王春美，朱 平，祁文靜，任艷嬌，盛光耀，盧 潔

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒童醫(yī)院 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室 鄭州 450001

神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma,NB)是來源于腎上腺髓質(zhì)或椎旁交感神經(jīng)節(jié)的未成熟胚胎性腫瘤，是最常見的兒童顱外實(shí)體腫瘤，占兒童期腫瘤死亡總數(shù)的15%；該病惡性程度高，總體預(yù)后差，尤其是3期和4期患兒，長期生存率<30%[1]，新的治療策略亟待發(fā)現(xiàn)。近年來，越來越多的人認(rèn)識到植物性化學(xué)物質(zhì)的重要性?；⒄溶帐菑闹兴幓⒄鹊母稍锔o中提取的單體，具有抑制血小板聚集、降血脂、擴(kuò)張血管、抗休克、肝臟保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)、肺臟保護(hù)、抗感染、免疫調(diào)節(jié)等作用[2-6]。近年研究[7-11]發(fā)現(xiàn)，虎杖苷亦有抗腫瘤作用，但關(guān)于其與NB的研究報道少見。本研究以NB細(xì)胞株SH-SY5Y為研究對象，基于PI3K/AKT/mTOR信號通路探討虎杖苷對NB細(xì)胞增殖及凋亡影響的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器SH-SY5Y細(xì)胞株(中科院上海細(xì)胞研究所)，虎杖苷(北京Solarbio公司)溶解于DMSO中，稀釋至10 mmol/L，4 ℃儲存，實(shí)驗(yàn)過程中根據(jù)需要稀釋至不同濃度。DMEM培養(yǎng)基(美國Corning公司)，胎牛血清(美國Invitrogen公司)，DMSO(上海索寶生物科技有限公司)，兔抗人PI3K、AKT、p70 S6K、p-p70 S6K和鼠抗人p-AKT、mTOR、p-mTOR、GAPDH抗體(美國Abcam公司)，山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗鼠IgG-HRP抗體、CCK-8試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)，Annexin V-FITC凋亡檢測試劑、細(xì)胞周期檢測試劑盒(美國BD公司)。CO2培養(yǎng)箱(德國GMBH公司)，酶標(biāo)儀(美國Bio-Tech Instruments公司)，流式細(xì)胞儀(美國Beckmen-Coulter公司)，離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，POWER/RAC 200半干式電轉(zhuǎn)移槽(美國Bio-Rad公司)。

1.2 SH-SY5Y細(xì)胞的培養(yǎng)用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、0.05 mmol/L 2-巰基乙醇、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 SH-SY5Y細(xì)胞增殖的CCK-8法檢測在96孔板中接種SH-SY5Y細(xì)胞懸液(100 μL/孔)，100 μL約含4 000個細(xì)胞。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的虎杖苷(0.00、1.90、3.90、7.81、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00、1 000.00 μmol/L)處理24、48和72 h，每組設(shè)置5個平行復(fù)孔；每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育4 h后，酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的吸光值(A)。細(xì)胞增殖活力=[(A加藥-A空白)/(A0加藥-A空白)]×100%(A加藥：細(xì)胞、CCK-8溶液和藥物；A空白：培養(yǎng)基和CCK-8溶液；A0加藥：細(xì)胞和CCK-8溶液)。

1.4 SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的雙染法檢測將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板中過夜孵育，設(shè)立空白對照組和虎杖苷(1 120.00 μmol/L)組，每組設(shè)3個平行復(fù)孔，72 h后PBS洗滌孔板中細(xì)胞1次，棄去上清，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞，完全培養(yǎng)基終止消化，1 300 r/min離心3 min，棄去上清；PBS洗滌細(xì)胞沉淀1次，1 300 r/min離心3 min，收集細(xì)胞；1×Binding Buffer 洗滌細(xì)胞沉淀1次，1 500 r/min離心3 min，收集細(xì)胞；200 μL細(xì)胞凋亡緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞懸液終密度為[(1～10)×106個]/mL，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，染色15 min；加入800 μL細(xì)胞凋亡緩沖液重懸細(xì)胞，混勻后上流式細(xì)胞儀檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 SH-SY5Y細(xì)胞周期的流式細(xì)胞儀檢測離心收集空白對照組和虎杖苷處理72 h的細(xì)胞，4 ℃預(yù)冷PBS洗滌1次，1 500 r/min離心5 min，棄上清；加入4 ℃預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)70%乙醇1 mL固定過夜；次日1 500 r/min離心5 min，棄去固定液，加入0.5 mL的PBS重懸細(xì)胞；依次加入RNaseA(終質(zhì)量濃度50 mg/L)、500 μL PI(100 mg/L)，避光孵育30 min；上流式細(xì)胞儀檢測，CellQuest軟件檢測G0/G1、S和G2/M期的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 SH-SY5Y細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR/p70 S6K信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的Western blot檢測離心收集空白對照組和虎杖苷處理72 h的細(xì)胞，冰上靜置30 min以充分裂解，12 000 r/min離心5 min，迅速將上清(蛋白提取液)轉(zhuǎn)移至預(yù)冷新EP管中，即為細(xì)胞總蛋白。Bradford法測定蛋白濃度。蛋白樣本經(jīng)100 g/L的SDS-PAGE電泳分離，半干轉(zhuǎn)至PVDF膜上，含50 g/L脫脂奶粉的TBST溶液4 ℃封閉過夜。一抗(PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p70 S6K、p-p70 S6K、GAPDH抗體，其中p-p70 S6K按1∶500稀釋，PI3K、p-AKT、p-mTOR按1∶1 000稀釋，p70 S6K按1∶2 000稀釋，AKT、mTOR、GAPDH按1∶3 000稀釋) 室溫孵育2 h，TBST洗滌10 min×3次，TBS洗滌10 min×1次，相應(yīng)的二抗(按1∶3 000稀釋) 室溫孵育2 h，TBST洗滌10 min×3次，TBS洗滌10 min×1次，ECL發(fā)光液處理后暗室內(nèi)曝光，膠片于室溫下自然風(fēng)干，掃描儀掃描結(jié)果保存，Image J軟件分析灰度值結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本研究中所有數(shù)據(jù)分布符合正態(tài)性且方差齊，應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較2組間細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR/p70 S6K信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的差異，應(yīng)用多元方差分析比較2組間細(xì)胞周期(G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞比例)的整體差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 虎杖苷對SH-SY5Y細(xì)胞增殖的影響用不同濃度的虎杖苷分別處理SH-SY5Y細(xì)胞24、48和72 h后，結(jié)果顯示，在72 h時，虎杖苷對SH-SY5Y細(xì)胞有抑制作用，其IC50約為1 120.00 μmol/L。因此選擇該濃度的虎杖苷處理SH-SY5Y細(xì)胞72 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 虎杖苷對SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響虎杖苷處理SH-SY5Y細(xì)胞72 h后，細(xì)胞凋亡率為[(8.83±0.75)%]，高于空白對照組[(4.28±0.73)%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.710，P<0.001)。

2.3 虎杖苷對SH-SY5Y細(xì)胞周期的影響結(jié)果見表1。由表1可知，虎杖苷處理SH-SY5Y細(xì)胞72 h后，細(xì)胞周期分布與空白對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006)?；⒄溶战MS期細(xì)胞比例上升，G0/G1期的細(xì)胞比例下降；2組間G2/M期的細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.387)。

表1 2組細(xì)胞周期的比較*(n=3) %

2.4 虎杖苷對SH-SY5Y細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR/p70 S6K信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖1、表2。由表2可知，虎杖苷處理SH-SY5Y細(xì)胞72 h后，細(xì)胞中PI3K、AKT、p-AKT、p-p70 S6K蛋白表達(dá)降低(P均<0.05)，而mTOR、p-mTOR、p70 S6K蛋白的表達(dá)無明顯變化。

圖1 2組細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR/p70 S6K信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

表2 2組細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR/p70 S6K信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的比較(n=3)

3 討論

目前發(fā)現(xiàn)的155種小分子抗癌藥物中，47%是天然植物或者它們的衍生物[12]，因此植物性化學(xué)物質(zhì)被認(rèn)為是具有廣泛前景的抗癌藥物的重要來源。植物來源的紫杉醇、長春新堿、喜樹堿等早已廣泛應(yīng)用于臨床[13]，而冬凌草甲素、姜黃素、黃連素等也已被證實(shí)體外具有抗腫瘤作用[14-15]?；⒄溶帐菑幕⒄戎刑崛〕鰜淼木哂卸喾N生物活性的物質(zhì)，具有廣泛的抗腫瘤作用，可有效抑制乳腺癌、肝癌、宮頸癌、肺癌、白血病等細(xì)胞株的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7-11]，但有關(guān)其與NB的研究報道少見。

本研究結(jié)果顯示，虎杖苷處理72 h后可顯著抑制SH-SY5Y細(xì)胞的增殖，IC50為1 120.00 μmol/L，提示虎杖苷需要在高濃度的環(huán)境中才能發(fā)揮其對SH-SY5Y細(xì)胞增殖的抑制作用。既往研究[16]結(jié)果表明，白藜蘆醇在500～1 000 μmol/L濃度范圍內(nèi)可抑制SH-SY5Y細(xì)胞增殖；而虎杖苷是白藜蘆醇和葡萄糖結(jié)合的產(chǎn)物，二者在體內(nèi)可以相互轉(zhuǎn)化，與白藜蘆醇相比，虎杖苷更容易被吸收、更能耐受酶的氧化作用、可溶于熱水、可通過主動轉(zhuǎn)運(yùn)的方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，因此具有比白藜蘆醇更高的生物活性。但本實(shí)驗(yàn)得到的IC50結(jié)果提示，對于SH-SY5Y細(xì)胞而言，虎杖苷并未表現(xiàn)出比白藜蘆醇更強(qiáng)的活性，其原因有待于進(jìn)一步探討。

使用1 120.00 μmol/L的虎杖苷處理SH-SY5Y細(xì)胞72 h后，細(xì)胞凋亡率升高，同時細(xì)胞周期出現(xiàn)S期阻滯，G0/G1期的細(xì)胞比例下降，提示虎杖苷可能是通過阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。

PI3K/AKT/mTOR是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、生長、分化及凋亡等多個環(huán)節(jié)，影響多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸，并且與腫瘤細(xì)胞的耐藥相關(guān)[17]，針對該信號通路相關(guān)分子的靶向藥物研究是近年研究的熱點(diǎn)。既往研究[18-20]表明，NB細(xì)胞中存在PI3K/AKT/mTOR信號通路的異?；罨菍?dǎo)致該腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一。本研究結(jié)果顯示，使用1 120.00 μmol/L的虎杖苷處理SH-SY5Y細(xì)胞72 h后，PI3K、AKT、p-AKT、p-p70 S6K蛋白表達(dá)降低，而mTOR、p-mTOR蛋白的表達(dá)無明顯變化，提示PI3K/AKT信號通路的抑制可能是虎杖苷抑制SH-SY5Y細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。但本研究結(jié)果不支持虎杖苷通過抑制mTOR蛋白的表達(dá)而影響p-p70 S6K蛋白表達(dá)，具體機(jī)制我們將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探討。

綜上，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了虎杖苷能夠在體外抑制NB細(xì)胞的增殖、阻滯細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路而實(shí)現(xiàn)。在此基礎(chǔ)上，之后擬進(jìn)一步研究虎杖苷引起PI3K/AKT磷酸化水平降低的分子靶點(diǎn)，以及其抑制NB細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的其他可能機(jī)制。