郭依琳，林鈺博，白洋洋，趙 虎，王武亮

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450014 2)桂林醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系 廣西桂林 541199 3)河南省中醫(yī)院泌尿外科 鄭州 450002

隨著宮頸癌篩查的逐步開(kāi)展及HPV疫苗的普及，更多的早期宮頸癌被發(fā)現(xiàn)，然而仍有部分宮頸癌患者在首診時(shí)便被確診為晚期，晚期轉(zhuǎn)移性及復(fù)發(fā)性宮頸癌預(yù)后差，患者生活質(zhì)量低[1-2]。尋找新的、有效的治療方案是目前臨床需要解決的問(wèn)題。近年來(lái)，針對(duì)程序性死亡受體-1(programmed cell death-1，PD-1)及其配體的免疫檢查點(diǎn)抑制劑開(kāi)始應(yīng)用于晚期轉(zhuǎn)移性及復(fù)發(fā)性腫瘤，然而由于腫瘤免疫微環(huán)境的差異，不同患者免疫治療效果差別較大[3-4]。

N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)是腺嘌呤第六位氮原子受甲基轉(zhuǎn)移酶催化作用形成的甲基化修飾[5]，受甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基酶和m6A讀取蛋白三類(lèi)相關(guān)分子的可逆調(diào)控[6]。m6A修飾已被證實(shí)參與多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[7]。有研究[8]發(fā)現(xiàn)，甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3可以通過(guò)靶向HK2，招募m6A讀取蛋白YTHDF1，穩(wěn)定其表達(dá)，從而促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，LncRNA)由200多個(gè)通常不編碼蛋白質(zhì)的核苷酸組成，參與轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后修飾、染色體重構(gòu)、表觀遺傳調(diào)節(jié)等生物過(guò)程[9]，同樣受到m6A修飾的調(diào)控。有研究[10]發(fā)現(xiàn)LncRNA GAS5-AS1可以與去甲基酶ALKBH5結(jié)合，減少GAS5的m6A修飾，抑制宮頸癌的增殖和侵襲。然而，與m6A相關(guān)的LncRNA(m6A-LncRNA)在宮頸癌中的作用機(jī)制仍不明確。本研究利用癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)，建立基于m6A-LncRNA的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，構(gòu)建宮頸癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型，以期為宮頸癌的預(yù)后和免疫治療反應(yīng)評(píng)估提供參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://cancergenome.nih.gov/)下載304例宮頸癌病例的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床資料，下載時(shí)間為2021年11月29日。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：有完整的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)，有完整的生存時(shí)間數(shù)據(jù)。排除重復(fù)數(shù)據(jù)。使用R(v4.1.2)中的Create Data Partition函數(shù)從304例中隨機(jī)抽取184例作為驗(yàn)證集。

1.2 m6A-LncRNA的篩選選擇25個(gè)公認(rèn)的m6A調(diào)節(jié)因子，包括8個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶(METTL3、METTL5、METTL14、METTL16、WTAP、ZC3H13、RBM15、RBM15B)，14個(gè)讀取蛋白(YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、HNRNPC、FMR1、LRPPRC、HNRNPA2B1、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、ELAVL1、RBMX)和3個(gè)去甲基酶(FTO、ALKBH5、ALKBH3)。利用人類(lèi)參考基因組及注釋文件區(qū)分RNA表達(dá)數(shù)據(jù)中的mRNA和LncRNA。對(duì)304個(gè)病例m6A調(diào)節(jié)因子和LncRNA的表達(dá)量進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，參考文獻(xiàn)[11-12]，選擇“相關(guān)系數(shù)>0.35或<-0.35，P<0.05” 的LncRNA為m6A-LncRNA。使用R中的igraph包繪制m6A-LncRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 宮頸癌預(yù)后相關(guān)m6A-LncRNA的篩選以304例為數(shù)據(jù)集，利用R中的survival包，以篩選出的m6A-LncRNA表達(dá)水平作為自變量，以死亡為終點(diǎn)事件，通過(guò)Cox回歸分析，篩選出與宮頸癌總生存密切相關(guān)的m6A-LncRNA。

1.4 基于m6A-LncRNA的宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的建立以304例為數(shù)據(jù)集，以篩選出的m6A-LncRNA表達(dá)水平作為自變量，以死亡為終點(diǎn)事件，通過(guò)LASSO篩選變量，建立Cox回歸模型。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=∑LncRNAi的回歸系數(shù)×LncRNAi表達(dá)量。

1.5 基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的宮頸癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建在304例中，篩除臨床信息不完整者，最終納入266例作為建模數(shù)據(jù)集構(gòu)建預(yù)測(cè)模型。以年齡、組織學(xué)分級(jí)、臨床分期和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分作為自變量，以死亡為終點(diǎn)事件，采用Cox回歸篩選影響宮頸癌預(yù)后的影響因素，然后在回歸結(jié)果的基礎(chǔ)上構(gòu)建預(yù)后預(yù)測(cè)模型，繪制宮頸癌1、3和5 a生存率預(yù)測(cè)列線圖。

從驗(yàn)證集的184例中，篩除臨床分期和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)不完整者，最終納入181例用于模型驗(yàn)證。在建模數(shù)據(jù)集和驗(yàn)證集中，分別通過(guò)C指數(shù)、ROC曲線和校準(zhǔn)曲線對(duì)列線圖的判別和校準(zhǔn)能力進(jìn)行評(píng)估。為了縮小偏差，上述分析均經(jīng)Bootstrap法重復(fù)進(jìn)行1 000次。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

1.6 腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞和免疫表觀評(píng)分(immunopheno score，IPS)分析采用CIBERSORT反卷積算法對(duì)304例病例中的22種腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)錄特征進(jìn)行模擬計(jì)算。從癌癥免疫組圖譜(The Cancer Immunome Atlas，TCIA)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://tcia.at/)中下載304例的IPS[13]，下載時(shí)間為2021年12月8日。以風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)作為界值，將304例分為高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)組，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組免疫細(xì)胞比例和IPS的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌病例一般資料304例宮頸癌病例和184例驗(yàn)證集病例的一般資料見(jiàn)表1。兩個(gè)數(shù)據(jù)集的基線特征，如年齡、人種、臨床分期、組織學(xué)分級(jí)等，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 宮頸癌病例一般特征 例

2.2 預(yù)后相關(guān)m6A-LncRNA的篩選在304例宮頸癌病例中，共鑒定出200個(gè)m6A-LncRNA，共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖1。通過(guò)Cox回歸分析，篩選出14個(gè)宮頸癌預(yù)后相關(guān)m6A-LncRNA(表2)。

2.3 基于m6A-LncRNA的宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分經(jīng)過(guò)篩選，最終構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分包含11個(gè)m6A-LncRNA。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=FAM198B-AS1×0.133-AC233728.1×0.136-AL021707.6×0.053-AC131159.1×0.603+DDN-AS1×0.561+AC099850.4×0.002-DDX11-AS1×0.070-U62317.4×0.030+LINC02802×0.322+AC015922.2×0.077-EP300-AS1×0.145，其中LncRNA名稱(chēng)表示該RNA的表達(dá)水平。

2.4 宮頸癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型的建立在建模數(shù)據(jù)集中，經(jīng)過(guò)Cox回歸分析，最終篩選出臨床分期和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是宮頸癌預(yù)后影響因素,基于這2個(gè)變量構(gòu)建預(yù)后預(yù)測(cè)模型(表3)，繪制列線圖(圖2)。

圖1 m6A調(diào)節(jié)因子和LncRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖

表2 通過(guò)Cox回歸分析獲得的14個(gè)宮頸癌預(yù)后相關(guān)m6A-LncRNA

表3 宮頸癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型的Cox回歸結(jié)果

圖2 宮頸癌預(yù)后預(yù)測(cè)的列線圖

2.5 列線圖預(yù)測(cè)效能的評(píng)價(jià)在建模數(shù)據(jù)集中，宮頸癌預(yù)后列線圖的C指數(shù)(95%CI)為0.764(0.759～0.769),Bootstrap法內(nèi)部驗(yàn)證后C指數(shù)為0.753。利用該模型對(duì)1、3和5 a生存預(yù)測(cè)的ROC曲線下面積(95%CI)分別為0.792(0.667～0.918)、0.777(0.686～0.867)和0.755(0.653～0.857)。在驗(yàn)證集中，宮頸癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型的C指數(shù)為(95%CI)為0.775(0.770～0.780),Bootstrap法內(nèi)部驗(yàn)證后C指數(shù)為0.755。利用該模型對(duì)1、3和5 a生存預(yù)測(cè)的ROC曲線下面積(95%CI)分別為0.806(0.682～0.930)、0.817(0.730～0.905)和0.822(0.716～0.927)。在建模數(shù)據(jù)集和驗(yàn)證集中，校正曲線顯示1、3和5 a的預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際結(jié)果相關(guān)性良好(圖3)。

圖3 在建模數(shù)據(jù)集(A、B、C)和驗(yàn)證集(D、E、F)中列線圖預(yù)測(cè)的校準(zhǔn)曲線

2.6 基于m6A-LncRNA的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與免疫微環(huán)境的關(guān)系高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組22種腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞豐度的比較見(jiàn)圖4。低風(fēng)險(xiǎn)組CD8+T細(xì)胞、調(diào)節(jié)T細(xì)胞和未活化的肥大細(xì)胞比例更高，而高風(fēng)險(xiǎn)組中M0巨噬細(xì)胞和活化的肥大細(xì)胞比例更高。低風(fēng)險(xiǎn)組PD-1+CTLA-4-和PD-1+CTLA-4+IPS均高于高風(fēng)險(xiǎn)組(表4)。

圖4 兩組22種腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞豐度的比較

表4 高、低風(fēng)險(xiǎn)組IPS的比較

3 討論

m6A甲基化修飾是最常見(jiàn)的RNA修飾，在腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要作用[7]。對(duì)于LncRNA的m6A修飾已在多種腫瘤，如乳腺癌、胃癌、肝癌等中被發(fā)現(xiàn)與腫瘤進(jìn)展相關(guān)[14]。然而，m6A-LncRNA在宮頸癌中的作用機(jī)制尚不明確。本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載304例宮頸癌病例的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和對(duì)應(yīng)的臨床信息，利用生物信息學(xué)方法，基于m6A-LncRNA建立了宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，利用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與臨床特征構(gòu)建宮頸癌預(yù)后預(yù)測(cè)的列線圖，通過(guò)C指數(shù)、ROC曲線和校準(zhǔn)曲線對(duì)列線圖的判別和校準(zhǔn)能力進(jìn)行評(píng)估；同時(shí)，比較了高低風(fēng)險(xiǎn)組腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞表達(dá)和IPS的差異，以期對(duì)宮頸癌的免疫治療指導(dǎo)提供理論依據(jù)。

本研究從25個(gè)公認(rèn)的m6A調(diào)節(jié)因子中最終篩選出11個(gè)m6A-LncRNA(AM198B-AS1、AC233728.1、AL021707.6、AC131159.1、DDN-AS1、AC099850.4、DDX11-AS1、U62317.4、LINC02802、AC015922.2、EP300-AS1)用于構(gòu)建宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。Liu等[15]發(fā)現(xiàn)DDN-AS1在宮頸癌中高表達(dá)，DDN-AS1可通過(guò)miR-15a/16-TCF3信號(hào)通路促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。Ye等[16]發(fā)現(xiàn)LINC02802是免疫相關(guān)LncRNA，可以用作宮頸癌預(yù)后標(biāo)志物，并為免疫治療選擇提供參考。DDX11-AS1在多種惡性腫瘤中異常高表達(dá)，如肝癌、結(jié)直腸癌、骨肉瘤、膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌和胃癌，通過(guò)直接或間接方式調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)揮其致癌作用[17]。U62317.4可能與腫瘤自噬相關(guān)，并被用于乳腺癌和膀胱癌預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的構(gòu)建[18-19]。Zhao等[20]發(fā)現(xiàn)AC099850.4是高級(jí)別漿液性卵巢癌細(xì)胞的核心調(diào)控因子，參與多種調(diào)控機(jī)制。AC015922.2在腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)下調(diào)，低表達(dá)腎透明細(xì)胞癌患者總生存期和無(wú)病生存期均縮短[21]。AL021707.6可能參與自發(fā)中性粒細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)[22]。FAM198B-AS1、AC131159.1、AC233728.1和EP300-AS1是新發(fā)現(xiàn)的LncRNA，未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究利用Cox回歸構(gòu)建了一個(gè)包括臨床分期和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的宮頸癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型并繪制了1、3和5 a生存預(yù)測(cè)的列線圖。在建模數(shù)據(jù)集和驗(yàn)證集中，該列線圖的C指數(shù)經(jīng)Bootstrap法內(nèi)部驗(yàn)證后分別達(dá)0.753和0.755，1、3和5 a生存預(yù)測(cè)的ROC曲線下面積均大于0.7，校準(zhǔn)曲線顯示預(yù)測(cè)的生存率與實(shí)際生存率有著較好的一致性。這表明該列線圖預(yù)測(cè)價(jià)值較高，有助于高危宮頸癌患者的識(shí)別和個(gè)體化治療策略的建立。

宮頸癌的免疫治療發(fā)展迅速，其通過(guò)調(diào)節(jié)并激活人體自身的免疫系統(tǒng)殺滅腫瘤組織[2]。腫瘤免疫微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度與療效相關(guān)，免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度越高，免疫抑制劑治療效果越好[23]。本研究對(duì)基于m6A-LncRNA的宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分高、低風(fēng)險(xiǎn)組22種腫瘤免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)水平進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示低風(fēng)險(xiǎn)組富含CD8+T細(xì)胞、調(diào)節(jié)T細(xì)胞和未活化的肥大細(xì)胞，而高風(fēng)險(xiǎn)組中富含M0巨噬細(xì)胞和活化的肥大細(xì)胞。目前針對(duì)PD-1和CTLA-4的免疫治療藥物已被批準(zhǔn)用于治療不同類(lèi)型的腫瘤。本研究還發(fā)現(xiàn)低風(fēng)險(xiǎn)組PD-1+CTLA-4-和PD-1+CTLA-4+IPS均高于高風(fēng)險(xiǎn)組。上述結(jié)果提示低風(fēng)險(xiǎn)患者具有更高的免疫原性，其腫瘤免疫微環(huán)境為免疫炎癥型，又稱(chēng)為“熱腫瘤”，可能對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療更敏感，預(yù)后更好。

本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取國(guó)外的病例數(shù)據(jù)構(gòu)建模型，該模型是否適用于中國(guó)人，還有待進(jìn)一步的深入研究。另外，部分所篩選的LncRNA尚未在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)層面得到驗(yàn)證。盡管存在一定的不足，但本研究基于11個(gè)m6A-LncRNA建立的宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和宮頸癌預(yù)后預(yù)測(cè)列線圖可為宮頸癌預(yù)后和免疫治療反應(yīng)評(píng)估提供參考。