaeuchroma(Royle)Johnst.、內(nèi)蒙紫草ArnebiaguttataBunge的干燥根[8]，其中后者即《中國植物志》記載的黃花軟紫草[9]。紫草中萘醌類成分含量差異較大，導致藥材品質(zhì)參差不齊[10-12]，有學者建立了新疆紫草指紋圖譜[13-16]，但其所用藥材大多源于市售，會存在基源不清的可能，而且未與黃花軟紫草進行比較。

課題組前期對野外采集的新疆紫草、黃花軟紫草中萘醌類成分進行含量測定[17-19]，發(fā)現(xiàn)存在較大差異，并且不同產(chǎn)地同一藥材亦然。本實驗建立新疆紫草、黃花軟紫草HPLC指紋圖譜，并進行化學模式識別分析，以期為兩者質(zhì)量綜合評價標準提供科學依據(jù)。

1 材料

MS105DU型電子天平(十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)。β,β′-二甲基丙烯酰紫草素(批號15102821)、左旋紫草素(批號15102721)、去氧紫草素(批號15062422)、乙酰紫草素對照品(批號15120431)均由上海同田生物技術(shù)有限公司提供；β-乙酰氧基異戊酰紫草素對照品(批號P05M7F14235)由上海源葉生物技術(shù)有限公司提供；異丁酰紫草素對照品(批號wkq16101302)由四川省維克奇生物科技有限公司提供；(2-甲基正丁?；?紫草素對照品(批號AV51-LDQR)由日本化成工業(yè)株式會社提供。新疆紫草、黃花軟紫草采自新疆，經(jīng)新疆醫(yī)科大學中藥資源教研室徐海燕教授鑒定為正品，具體信息見表1。乙腈、甲酸為色譜純；石油醚(60～90 ℃)為分析純；水為超純水(由艾科超純水機制備)。

表1 樣品信息

2 方法

2.1 對照品溶液制備 分別精密稱取左旋紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、去氧紫草素、異丁酰紫草素、β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧、(2-甲基正丁?；?紫草素對照品2、10、10、1、10、5、25 mg，置于25 mL量瓶中，乙腈定容至刻度，即得。取除(2-甲基正丁?；?紫草素以外的6種對照品溶液適量，置于同一10 mL量瓶中混合；另取(2-甲基正丁?；?紫草素對照品溶液3.5 mL，置于10 mL量瓶中。

2.2 供試品溶液制備 藥材粉碎后過4號篩，取粉末約1.0 g，精密稱定，置于錐形瓶中，加入石油醚(60～90 ℃)50 mL，超聲處理30 min，冷卻，石油醚(60～90 ℃)補足減失的質(zhì)量，濾過，量取續(xù)濾液(新疆紫草10 mL、黃花軟紫草30 mL)，蒸干，殘渣加乙腈溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，乙腈定容至刻度，搖勻，即得。

2.3 色譜條件 參考文獻[17]報道，Agilent-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈-0.05%甲酸(70∶30)；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長275 nm；進樣量10 μL。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取新疆紫草供試品溶液適量，在“2.3”項色譜條件下進樣測定6次，測得左旋紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、去氧紫草素、異丁酰紫草素、β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧、(2-甲基正丁?；?紫草素峰面積RSD分別為0.35%、0.22%、0.53%、1.70%、0.28%、0.45%、0.24%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取新疆紫草供試品溶液適量，于0、2、4、6、8、10、12、24 h 在“2.3”項色譜條件下進樣測定，測得左旋紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、去氧紫草素、異丁酰紫草素、β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧、(2-甲基正丁?；?紫草素峰面積RSD分別為1.52%、0.45%、1.27%、1.84%、0.70%、1.12%、0.48%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復性試驗 精密稱取新疆紫草粉末6份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項色譜條件下進樣測定，測得左旋紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、去氧紫草素、異丁酰紫草素、β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧、(2-甲基正丁?；?紫草素含量RSD分別為1.67%、1.99%、1.84%、1.02%、2.05%、1.92%、2.07%，表明該方法重復性良好。

2.5 HPLC指紋圖譜建立

2.5.1 共有峰確認 36批樣品按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項色譜條件下進樣測定，將所得色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012A版)進行峰匹配，見圖1～2，共發(fā)現(xiàn)19個色譜峰，其中共有峰5個，即F-10、F-11、F-14、F-18、F-19；18批新疆紫草共有7個共有峰，即F-6、F-10、F-11、F-14、F-16、F-18、F-19；18批黃花軟紫草有6個共有峰，即F-10、F-11、F-12、F-14、F-18、F-19，由于各批樣品均含有2-甲基正丁?；?，而且含量高，分離效果好，故選擇其作為參照，測得相對保留時間RSD為0～0.79%，相對峰面積RSD為0～96.41%。

2.5.2 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012A版)》進行相似度評價，結(jié)果見表2。由此可知，新疆紫草除Ae-5、Ae-6相似度低于0.7外，其余16批均高于0.9；黃花軟紫草除Ag-9、Ag-13相似度低于0.8外，其余16批均高于0.8；黃花軟紫草、新疆紫草之間的相似度降低。

表2 36批樣品相似度

2.6 聚類分析 將19個色譜峰峰面積導入Mataboanalyst進行聚類分析，結(jié)果見圖3。由此可知，距離設定為15時，36批樣品可聚為2類，2個品種之間有交叉現(xiàn)象，F(xiàn)-6、F-11、F-13、F-16、F-18、F-19在第1類樣品中較低，而在第2類樣品中較高；距離設定為10時，36批樣品可分為4類，2個品種之間無交叉現(xiàn)象，其中第1類又可分為Ⅰ類(Ae-2、Ae-3、Ae-5、Ae-6、Ae-14、Ae-16、Ae-18)和Ⅱ類(Ag-2、Ag-3、Ag-4、Ag-6、Ag-7、Ag-8、Ag-10、Ag-11、Ag-12、Ag-13、Ag-14、Ag-15、Ag-16、Ag-17)，F(xiàn)-6、F-11、F-13、F-16、F-18、F-19在Ⅰ類樣品中峰面積較低，而在Ⅱ類樣品中幾乎未出現(xiàn)，并且Ⅱ類樣品中F-12峰面積較大，但Ⅰ類樣品中不含該色譜峰，而第2類又可分為Ⅲ類(剩余11批新疆紫草)、Ⅳ類(剩余4批黃花軟紫草)，其區(qū)別主要是所有色譜峰峰面積在Ⅳ類樣品中均較高，而Ⅲ類樣品中僅F-6、F-11、F-13、F-16、F-18、F-19峰面積較高，與相似度分析結(jié)果基本一致。

2.7 主成分分析(PCA) 圖4顯示，前2個主成分累積貢獻率超過60%，故選擇兩者進行區(qū)分；36批樣品分布比較集中，2個品種之間有重疊部分，表明其HPLC指紋圖譜相似性較高，但大部分樣品分布與種屬一致，并且同一品種分布更集中。

2.8 正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA) 圖5顯示，解釋能力參數(shù)R2X為0.945，R2Y為0.791，預測能力參數(shù)Q2為0.662，表明數(shù)據(jù)擬合效果較好，可用于區(qū)分2個品種。再提取OPLS-DA模型中19個色譜峰峰面積的變量投影重要性(VIP)值，見圖6，可知大于1者有7個，分別為F-16(異丁酰紫草素)、F-18(β,β′-二甲基丙烯酰阿卡寧)、F-6(左旋紫草素)、F-19(2-甲基正丁?；喜菟?、F-12、F-11(乙酰紫草素)、F-1，可作為差異標志物。

3 討論

結(jié)果顯示，新疆紫草、黃花軟紫草并非完全按照種屬歸類，而是均有重合部分，其原因為兩者均為軟紫草屬植物，親緣關(guān)系較近，并且均被2020年版《中國藥典》收錄，但新疆地域廣闊，前者在大多生長于海拔2 000～4 200 m的山地向陽坡、礫石山坡、洪積扇、草地等處，而后者大多分布在前山荒漠、礫石質(zhì)山坡、戈壁等處，生境差異較大，同一品種不同產(chǎn)地亦然。另外，藥材中化學成分的積累除了受生境、種類的影響外，也與生長年限相關(guān)，但本實驗中的新疆紫草、黃花軟紫草均為野外采集，不能確定其生長年限。

野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，新疆紫草根發(fā)達，栓化較明顯，色深，特異性氣味明顯；黃花軟紫草主根明顯，但不夠發(fā)達，木栓層較薄，黃白色木部所占比例較大，特異性氣味弱，兩者性狀存在明顯差異，導致新疆藥農(nóng)并未采集收購黃花軟紫草。因此，要想解決紫草野生資源短缺的問題，就應加大對其人工種植的研究，并制定政策，鼓勵新疆紫草人工栽培。