王虎平， 米彩云， 周 君， 李明成

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

阿爾茨海默病是神經(jīng)系統(tǒng)常見的一種退行性疾病，臨床表現(xiàn)為漸進性認知障礙、記憶力損害、語言障礙等神經(jīng)精神癥狀[1]。據(jù)《2019年全球衛(wèi)生估計報告》統(tǒng)計，全世界約有5 000萬人患有阿爾茨海默病，給患者、家庭和社會造成沉重的經(jīng)濟負擔(dān)和精神壓力。

阿爾茨海默病的發(fā)病機制復(fù)雜，尚未完全闡明。β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)沉積和Tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)是其2個重要病理特征[2]。盡管在過去20年中對靶向Aβ進行了廣泛的研究，但未能證明其在治療阿爾茨海默病方面的有效性[3-4]，而Tau蛋白在多種神經(jīng)退行性疾病中被證明具有廣泛的作用[5-7]，是治療阿爾茨海默病有前途的候選靶點。因此，本實驗探討黑逍遙散通過調(diào)控蛋白質(zhì)磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)/糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)信號通路抑制Tau蛋白過磷酸化，以期為臨床應(yīng)用黑逍遙散防治阿爾茨海默病提供實驗支撐。

1 材料

1.1 動物 SPF級4月齡健康雄性Wistar大鼠110只，體質(zhì)量(250±50)g，購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(甘)2015-0005。大鼠飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物實驗中心，實驗動物使用許可證號SYXK(甘)2015-0005，飼養(yǎng)環(huán)境為溫度(23±2)℃，相對濕度40%～60%，光照時間7：00～19：00，自由飲水，正常喂養(yǎng)，實驗經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審查通過(編號2020-034)。

1.2 藥物 黑逍遙散(熟地15 g、柴胡10 g、當(dāng)歸10 g、白芍10 g、白術(shù)10 g、茯苓10 g、生姜10 g、炙甘草8 g、薄荷2 g)，飲片購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門診，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)安耀榮教授鑒定為正品。依據(jù)2015年版《中國藥典》和《醫(yī)略六書·女科指要》指導(dǎo)，熟地、柴胡、當(dāng)歸、白芍、茯苓、白術(shù)、生姜、甘草、薄荷按7.5∶5∶5∶5∶5∶5∶5∶4∶1的比例稱取藥物，加入10倍量冷水浸泡30 min，武火煮沸，文火慢熬1 h，薄荷后下煎煮5 min，攪拌后趁熱過濾藥液，將剩余藥渣再加6倍量水煎煮30 min，過濾后合并2次藥液，濃縮至生藥量為2.0 g/mL的黑逍遙散水煎劑，4 ℃保存?zhèn)溆?。鹽酸多奈哌齊(5 mg×7片/板，2板/盒，國藥準字H20183417)，購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門診，于研缽中研為粉末，充分溶解于蒸餾水中，配制成0.005 mg/mL溶液。

1.3 試劑與儀器 Aβ1-42(上海強耀生物科技有限公司，批號04010011827)；高爾基染液套裝(武漢賽維爾生物科技有限公司，批號G1069)；Tau、PP2A、GSK-3β酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)試劑盒(上海茁彩生物科技有限公司，批號YY56922、YY98455、YY69712)。Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司，型號MT-200)；酶標儀(美國賽默飛公司，型號Multiskan Mk3)；正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司，型號Eclipse E100)；振動切片機(德國徠卡公司)。

2 方法

2.1 模型建立 參照《大鼠腦立體定位圖譜》，在大鼠左右海馬CA1區(qū)各注入1 μL Aβ1-42溶液復(fù)制阿爾茨海默病大鼠模型；假手術(shù)組大鼠同位點注射等量生理鹽水。

2.2 分組及給藥 110只大鼠隨機選取12只作為空白組；12只作為假手術(shù)組，雙側(cè)海馬注射1 μL生理鹽水；其余86只作為造模組，雙側(cè)海馬注射1 μL Aβ1-42溶液復(fù)制模型。選取造模成功的大鼠60只，隨機分為模型組，黑逍遙散低、中、高劑量組，鹽酸多奈哌齊組。黑逍遙散低、中、高劑量組根據(jù)人和大鼠體表面積折算的等效劑量比值換算，灌胃給予4.25、8.5、17 g/kg藥物；鹽酸多奈哌齊組灌胃給予0.5 mg/kg藥物；空白組和假手術(shù)組灌胃給予等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)42 d。

2.3 Morris水迷宮行為學(xué)實驗 平臺隨機放置在一個象限的中央，將大鼠頭朝池壁隨機放入東、西、南、北4個起始位置之一，記錄大鼠找到水下平臺的時間，如果尋找時間超過60 s，則引導(dǎo)大鼠到平臺，使其在平臺上停留20 s。每只大鼠每天訓(xùn)練4次，2次訓(xùn)練之間間隔15～20 min，連續(xù)訓(xùn)練5 d。最后1次定位航行訓(xùn)練結(jié)束后的第2天，將平臺撤除，開始60 s的探索訓(xùn)練，即將大鼠由原先平臺象限的對側(cè)放入水中，記錄大鼠進入目標象限所花的時間和穿越平臺的次數(shù)，以此作為空間記憶的評價指標。

2.4 高爾基染色觀察海馬CA1區(qū)中樹突棘數(shù)量和形態(tài)結(jié)構(gòu)變化 將海馬組織分別放入配置好的高爾基染色試劑盒固定液(A液)中固定0.5～4 h，用徠卡振動切片機將腦片切至150 μm，各組選取海馬結(jié)構(gòu)清晰且質(zhì)量好的第3～7張腦片作為觀察對象，之后置于浸漬液(B液)浸泡2～3 d，轉(zhuǎn)移到染色液(C液)中不超過1 min，顯色液(D液)顯色，30 s內(nèi)明膠封片，顯微鏡下觀察分析神經(jīng)元情況，其中每10 μm樹突棘的個數(shù)記作樹突棘密度。

2.5 ELISA法檢測大鼠血清及海馬中Tau、PP2A、GSK-3β水平 取大鼠血清及海馬組織，按照相應(yīng)ELISA試劑盒說明書進行檢測，用酶標儀在450 nm波長測定各孔的光密度(OD)值，根據(jù)標準曲線計算各組大鼠血清及海馬中Tau、PP2A、GSK-3β水平。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況 空白組大鼠正常喂養(yǎng)，反應(yīng)靈敏，進食正常；造模72 h后，假手術(shù)及造模大鼠活動與攝食量明顯減少，精神萎靡，毛色黯淡，共死亡3只；分組給藥1周后，鹽酸多奈哌齊組死亡2只，逍遙散高劑量組死亡4只，中劑量組死亡3只，低劑量組死亡2只，假手術(shù)組死亡3只，模型組死亡4只。

3.2 黑逍遙散對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 與空白組比較，假手術(shù)組大鼠第5天逃避潛伏期均延長(P<0.01)，大鼠游泳總路程、目標象限滯留時間百分比無明顯變化(P>0.05)；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠第5天逃避潛伏期延長(P<0.01)，游泳總路程增加(P<0.01)，目標象限停留時間百分比降低(P<0.01)；與模型組比較，鹽酸多奈哌齊組及黑逍遙散高、中劑量組大鼠第5天逃避潛伏期縮短(P<0.01)，游泳總路程減少(P<0.01)，目標象限停留時間百分比提高(P<0.01)，而黑逍遙散低劑量組均無明顯變化(P>0.05)，見表1～2。

表1 黑逍遙散對大鼠定位航行能力的影響

表2 黑逍遙散對大鼠空間探索能力的影響

3.3 黑逍遙散對大鼠海馬CA1區(qū)中樹突棘數(shù)量和形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 與空白組比較，假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘密度減少(P<0.01)，樹突分支數(shù)量無明顯變化(P>0.05)；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘密度和樹突分支數(shù)量減少(P<0.01)；與模型組比較，鹽酸多奈哌齊組和黑逍遙散各劑量組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘密度和樹突分支數(shù)量均增加(P<0.05，P<0.01)，見圖1～2、表3。

表3 黑逍遙散對大鼠海馬CA1區(qū)樹突棘密度及樹突分支的影響

3.4 黑逍遙散對大鼠血清及海馬Tau、PP2A、GSK-3β水平的影響 與空白組比較，假手術(shù)組大鼠海馬中Tau水平升高(P<0.01)，血清及海馬中PP2A、GSK-3β水平未見明顯變化(P>0.05)；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清及海馬中Tau、GSK-3β水平升高(P<0.01)，PP2A水平降低(P<0.01)；與模型組比較，鹽酸多奈哌齊組及黑逍遙散高、中劑量組大鼠血清及海馬中Tau、GSK-3β水平降低(P<0.01)，PP2A水平升高(P<0.05，P<0.01)，黑逍遙散低劑量組血清中Tau、GSK-3β水平降低(P<0.01)，PP2A水平升高(P<0.01)，海馬中Tau水平降低(P<0.01)，見表4。

表4 黑逍遙散對大鼠血清及海馬中Tau、PP2A、GSK-3β水平的影響

4 討論

阿爾茨海默病屬中醫(yī)“呆病”“癡呆”等范疇，認為其病位在腦，與腎虛密切相關(guān)，總屬本虛標實，本虛者人老體弱，五臟虛衰，精血不足，腦竅失養(yǎng)；標實者氣滯血瘀，痰濕阻滯，蒙閉清竅，故治療該病基本以補腎為主，課題組在此基礎(chǔ)上進一步提出了從“肝脾腎三臟并調(diào)”防治阿爾茨海默病的思路。黑逍遙散出自《醫(yī)略六書·女科指要》，由逍遙散加熟地而成，全方補腎填精，健脾促運，疏肝養(yǎng)血，精血并補，氣血同調(diào)，補瀉兼施，可針對肝、脾、腎三臟防治癡呆，其療效在課題組前期研究中已被證實[8-10]。

細胞內(nèi)的神經(jīng)纖維纏結(jié)是阿爾茨海默病的重要病理特征，主要是由過度磷酸化的微管相關(guān)蛋白Tau聚集成的雙螺旋細絲結(jié)構(gòu)[11]，具體分子機制還不清楚，目前認為由于蛋白磷酸酶與蛋白激酶的調(diào)節(jié)失衡直接導(dǎo)致了Tau的過度磷酸化[12]。因此，PP2A和GSK-3β作為重要的磷酸酶和激酶，兩者活性的平衡是描述Tau去磷酸化/磷酸化狀態(tài)的關(guān)鍵因素[13-14]。研究表明，在阿爾茨海默病患者腦內(nèi)，與Tau蛋白脫磷酸化相關(guān)的所有絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酯酶中，PP2A的活性比例約占70%，且PP2A活性顯著降低[15-16]；GSK-3β在患者腦組織中多處都有大量的集聚，包括老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)氈細絲、螺旋體等[17-18]，能夠直接磷酸化Tau蛋白的絲氨酸/蘇氨酸位點，加速神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成[19]。有研究報道，激活小鼠腦內(nèi)或者體外培養(yǎng)的細胞內(nèi)GSK-3β，可顯著誘導(dǎo)Tau蛋白多個位點的過度磷酸化[20]。這些研究表明，細胞內(nèi)的神經(jīng)纖維纏結(jié)與PP2A活性降低和GSK-3β的高水平存在密切相關(guān)[21-22]。因此，PP2A和GSK-3β可能參與促進Tau在阿爾茨海默病患者大腦中的聚集。

本研究發(fā)現(xiàn)，黑逍遙散干預(yù)后，阿爾茨海默病模型大鼠學(xué)習(xí)能力和記憶障礙得到改善，軸突棘數(shù)量增加，血清及海馬PP2A水平升高，GSK-3β、Tau水平降低，并以高劑量組最為顯著，說明黑逍遙散可能通過調(diào)節(jié)阿爾茨海默病大鼠體內(nèi)PP2A、GSK-3β水平，減少Tau過度磷酸化，進而改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，發(fā)揮抗阿爾茨海默病的作用。此外，與空白組比較，假手術(shù)組大鼠第5天逃避潛伏期延長，海馬CA1區(qū)樹突棘密度減少，海馬中Tau水平升高，其他指標未見明顯變化，提示手術(shù)創(chuàng)傷對大鼠認知能力和神經(jīng)元的改變會產(chǎn)生一定影響，但還需要確切證據(jù)來證明。